L’angiogenesi è un processo fisiologico che porta alla formazione di nuovi vasi sanguigni sia ex-novo che come diramazioni di vasi preesistenti, costituisce un fattore fondamentale per la crescita e la proliferazione dei tumori solidi.
Come detto precedentemente, il processo di angiogenesi è governato attraverso l’espressione di numerosi fattori proangiogeneci sia intracelluari che extracellulari; tra questi vi rientra la famiglia dei fattori di crescita endoteliale (VEGF). Essi hanno la capacità di interagire in modo diverso con i corrispondenti recettori tirosin chinasici altamente omologhi: VEGFR-1 e VEGFR-2. Sebbene l’azione del VEGFR-1 sia ancora in fase di studio, sembra che esso agisca da “esca” modulando la disponibilità di VEGF per VEGFR-2. [79]
Il recettore di gran lunga più importante è il VEGFR-2 che, interagendo con il VEGF, attiva numerose vie di segnalazione intracellulare che prevedono l’attivazione a valle di vari di fattori mitogeni come: MAPK, PI3K e Akt. Nelle cellule tumorali questo
pathway è risultato essere iperattivato, inoltre, VEGFR-2 risulta fortemente stimolato
dall’aumentata espressione di VEGF.[79, 78]
Una strategia antitumorale, che ha dato degli ottimi risultati negli ultimi anni, è quella di inibire il processo angiogenico, necessario alle cellule tumorali per proliferare e espandersi in altri tessuti. Le molecole attualmente sviluppate agiscono contro il VEGF o contro i suoi recettori; si parla di anticorpi monoclonali come il bevacizumab diretto contro il VEGF extracellulare, oppure di piccole molecole inibitori dei VEGFR che hanno la capacità di competere con l’ATP nel dominio catalitico della tirosina chinasi, che ha portato all’identificazione di diverse classi di inibitori del VEGFR come Semaxanib, Vandenatib, Vatalanib, Axitinib, Pazopanib, Sorafenib. [110]
Il gruppo di ricerca presso cui è stato svolto il presente lavoro di tesi si occupa da diversi anni della sintesi di derivati eterociclici ad attività antiproliferativa. [111] In particolare, sono stati studiati composti che contenevano nella loro struttura un anello
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pirimidinico isolato, o parte di un sistema eterociclico come: pirrolo-pirimidine, pirazolo-pirimidine, furo e tieno-pirimidine, pirimido-pirimidine e pirido-pirimidine, già descritti quali inibitori di VEGFR. [110] Negli ultimi anni, alcuni studi sul sistema delle benzotiopiranopirimidine hanno portato allo sviluppo di nuovi composti dotati di rilevanti proprietà farmacologiche, in particolare la benzotiopiranopirimidina A (figura 21) ha dimostrato avere una buona attività citotossica su linea cellulare leucemica HL- 60. [112]
Sulla base di questi risultati, è stata sintetizzata una serie di composti caratterizzati da un nucleo benzotiopiranopirimidinico di formula generale I (figura 21), sul quale è stata inserita una porzione anilinica in posizione 2. Inoltre, per confermare l’importanza del sostituente NH, presente in molti inibitori descritti in letteratura, sono stati sintetizzate anche i derivati analoghi 2-benzilammino e 2-fenilici.[110]
È stato ipotizzato che il gruppo NH anilinico e gli N1 e N3 della pirimidina fossero i
maggiori responsabili della formazione di legami a H tra la molecola e i residui amminoacidi nel sito catalitico.
