Le tirosina chinasi fanno parte di quel grandissimo gruppo di proteine estremamente diffuso nel corpo umano che sono le chinasi. Le chinasi sono implicate in numerose vie di segnalazione intracellulare, permettono l’attivazione o l’inibizione di specifiche proteine che porteranno a valle un certo effetto, nello specifico, sono una famiglia di proteine deputate alla fosforilazione di altre molecole organiche.
La fosforilazione è il processo di trasferimento di un gruppo fosfato da una molecola, di solito ATP, ma esistono chinasi che sfruttano il GTP, detta donatrice, ad un substrato specifico. Questo processo funge da “segnale” per molte proteine che, se fosforilate, sono attive e in grado di catalizzare delle reazioni, mentre quando defosforilate sono inattive, o viceversa. L’estinzione di tale segnale è operato dalle fosfatasi che effettuano l’operazione inversa, vanno cioè a togliere un gruppo fosfato attraverso una reazione di idrolisi.
Esistono chinasi che fosforilano lipidi, carboidrati, nucleotidi e singoli amminoacidi, in quest’ultima categoria si collocano le tirosina chinasi e le serina/treonina chinasi. [71]
La tirosina chinasi è una famiglia di enzimi che catalizza la fosforilazione di residui di tirosina specifici nelle proteine bersaglio facendo uso di ATP; nello specifico è in grado rompere il legame tra il fosfato γ e il fosfato β presente nell’ATP al fine di trasferirlo su un residuo di tirosina. Le tirosina chinasi rivestono un ruolo molto importante nella progressione neoplastica in quanto implicate nelle vie che promuovono la differenziazione e proliferazione cellulare, inibiscono l’apoptosi, favoriscono la sopravvivenza, e si trovano molto spesso alterate nei tumori.
Nel genoma umano ne esistono 90 tipi diversi e possono essere suddivise in due grandi famiglie[72, 73]:
• Tirosina chinasi recettoriali (RTK): di cui vi fanno parte 58 tipi. Sono proteine transmembrana che possiedono un dominio extracellulare e uno intracellulare, localizzate sulla membrana cellulare. Sono raggruppate in 20 famiglie: ErbB,
37
InsR, PDGFR, VEGFR, FGFR, PTK7, Trk, Ror, MuSK, Met, Axl, Tie, EPHR, Ret, Ryk, DDR1/2, Ros, LMR 1/2/3, ALK, SuRTK.[73]
• Tirosina chinasi non recettoriali o citoplasmatiche (NRTK): di cui esistono 32 tipi e, a differenza delle prime, non possiedono il dominio extracellulare. Degli esempi sono Src, Abl, JAK, Fyn, Yes, Blk, Fgr, Yrk, Kck, Lck,Lyn.[72][73]
Tirosina chinasi recettoriali
Generalmente questa sottofamiglia di tirosina chinasi è localizzata nella membrana plasmatica. Tutte le RTK possiedono una struttura molecolare molto simile, con 3 domini principali:
1. Dominio extracellulare, N-terminale che interagisce con il ligando;
2. Dominio transmembrana, quasi sempre singola elica transmembrana che unisce il dominio extracellulare a quello citoplasmatico;
3. Dominio citoplasmatico al cui interno troviamo più regioni: la regione catalitica con attività tirosin-chinasica, la regione di regolazione juxtamembrana e l’estremità carbossi-terminale con funzioni regolatorie [73].
Le mutazioni e l’alterazione delle loro vie di segnalazione portano a gravi patologie quali diabete, aterosclerosi, infiammazioni, disturbi ossei e tumori.
Le 20 famiglie di RTK esistenti all’interno del corpo umano sono rappresentate in figura 7.
