La ricerca del parassita nei campioni biologici prelevati dagli ospiti può essere eseguita secondo metodiche dirette ed indirette.
a) Tecniche dirette
Si basano sull'identificazione del parassita attraverso la ricerca microscopica, l'isolamento in vivo, l'isolamento in vitro, le tecniche molecolari di amplificazione del DNA.
Esame coprologico
Si esegue a partire da campioni di feci di gatti, o altri felini, infetti mediante la tecnica di flottazione con soluzione satura di NaCl e ZnSO4 al 33% o la tecnica di sedimentazione con acido acetico ed etere di Telemann, per evidenziare la presenza delle oocisti . Questa tecnica non ha grande significato diagnostico considerando il breve periodo di patenza della toxoplasmosi e la difficoltà di fare diagnosi differenziale morfologica con le oocisti di altri coccidi come Besnoitia sp. e Hammondia hammondi (Piergili Fioretti, 2010).
Figura 1.9 (A) oocisti non sporulata di I. felis; (B) I. rivolta; ( C) T. gondii comparate con sporocisti sporulate di Sarcocystis muris (D). Tutti i coccidi dei felini, ad eccezione di Sarcocystis, sono emesse in ambiente esterno non sporulate. ( Dubey JP. Toxoplasmosis of Animal and Humans. 2010, Boca Raton: CRC press.)
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Isolamento in vivo o in vitro
T. gondii può essere coltivato in animali da laboratorio, embrioni di pollo, colture cellulari. Per
l'isolamento in vivo sono suscettibili topi, criceti, cavie e conigli. Vengono generalmente usati come ospiti i topi perchè sono più sensibili e non naturalmente infetti se nati e cresciuti in laboratorio in condizioni controllate, e l'inoculazione viene fatta a livello peritoneale. È un test specifico e sensibile ma lento, necessita di 4-6 settimane (Piergili Fioretti, 2010).
L'isolamento in vitro avviene in colture cellulari, le più utilizzate sono quelle di fibroblasti umani. Questa tecnica, a differenza di quella condotta in vivo, non ha effetti sulla virulenza del parassita. Il metodo è più rapido del precedente (7gg) ma meno sensibile data la possibile perdita di vitalità del protozoo.
Istologia
Consiste nel prelevare campioni dai tessuti ed organi target (milza, fegato, linfonodi, polmoni, pancreas, SNC) e sottoporli a fissazione, disidratazione, inclusione, colorazione ematossilina-eosina. I campioni possono essere ottenuti mediante prelievo bioptico nei soggetti vivi, oppure possono essere costituiti da sezioni tissutali ricavati durante l'esecuzione dell'esame autoptico sui corpi dei soggetti deceduti. Nelle sezioni tissutali è possibile in tal modo evidenziare la presenza di cisti tissutali e tachizoiti. Tuttavia, il numero di T. gondii isolabili negli individui cronicamente infetti è basso e a differenza dei casi di infezione acuta sono più facilmente identificabili le cisti tissutali invece che i tachizoiti.
Immunofluorescenza e immunoistochimica
Consentono di evidenziare la presenza di tachizoiti e pseudocisti nei campioni bioptici o su campioni di tessuto prelevati durante l'esame anatomopatologico. Si basano entrambe sull'impiego di anticorpi per localizzare gli antigeni del patogeno, ma la prima usando un sistema di rivelazione basato su reazioni chimiche (perossidasi, fosfatasi, ecc..), tramite enzimi coniugati con l'anticorpo, la seconda invece utilizzando per la rivelazione molecole fluorescenti. Nell'immunoistochimica gli anticorpi policlonali di coniglio assicurano risultati migliori rispetto ai monoclonali (Dubey, 2010).
PCR
La PCR è una delle tecniche più sensibili poiché permette di amplificare il DNA di T. gondii a partire da campioni di siero, sangue, liquor e umor acqueo. Trattandosi di una metodica che richiede prelievi invasivi viene utilizzata prevalentemente per evidenziare la presenza del parassita nelle feci degli ospiti definitivi e per la diagnosi differenziale da altri protozoi o in sede di necroscopia (Mancianti et
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al., 2014; Salant et al., 2010).
Sierologia
La sierologia permette di evidenziare la presenza degli antigeni circolanti del protozoo a partire non solo da campioni di siero ma anche di altre matrici biologiche
b) Tecniche indirette
Si basano sull'evidenziazione della risposta immunitaria anticorpale che l'ospite sviluppa nei confronti degli antigeni del patogeno, a seguito dell'infezione. Nell'infezione toxoplasmica, come abbiamo visto precedentemente, le immunoglobuline principalmente coinvolte sono le IgM, IgG, IgA.
(DT) Dye test
È il test di referenza per la diagnosi di toxoplasmosi nell'uomo perchè altamente specifico e sensibile, senza evidenze di falsi negativi nella specie umana. Si tratta di una reazione di neutralizzazione antigene-anticorpo mediata dal complemento. Questa tecnica richiede alto grado di esperienza tecnica per l'esecuzione, è costosa ed anche relativamente pericolosa, dal momento che il siero dell'ospite da esaminare viene messo a reagire con tachizoiti vivi e potenzialmente infettanti. Pertanto, nonostante il DT permetta di quantificare gli anticorpi specifici anti T. gondii anche nel siero di molti altri ospiti, è scarsamente utilizzata.
MAT (test agglutinazione modificata)
Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per la diagnosi di toxoplasmosi negli animali e nell'uomo. Il test rivela una risposta in IgG se il siero viene trattato con 2 mercaptoetanolo, che inattiva le IgM (caratteristiche della fase acuta dell’infezione), ma come tutte le agglutinazioni può presentare il fenomeno di prozona, quindi bisogna eseguire numerose diluizioni di screening. A differenza del precedente è commercialmente disponibile.
IFAT
L'immunofluorescenza indiretta si basa sull'evidenziazione della reazione antigene-anticorpo attraverso l'emissione di fluorescenza, ottenuta marcando uno dei due con fluorocromi (istiocianato di fluoresceina). È utilizzata per la titolazione degli anticorpi specifici o per la ricerca degli antigeni di T. gondii.
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(Questi tre test hanno in comune l'utilizzo dei tachizoiti interi come antigeni)
ELISA
Il test rileva la reazione antigene di T.gondii-anticorpo mediante l'utilizzo di un secondo sistema antigene-anticorpo, legato ad un enzima. L'interazione tra i due sistemi genera una reazione enzimatica che sviluppa una colorazione, la cui quantificazione permette la titolazione degli anticorpi specifici. È un test rapido e semplice da eseguire del quale esistono numerose varianti disponibili.
IHA
Gli antigeni solubili di T. gondii ricoperti di globuli rossi vengono fatti reagire col siero in esame. Se il siero presenta anticorpi specifici, la reazione dà luogo all'agglutinazione dei globuli rossi. La tecnica non è praticamente mai utilizzata, poiché rileva gli anticorpi più tardivamente del test DT, e può non diagnosticare l'infezione acuta.
(ELISA e IHA a differenza delle tecniche precedenti utilizzano anche antigeni endocitoplasmatici).
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