Figura 21 [110]
Sono state ottenute così 3 serie di composti 1a-i, 2a-i e 3a-i (tabella 1). [110]
Questi sono stati valutati quali inibitori dell’attività chinasica di VEGFR-2 tramite saggio biochimico e ne sono stati valutati i loro effetti sulla vitalità di cellule endoteliali
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ombelicali (HUVEC) attraverso il test di inibizione della crescita. Inoltre, ne è stata valutata:
• la capacità di interferire con l’angiogenesi in vitro su anelli di aorta di ratto; • l’attività antiproliferativa su linee di cellule tumorali umane;
• la selettività, valutata rispetto a 11 chinasi umane;
• Infine, studi di molecular docking hanno consentito di stabilire come i composti interagivano con il dominio catalitico di VEGFR-2. [110]
La capacità di inibire l’attività chinasica è stata valutata mediante l’utilizzo di un recettore delle chinasi umane ricombinante (KDR) usando semaxanib come standard di riferimento, un inibitore selettivo del VEGFR-1 e 2. Ogni composto è stato utilizzato ad una concentrazione di 7 μM ed è stata registrata l’inibizione percentuale di KDR. I dati ottenuti hanno rivelato che i composti a maggior efficacia erano quelli della serie
2, mentre le serie 1 e 3, recanti rispettivamente un gruppo fenilico e un gruppo
benzilamminico in posizione 2, hanno prodotto scarsa inibizione dell’enzima, confermando l’ipotesi della fondamentale importanza del gruppo NH dell’anilina nell’interazione con il dominio catalitico.[110]
La valutazione dell’inibizione dell’attività fosforilativa di VEGFR-2 su HUVEC ha dimostrato la notevole capacità dei composti 2a-i di indurre citotossicità, in particolare,
2b, 2e e 2i hanno dimostrato possedere una GI50 nell’ordine del submicromolare. In
contrasto, i derivati della serie 1 hanno ottenuto valori nell’ordine del micromolare, e i derivati della serie 3 hanno dimostrato avere un’attività bassa o nulla (tabella 1 [110]). Sono stati eseguiti anche saggi per l’inibizione dell’attività fosforilativa di VEGFR-2 in cellule endoteliali umane e saggi sull’attività antiangiogenica ex-vivo su anelli di aorta di ratto. In più queste molecole hanno dimostrato avere un significativo effetto antiproliferativo in vitro su tre diverse linee cellulari che esprimono differenti chinasi: HeLa (adenocarcinoma della cervice), A-431 (carcinoma epidermoide), MSTO-211H (mesotelioma bifasico). I composti 2b e 2i sono risultati i migliori candidati dai saggi effettuati. [110]
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Tabella 1: Attività antiproliferativa verso HUVEC e attività inibitoria su KDR dei derivati 1a-i, 2a-i, 3a-i, utilizzando semaxanib come riferimento. [110]
Cpd Z X R % KDR IC50(μM) KDR GI50(μM) HUVEC 1a[110] - H H <20 4.0 1b[110] - H OCH 3 31 12 1c[110] - H Cl <20 11.3 1d[110] - OCH 3 H <20 2.9 1e[110] - OCH 3 OCH3 <20 4.8 1f[110] - OCH 3 Cl <20 >20 1g[110] - Cl H <20 2.3 1h[110] - Cl OCH 3 41 4.7 1i[110] - Cl Cl <20 15.3 2a[110] NH H H 54 8.2 2.4 2b[110] NH H OCH 3 67 2.7 0.45 2c[110] NH H Cl <20 >50 7.3 2d[110] NH OCH 3 H 35 >50 4.3 2e[110] NH OCH 3 OCH3 39 17.5 0.74 2f[110] NH OCH 3 Cl <20 >50 >20 2g[110] NH Cl H <20 >50 >20 2h[110] NH Cl OCH 3 <20 >50 16.4
67 2i[110] NH Cl Cl 61 5.6 0.35 3a[110] NHCH 2 H H <20 >20 3b[110] NHCH 2 H OCH3 <20 >20 3c[110] NHCH 2 H Cl <20 12.3 3d[110] NHCH 2 OCH3 H <20 >20 3e[110] NHCH 2 OCH3 OCH3 <20 >20 3f[110] NHCH 2 OCH3 Cl <20 >20 3g[110] NHCH 2 Cl H <20 15.1 3h[110] NHCH 2 Cl OCH3 35 12 3i[110] NHCH 2 Cl Cl <20 17 Semaxanib 40 12.9 13.6
In particolare, sul composto 2b (Z=NH, X=H, R=OCH3) sono stati effettuati studi di