Per la maggior parte delle RTK il legame con il ligando induce la dimerizzazione del recettore. Questa può avvenire attraverso la formazione di complessi composti da 2 ligandi e 2 recettori, oppure 1 ligando che interagisce contemporaneamente con 2 recettori, ulteriormente stabilizzato da interazioni recettore-recettore. Tuttavia è importante osservare che non tutti vengono attivati così. Esiste una sottofamiglia che forma oligomeri anche in assenza di ligando; ne è un esempio il recettore per l’insulina
38
e il recettore per IGF1, che sono espressi sulla superficie cellulare come dimeri legati tra loro da legami a ponte disolfuro, e il legame con il ligando induce
dei cambiamenti strutturali all’interno di questi recettori tali da stimolare l’attività della tirosina chinasi e la segnalazione intracellulare.[73]
Figura 7: Famiglie di RTK [73]
Nel caso di alcuni ligandi si ha la necessità di molecole accessorie che stabilizzino il dimero poiché da soli non sono sufficienti per indurre la sua formazione, ad esempio gli FGF (fattori di crescita dei fibroblasti) non riescono ad attivare il complesso FGFR e necessitano della stabilizzazione dei proteoglicani eparin solfato (HSPG).
A prescindere dalla modalità di attivazione, il successivo step è comune a tutti i recettori: si va a promuovere l’autofosforilazione di residui di tirosina presenti sul dominio citosolico. Così facendo, si inducono cambiamenti conformazionali che servono a stabilizzare lo stato attivo della chinasi. Da qui in poi il recettore è attivo e
39
in grado di attivare altre vie, tramite fosforilazione di alcuni substrati o interagendo con specifiche proteine, come quella della via sos/Ras/Raf/MAPK oppure quella della via PI3K/Akt/mTOR. Questi e altri residui di tirosina fosforilata serviranno come siti di reclutamento per una serie di proteine di segnalazione, tipicamente attraverso il riconoscimento di domini Src Homolgy-2 (SH2) oppure PTB (PhosphoTyrosine-
Binding).[72]
Tirosina chinasi recettoriali (RTKs) implicate nel cancro
Partiamo dal presupposto che, se una RTK regola una via che sostiene la proliferazione, la sintesi di nuove proteine, la sopravvivenza, l’espansione, la replicazione, o comunque effetti “pro-vita”, può essere implicata nella patogenesi del cancro; perché può essere soggetta a mutazioni e può essere selezionato un clone tale per cui si abbia un’attivazione aberrante della via. Da diversi studi si è visto che i recettori maggiormente coinvolti nei tumori sono: ErbB, VEGFR, Met, c-Kit, FGFR, tutti recettori che hanno a valle un’attivazione di una via proliferativa.
ErbB
La sottofamiglia ErbB racchiude 4 componenti: ErbB1, o anche chiamato EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor), ErbB2, ErbB3, ErbB4, questo è di gran lunga il genere di recettori maggiormente espressi nelle cellule dell’organismo. Tutti quanti rispondono ad uno stimolo proliferativo indotto dal legame con i fattori di crescita come EGF (Epidermal Growth Factor) o TGFα (Transforming Growth Factor α) e attivano una o più vie, al fine di stimolare la crescita e la replicazione.[74] Scendendo nel particolare si è visto da uno studio che soltanto ErbB1 ed ErbB4 sono autonome, cioè, quando legate a un fattore di crescita dimerizzano e danno luogo alla fosforilazione, mentre gli altri due non sono autonomi. ErbB2 (chiamato anche Her-2 nell’uomo) non lega alcun ligando, ma agisce come supporto nella formazione di
40
oligomeri con altri ErbB legati al ligando, mentre ErbB3 può legare dei ligandi, ma non può trasmettere il segnale poiché il dominio chinasico non è funzionante. Tuttavia c’è da osservare che nella formazione di un eterodimero con ErbB2 e ErbB3 si ha l’innesco di potenti segnali intracellulari; più che recettori veri e propri, hanno la funzione di amplificazione del segnale.
Figura 8: Particolare della formazione del dimero di ErbB [75]
L’attivazione dei recettori ErbB, di cui la figura 8 riporta la formazione del dimero ErbB, è coinvolta nell’innesco di numerose vie tra cui la via PI3K/Akt/mTOR, la via Sos/Ras/Raf/MAPK che hanno come effetto a valle un aumento della trascrizione per specifici geni, inibizione dell’apoptosi, progressione del ciclo cellulare, ecc.[74]
41
Essendo protagonisti in numerose vie di segnalazione, non è raro trovarli implicati anche nel cancro, infatti mutazioni a carico dei geni che codificano per la famiglia degli ErbB si sono ritrovate in numerosi tumori. Una delle più conosciute, anche a livello mediatico, è la mutazione a carico del gene her-2 (ErbB2) che si riscontra nel 10-30% dei pazienti con tumore al seno ed è associata ad una ridotta sopravvivenza.[76] Si possono verificare mutazioni a carico del dominio extracellulare, del dominio juxtamembrana e transmembrana, in particolare sono state osservate 3 mutazioni missenso nei geni di EGFR in pazienti malati di glioblastoma (circa il 30-50% di essi possiede almeno una di queste mutazioni [76]), e sono associate ad una maggiore espressione del recettore che così può essere fosforilato anche in assenza del ligando [77]. Inoltre mutazioni a carico del EGFR si sono riscontrate nel 30-50%, nel 25-82% del cancro al colon-retto e nel 5-20% di casi di NSCLC[76].