molecular docking che hanno evidenziato che lo scaffold benzotiopirinopirimidinico è
inserito nel sito attivo dell’enzima con l’N in posizione 3 e l’adiacente NH esociclico in 2 che formano due legami a idrogeno con i rispettivi gruppi amminici e carbonilici della Cys919 nella hinge region. Questo spiega perché il composto 2b presenta maggiore affinità alla proteina rispetto ai composti della serie 1 che mancano del gruppo NH esociclico e non danno luogo alla formazione del legame a idrogeno addizionale. In più l’eterociclo lipofilo benziotiopiranopirimidinico si alloggia nella tasca idrofobica dove stabilisce interazioni con Leu1035, Val899, Val916, Val848 e Leu840. L’estensione limitata di questa tasca non permette di ospitare sostituenti ingombranti in posizione 8 del cromoforo senza un riarrangiamento del ligando, e questo potrebbe portare alla perdita del doppio legame a idrogeno. Nel sito di legame la Phe1047 è posta tra l’anello benziotiopiranico e l’anilina in posizione 2, in questo modo riesce a interagire con essi tramite interazioni a trasferimento di carica. Si è anche ipotizzato che la doppia sostituzione in 8 (X) e 4’ (R) con un atomo elettron-attrattore possa aumentare l’intensità dell’interazione prima menzionata e questo spiegherebbe come mai il composto 2i (Z=NH, X=Cl, R=Cl) risulta comunque efficiente come
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inibitore di VEGFR-2. L’anilina risulta parzialmente esposta al solvente e orientata verso l’esterno del sito di legame, questo potrebbe spiegare il motivo per cui la sostituzione con un gruppo più lungo, come il 2-benzilamminico, abbia l’effetto di diminuire l’effetto inibitorio su VEGFR-2. [110]
Alla luce di questi risultati si è reputato necessario indagare più a fondo circa le relazioni struttura attività dei precedenti composti recanti la porzione 2-anilinica variamente sostituita.
Sono stati quindi sintetizzati i composti 4-24 in tabella 2, caratterizzati da una diversa combinazione di sostituenti sull’anello anilinico con struttura generale indicata in figura 22 e selezionando i gruppi da impiegare utilizzando i dati forniti dalla letteratura scientifica a riguardo delle piccole molecole inibitori di tirosina chinasi con struttura anilinica -meta o poli- sostituita. [113]
Figura 22
Anche in questo caso è stata valutata l’attività di 4-24 attraverso le medesime modalità dello studio precedente. Il composto 19 (X=H, R3=OCH3, R4=OCH3, R5=H) è risultato
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VEGFR-2 e un’alta attività antiproliferativa sia su HUVEC che su tre linee cellulari tumorali umane (He-La, A431, MSTO-211H). [113]
Studi di molecular docking e studi di cristallografia a raggi X sul composto 19 (figura 23) hanno chiarito le interazioni stabilite a livello molecolare tra questa classe di composti e il sito catalitico di VEGFR-2.
Per quanto riguarda le interazioni con lo scaffold benzotiopiranoprimidinico si hanno le stesse interazioni viste nello studio precedente, dove l’NH esociclico riveste particolare importanza nel formare legami a H, assieme all’azoto in posizione 3, con i gruppi NH e CO del residuo di Cys 919 nella regione cerniera dell’enzima; le interazioni idrofobiche tra sistema triciclico e tasca idrofobica rimangono sostanzialmente le stesse. Da notare che si hanno interazioni a trasferimento di carica con Phe918 e Phe 1047, inoltre l’anello anilino-arilico è orientato fuori dalla tasca di legame e è stabilizzato da interazioni catione-π con la Lys 838 della catena laterale.
Figura 23 [113]
Il verificarsi di tale interazione spiegherebbe l’influenza che ha la combinazione di sostituenti dell’anilina sull’attività di inibizione del VEGFR, infatti, sostituenti elettron-donatori (OCH3) aumentano il potenziale elettrostatico negativo dell’anello
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aromatico, migliorando l’interazione di trasferimento di carica, e questo spiega l’elevato potenziale di inibizione ottenuto da 4, 19, 20, 23, 24 caratterizzati da uno, due o tre gruppi metossi. Viceversa, sostituenti elettron-attrattori come Cl, F, Br, CF3 vanno
a diminuire il potenziale negativo elettrostatico dell’anello fenilico indebolendo quindi l’interazione catione-π ottenendo prodotti dalla scarsa attività inibitoria.
Sostituzioni in posizione 8 non sono ben tollerate, probabilmente a causa della limitata estensione della tasca che non consente l’alloggiamento di sostituenti ingombranti. Inoltre, indagando circa l’attività su altri bersagli, si è visto che il composto 19 presentava attività multichinasica, infatti è stato in grado di inibire in varie percentuali un set di sei chinasi umane: AurA/Aur2, CDC2/cDK1, EGFR, PDGFRβ, RAF-1 chinasi e Src. [113]
Tabella 2: Composti 4-24 sintetizzati[113]
Cpd X R3 R4 R5 4[113] H OCH3 H H 5[110] H Cl H H 6[110] H Br H H 7[110] H F H H 8[110] H CF3 H H 9[110] OCH3 OCH3 H H 10[110] OCH3 Cl H H
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Sulla base di questi ultimi risultati si è dedotta la fondamentale importanza del sistema anilinico variamente sostituito, e un’eventuale modifica per ottimizzare la molecola poteva essere quella a carico del sistema triciclico. È stata quindi sintetizzata una serie di derivati piridotiopiranopirimidinici II [111] (figura 24), concepiti come azaisosteri dei derivati benzotiopiranopirimidinici I.
Figura 24: derivati piridotiopiranopirimidinici II
11[110] OCH3 Br H H 12[110] OCH3 F H H 13[110] OCH3 CF3 H H 14[110] Cl OCH3 H H 15[110] Cl Cl H H 16[110] Cl Br H H 17[110] Cl F H H 18[110] Cl CF3 H H 19[110] H OCH3 OCH3 H
20[110] H OCH3 OCH3 OCH3
21[110] OCH3 OCH3 OCH3 H
22[110] OCH3 OCH3 OCH3 OCH3
23[110] Cl OCH3 OCH3 H
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Nei nuovi derivati l’inserimento di un atomo di azoto nel sistema triciclico dovrebbe produrre un effetto positivo, fornendo un punto aggiuntivo o alternativo per l’interazione con l’enzima, mentre è stata mantenuta la porzione arilica in posizione 2. Sono state sintetizzate 3 serie di composti di struttura generale II caratterizzati da varie porzioni ariliche in 2, nello specifico: 2-fenil per i 25a-c, 2-fenilammino per i 26a-k e 2-benzilammino per i 27a-h. [111]
Successivamente si sono testati per valutare la loro capacità di inibire l’attività della chinasi KDR, si è usato un saggio fluorimetrco su una KDR umana ricombinante usando Semaxanib come riferimento. Tutti i composti sono stati testati ad una concentrazione di 7 μM ed è stato preso il valore di IC50 per i composti più attivi.