VEGFR
Acronimo di Vascular Endothelial Growth Factor Receptor, ossia il recettore per il fattore di crescita endoteliale vascolare VEGF, un fattore che viene prodotto in seguito alla necessità di creare nuovi vasi, a causa di un trauma, oppure durante l’embriogenesi. VEGF rappresenta una famiglia di glicoproteine omodimeriche fondamentali per lo sviluppo embrionale del sistema sanguigno, del sistema linfatico e nella formazione di nuovi vasi sanguigni da vasi preesistenti.
È composta da 5 membri, ognuno con una specifica funzione:
• VEGF-A promuove l’angiogenesi andando a stimolare la migrazione e mitosi delle cellule endoteliali, promuove la creazione del lume dei vasi sanguigni e delle fenestrazioni nei capillari, inoltre favorisce la chemiotassi di macrofagi e granulociti e la vasodilatazione mediante il rilascio di NO. Ne esistono 9 sottotipi conosciuti ed è stato descritto anche come un fattore di permeabilità vascolare secreto dal tumore [78];
42
• VEGF-B, diffuso più o meno in tutto l’organismo possiede due isoforme ed è implicato nell’angiogenesi embrionale, si trova particolarmente abbondante nel cuore e nei muscoli scheletrici;
• VEGF-C, è coinvolto nella linfoangiogenesi, ossia la creazione di nuovi vasi linfatici;
• VEGF-D, è necessario per lo sviluppo della circolazione linfatica attorno ai bronchioli polmonari;
• PIGF: ne esistono 4 isoforme ed è implicato nella vasculogenesi e nell’angiogenesi in caso di ischemia, infiammazione, riparazione delle ferite e forme tumorali. È stato ritrovato nel cuore, nella tiroide e nei muscoli scheletrici [79].
Questi fattori di crescita vanno a interagire con i recettori in modo peculiare, secondo la figura sottostante (figura 9).
43
Esistono 3 classi di recettori VEGFR:
• VEGFR-1: possiede alta affinità per i ligandi VEGF-A e B, è espresso nelle
cellule endoteliali e una parte di cellule non endoteliali quali macrofagi e monociti e cellule staminale ematopoietiche. Riveste il ruolo di inibitore dei processi angiogenici durante lo sviluppo, ma diventa di fondamentale importanza in condizioni patologiche;[78]
• VEGFR-2: è espresso nell’endotelio vascolare e linfatico e in altri tipi di cellule come megacariociti e cellule staminali ematopoietiche. VEGFR-2 è il principale mediatore coinvolto nell’ angiogenesi, stimoli mitogeni e aumento della permeabilità, ed inoltre promuove la linfoangiogenesi. Ha un’affinità per VEGF-A circa 10 volte minore rispetto quella del VEGFR-1, ma nonostante ciò interagisce con gli altri VEGF, ad eccezione del B. Studi cristallografici hanno evidenziato che il legame del ligando dimerico VEGF ai domini immunoglobulino-simili 2 e 3 di un monomero di recettore, aumenta la probabilità che un secondo monomero si leghi al ligando già legato. Il meccanismo d’azione del recettore prevede che, in seguito alla dimerizzazione, esso si autofosforili sui propri residui di tirosina, in modo da attivare la segnalazione intracellulare. La segnalazione intracellulare mediata da questo recettore include l’attivazione di numerose proteine che si legano alle tirosine fosforilate del recettore attraverso i loro domini SH2, portando quindi alla loro fosforilazione e attivazione di numerose vie. Tra gli effettori finali dell’attivazione di VEGFR-2 troviamo le MAPK che stimolano migrazione e proliferazione, Akt con l’effetto di promuovere la permeabilità vascolare e le sopravvivenza inibendo l’apoptosi e la via Sos/Ras/Raf/MEK/ERK con conseguente trascrizione di geni e proliferazione. Lo troviamo altamente espresso nell’utero umano durante il ciclo mestruale;[79]
• VEGFR-3: presenta notevole affinità nei confronti di VEGF-C e D, è stato provato che se si trova iperespresso induce la crescita dei vasi linfatici senza nessuna influenza sui vasi sanguigni, questo indica che la sola stimolazione di
44
VEGFR-3 è sufficiente per indurre linfoangiogenesi. La stimolazione di questo recettore inoltre protegge le cellule endoteliali linfatiche dall’induzione di apoptosi[78].