Sono state osservate delle percentuali di inibizione di KDR che variavano da buone ad alte per i derivati 2-anilino sostituiti 26a-k, e, in molti casi, si sono rivelati anche maggiori del composto di riferimento Semaxanib (tabella 3). Invece la rimozione del gruppo amminico, oppure l’addizione di uno spaziatore metilenico riduce notevolmente l’efficacia inibitoria. Questo risultato fornisce la prova ulteriore della fondamentale importanza del gruppo amminico. [111]
Anche in questa nuova serie di composti viene mantenuto il trend precedente per quanto riguarda i sostituenti sul fenile anilinico, infatti, la maggiore attività inibitoria si è osservata con la presenza in R4 e R3 di un gruppo elettron-donatore, come il
metossile, mentre si è registrata una drastica caduta dell’attività quando al loro posto è stato messo un sostituente elettron-attrattore come: Cl, Br o CF3.
La sostituzione in R3 con un F (26g) rappresenta un’eccezione. I composti 26a, 26b,
26d, 26g, 26i, 26j mostrano una percentuale di inibizione nel precedente test che varia
da 88 a 99,7% e una IC50 che varia da 0.016 a 0.56 μM, significativamente più bassa
rispetto allo standard (tabella 3).[111]
Inoltre, sono stati valutati per la loro capacità antiproliferativa su cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) usando semaxanib come riferimento. Si è osservato che la maggior parte dei composti possedeva un certo effetto antiproliferativo rilevabile, in particolare 26b, 26d, 26i, 26j, hanno mostrato uno spiccato effetto
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antiproliferativo (tabella 4). Mentre i composti della serie benzilammino-sostituita hanno mostrato uno scarso effetto citotossico, ad eccezione di 27d, 27e e 27f che costituiscono un’eccezione, in quanto presentano una bassa attività inibitoria su KDR, ma un significativo effetto citotossico, questo si pensa sia dovuto al coinvolgimento di altri target rispetto alla via della chinasi VEGFR-2. [111]
Tabella 3: Attività inibitoria su KDR dei derivati 25a-c, 26a-k, 27a-h, utilizzando
semaxanib come riferimento. [111]
cpd Z R3 R4 R5 KDR (%) KDR IC50 (µM) 25a[111] - H H H 10 n.d. 25b[111] - H OCH 3 H 20 n.d. 25c[111] - H Cl H 12 n.d. 26a[111] NH H H H 88 0.56 26b[111] NH H OCH3 H 91 0.52 26c[111] NH H Cl H 62 n.d. 26d[111] NH OCH 3 H H 95.4 0.18 26e[111] NH Cl H H 21 n.d. 26f[111] NH Br H H 53 n.d. 26g[111] NH F H H 99.7 0.092 26h[111] NH CF 3 H H 17 n.d.
74 26j[111] NH OCH 3 OCH3 OCH3 93.8 0.016 26k[111] NCH3 H H H 2 n.d. 27a[111] NHCH2 H H H 10 n.d. 27b[111] NHCH 2 H OCH3 H 38 n.d. 27c[111] NHCH 2 H Cl H 11 n.d. 27d[111] NHCH2 OCH3 H H 17.7 n.d. 27e[111] NHCH2 Cl H H 5.0 n.d. 27f[111] NHCH2 Br H H 5.1 n.d. 27g[111] NHCH2 OCH3 OCH3 H 16.7 n.d. 27h[111] NHCH
2 OCH3 OCH3 OCH3 11.2 n.d.
Semaxanib 40 12.9
.
Tabella 4: Attività antiproliferativa verso HUVEC, HeLa, A-431 e MSTO-211H dei
derivati 25a-c, 26a-k, 27a-h, utilizzando semaxanib come riferimento. [111]
Cpd HeLa GI50 (µM) MSTO-211H GI50 (µM) A-431 GI50 (µM) HUVEC GI50 (µM) 25a[111] >20 > 20 > 20 17.1 25b[111] >20 > 20 > 20 >20 25c[111] 16.0 ± 1.7 11.6 ± 3.3 5.83 ± 0.84 10.2 26a[111] 1.25 ± 0.18 0.93 ± 0.29 0.95 ± 0.22 0.53 26b[111] 0.084 ± 0.022 0.13 ± 0.02 0.12 ± 0.02 0.11 26c[111] 2.33 ± 0.40 2.52 ± 0.22 2.29 ± 0.85 2.55
75 26d[111] 0.78 ± 0.44 1.08 ± 0.45 1.57 ± 0.25 0.39 26e[111] 8.30 ± 0.26 6.67 ± 2.35 9.40 ± 2.35 4.39 26f[111] 5.10 ± 1.84 4.03 ± 1.04 9.06 ± 2.21 3.11 26g[111] 1.10 ± 0.27 0.73 ± 0.15 1.23 ± 0.45 0.28 26h[111] 0.83 ± 0.07 1.13 ± 0.17 3.98 ± 0.60 4.95 26i[111] 0.54 ± 0.08 0.66 ± 0.12 0.67 ± 0.08 1.93 26j[111] 1.85 ± 0.71 1.30 ± 0.26 0.75 ± 0.05 1.30 26k[111] >20 18.1 ± 1.1 13.0 ± 0.7 16.0 27a[111] 9.65± 1.71 13.8 ± 1.8 11.4 ± 1.1 14.8 27b[111] 2.71 ± 0.22 8.63 ± 0.21 9.34 ± 0.71 16.3 27c[111] 5.42 ± 0.72 7.87 ± 0.32 8.38 ± 0.81 14.3 27d[111] 0.45 ± 0.05 9.50 ± 3.54 3.63 ± 0.35 1.46 27e[111] 0.45 ± 0.15 8.60 ± 2.74 4.76 ± 0.86 5.55 27f[111] 0.47 ± 0.13 0.78 ± 0.25 3.40 ± 0.75 0.35 27g[111] 9.83 ± 2.27 5.73 ± 1.74 8.93 ± 1.27 >20 27h[111] 1.57 ± 0.23 5.4 ± 1.25 2.73 ± 0.43 7.92 Semaxanib 38 ± 1 27 ± 2 37 ± 3 13.6
Le tre serie di composti sono state poi valutate per la loro capacità antiproliferativa su tre linee cellulari tumorali umane (A-431, HeLa, MSTO-211H), utilizzando semaxanib come riferimento, i risultati sono riportati in tabella 4. I migliori risultati in termini di GI50 si sono ottenuti con i composti 26b, 26d, 26i, che confermano ancora una volta la
fondamentale importanza del gruppo metossilico sull’anello anilinico, che essendo elettron-donatore, favorisce le interazioni a trasferimento di carica, accentuando l’interazione con il sito enzimatico.
Per confermare ulteriormente le ipotesi sono stati fatti studi in silico di molecular
docking sulla struttura cristallina di VEGFR-2 con conformazione DFG-out (figura 25).
Si è visto che il nucleo triciclico si va ad alloggiare nella gola lipofila formata dai residui Leu840, Val848, Ala866, Val899 e Leu1035 con i quali stabilisce interazioni di van der Waals. Uno degli azoti pirimidinici e l’NH esociclico di 26j formano due
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legami a idrogeno con il gruppo NH e il gruppo CO del residuo amminoacidico Cys919 nella regione cerniera. Inoltre, il ligando è inserito tra Phe918 e Phe1047 dove si osservano interazioni con trasferimento di carica favorite da sostituenti elettron- donatori e sfavorite da sostituenti elettron attrattori. Il gruppo anilinico è orientato verso l’esterno del dominio catalitico ed è stabilizzato da interazioni catione-π con la catena laterale della Lys838 (tutte le interazioni appena dette sono in figura 25 A).[111] In più è stata indagata la possibilità che l’acqua favorisca il legame con l’enzima, ed è stato visto attraverso lo strumento GIST, che stima i valori termodinamici per le molecole di acqua che occupano il sito di legame, e questo metodo è stato utilizzato per mappare le interazioni delle molecole di acqua con proteine e ligando. Secondo questo studio in silico una molecola di acqua posizionata tra Lys868 e l’atomo di azoto della porzione piridinica dello scaffold triciclico si è rivelata energeticamente molto favorevole (figura 25 B). Questo potrebbe spiegare la notevole efficacia dei composti 2-anilino-piridotiopiranopirimidinici. [111]
Figura 25: A) Modalità di legame di 26j all’interno del sito attivo di VEGFR-2, B)
77
Inoltre, anche questi composti (26b, 26i, 26j) hanno evidenziato una notevole attività inibitoria, addirittura maggiore dei loro predecessori, su altre chinasi, in particolare 26b ha prodotto un ottimo effetto inibitorio su Aurora chinasi (AurA/Aur2), sulla chinasi dipendente da ciclina (CDC2/CDK1) e sulla chinasi del PDGFRβ, in più ha dimostrato buone proprietà inibitorie nei confronti di Src e RAF-1. Mentre 26i e 26j hanno dimostrato un’attività inibitoria generale minore rispetto a 26b, ma maggiore verso Src e RAF-1. [111]
La presente tesi si inserisce in un progetto di ricerca più ampio volto allo studio di diversi sistemi eteropoliciclici allo scopo di individuare nuovi scaffold che, opportunamente decorati, potranno consentire lo sviluppo di nuovi inibitori di tirosina chinasi.
Sono stati quindi sintetizzate 4 serie di derivati 2-fenilammino-chinazolonici di formula generale III (28a-i), IV (29a-i), V (30a-i), VI (31a-i), con un sistema benzopiranico; la progettazione è stata realizzata attraverso una classica strategia di
Medicinal Chemistry di semplificazione strutturale. In particolare, le modifiche
apportate sono state:
• Semplificazione scaffold tricicliclo della serie I e II in favore di uno biciclico (fenil-ammino-chinazolonico) nelle serie III, IV, V, VI;
• La porzione anilinica è stata mantenuta in quanto reputata essenziale per l’interazione con la proteina target;
• È stato eliminato l’atomo di zolfo in quanto reputato non essenziale per l’interazione ligando-recettore.
Nella serie IV è stato inserito un secondo anello fenilico in posizione 7 del nucleo chinazolonico con lo scopo di mimare l’anello aromatico benzofuso dei derivati I e II. Nella serie V è stato aggiunto un gruppo metossilico in posizione para del fenile in 7 dato che l’inserimento di uno o più gruppi metossilici sull’anello anilinico in posizione 2 dei composti delle serie I e II ha portato ad un notevole incremento della loro attività antiproliferativa. Infine, nella serie VI sono stati addizionati due gruppi metilici in
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posizione 7 del sistema chinazolonico per valutare come una variazione dell’ingombro sterico in questa posizione influenzi l’attività dei composti finor sintetizzati.
In particolare, lo scopo del mio lavoro di tesi è stato quella di sintetizzare i composti poli sostituiti con atomi di cloro per valutare se, anche questa poli sostituzione, come quella con gruppi metossilici, potesse portare ad un potenziamento dell’attività di inibizione multichinasica.
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La procedura sintetica per la sintesi dei derivati III (28a-i) è descritta nello SCHEMA
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SCHEMA 1
Condizioni di reazione e reagenti: i) DMF-DMA a 100°C /1h; ii) anilina
opportunamente sostituita, etanolo assoluto, tempo variabile da 5h a 20h; iii) NaOH in 2 metossi-etanolo, microwave, 180°C, 70W, 1h.
Il primo step prevede la preparazione del composto 32 ottenuto mediante reazione tra i prodotti commerciali 1,3-cicloesandione e N,N-dimetilformammidedimetilacetale (DMF-DMA) tramite riscaldamento a riflusso 100°C per 1h. Al termine della reazione, dopo raffreddamento, viene aggiunto etere etilico che porta alla formazione di un precipitato che viene filtrato a pressione ridotta e successivamente essiccato in P2O5.
Il derivato 3-dimetilamminometilenico 32, così ottenuto è risultato sufficientemente puro da poter essere utilizzato senza ulteriore purificazione.
Il secondo step prevede la preparazione dei composti 33a-i ottenuti a partire dalle corrispondenti aniline commerciali. L’anilina opportunamente sostituita è stata
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solubilizzata in etanolo a 0°C, addizionata di acido nitrico concentrato goccia a goccia fino a pH acido e successivamente di una quantità stechiometricamente equivalente di cianammide solubilizzata nella minima quantità di acqua. La miscela di reazione è scaldata a 100°C a riflusso per un tempo variabile dalle 5 ore alle 20 ore, monitorando l’andamento di reazione mediante TLC. Al termine della reazione si lascia raffreddare, e si concentra sotto-vuoto. Precipita un solido che viene filtrato sotto-vuoto e successivamente essiccato con P2O5. Il composto è risultato sufficientemente puro da
essere impiegato senza ulteriori purificazioni.
Il terzo e ultimo step prevede la reazione tra il composto 32 e ognuno dei 33a-i, il composto 32 in una vial (10-20 ml) viene solubilizzato in 2-metossietanolo e addizionato di una quantità stechiometricamente doppia della opportuna guanidina nitrato 33a-i; si aggiunge poi alla miscela di reazione una quantità stechiometricamente tripla di NaOH. La vial viene quindi irradiata al microwave per 1 ora a 180°C (potenza 70 W), controllando l’andamento della reazione mediante TLC (miscela eluente, etere di petrolio 40-60°C: acetato di etile = 5:5 - 7:3).). Al termine la miscela viene evaporata a pressione ridotta, ottenendo i derivati 28a-i grezzi che vengono purificati mediante cromatografia flash (miscela eluente, etere di petrolio 40-60°C: acetato di etile = 5:5 - 7:3).
La stessa procedura sintetica è stata impiegata per la sintesi dei composti 29a-i, 30a-i e 31a-i (R = H, p-OCH3, m-OCH3, 3,4-di-OCH3, 3,4,5-tri-OCH3, p-Cl, m-Cl 3,4-di-
Cl, 3,4,5-tri-Cl), a partire dagli opportuni prodotti commercialmente disponibili e cioè dal 5-fenilcicloesan-1,3-dione (SCHEMA 2) dal 5-p-metossifenilcicloesan-1,3-dione (SCHEMA 3) e dal 5,5-dimetilcicloesan-1,3-dione (SCHEMA 4), rispettivamente.
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SCHEMA 2
Condizioni di reazione e reagenti: i) DMF-DMA a 100°C /1h; ii) anilina
opportunamente sostituita, etanolo assoluto, tempo variabile da 5h a 20h; iii) NaOH in 2 metossi-etanolo, microwave, 180°C, 70W, 1h.
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SCHEMA 3
Condizioni di reazione e reagenti i) DMF-DMA a 100°C /1h; ii) anilina
opportunamente sostituita, etanolo assoluto, tempo variabile da 5h a 20h; iii) NaOH in 2 metossi-etanolo, microwave, 180°C, 70W, 1h.
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SCHEMA 4
Condizioni di reazione e reagenti i) DMF-DMA a 100°C /1h; ii) anilina
opportunamente sostituita, etanolo assoluto, tempo variabile da 5h a 20h; iii) NaOH in 2 metossi-etanolo, microwave, 180°C, 70W, 1h.
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Nello SCHEMA 5 è invece riportata la sintesi dei composti policloro sostituiti da me sintetizzati.
SCHEMA 5
Condizioni di reazione e reagenti i) DMF-DMA a 100°C /1h; ii) anilina
opportunamente sostituita, etanolo assoluto, tempo variabile da 5h a 20h; iii) NaOH in 2 metossi-etanolo, microwave, 180°C, 70W, 1h.