Livelli elevati di VEGFR sono stati ritrovati in molti tumori, tra cui quello a rene, tiroide, al fegato e vari mielomi nei quali svolge un ruolo chiave nell’angiogenesi e nelle metastasi, infatti sono stati associati a forme di cancro con prognosi sfavorevole.
PDGFR
Acronimo di Platelet Derived Growth Factor Receptor, ossia recettore fattore di crescita derivato dalle piastrine, interagisce con il relativo fattore di crescita, PDGF. I fattori di crescita derivati dalle piastrine sono conosciuti come i principali mitogeni per le cellule del tessuto connettivo come i fibroblasti e le cellule muscolari lisce e regolano anche lo sviluppo embrionale.
La famiglia dei PDGF racchiude 4 tipi di fattori crescita: PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C e PDGF-D, i quali regolano la proliferazione, la differenziazione e la crescita cellulare, inoltre sono implicati nello sviluppo di molte malattie come il cancro. Svolgono la loro funzione quando sono in forma di dimero tenuti insieme da legami disolfuro, tutti i PDGF contengono domini N-terminali di varia lunghezza[81].
I PDGFR sono una famiglia di recettori appartenenti alla classe III dei recettori tirosin chinasici, composta da 5 membri che include: PDGFRα, PDGFRβ, KIT, FMS e FLT3, tutti caratterizzati da un segmento extracellulare con dominio 5-Ig e un dominio chinasico intracellulare separati da una sequenza amminoacidica idrofilica[81]. Poiché PDGFR e VEGFR hanno origine comune esiste una correlazione tra di loro, il dominio extracellulare di riconoscimento del ligando è percepito come simile dai VEGF, infatti la stimolazione di PDGFR è implicata nell’angiogenesi tumorale[81]. L’espressione di PDGFR e del ligando PDGF-A e B è stata osservata nella maggiore parte dei tumori cerebrali astrocitari e gliomi, l’inibizione della segnalazione di PDGF- PDGFR è una delle strategie di ricerca nella terapia antitumorale e l’inibizione
45
combinata di PDGF e VEGF è risultato un ottimo approccio per sopprimere l’angiogenesi tumorale[81].
Figura 10: Attivazione costitutiva di PDGFR in seguito a mutazione [28]
Una mutazione sul gene responsabile per la produzione del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF), produce una proteina in grado di attivarsi anche in assenza del fattore di crescita, come indicato in figura 10, questo causa una continua stimolazione della via proliferativa e costituisce la base per lo sviluppo di forme tumorali[28].
Met
Met, un componente della famiglia dei recettori tirosin chinasici, è un recettore di superficie per il fattore di crescita degli epatociti (HGF). Il legame tra HGF e MET induce la fosforilazione di alcuni residui di tirosina nel dominio citoplasmatico a cui vi si legano specifiche molecole che trasmetteranno il segnale a valle[82].
Questo recettore è in grado di promuovere la crescita, la sopravvivenza e la migrazione delle cellule tumorali, in quanto attiva una serie di effettori a valle come Akt, ERK, PI3K, RAS e SRC, in grado di dare un segnale proliferativo. Mutazioni con
46
amplificazione di Met sono state ritrovate in pazienti con cancro al seno e al polmone. Da recenti studi si è dimostrato che la sua attivazione promuove le sviluppo del tumore, non agendo direttamente sulla proliferazione, ma contrastando le condizioni avverse alla crescita del microambente tumorale, come ad esempio, l’attacco del sistema immunitario, inoltre è risultato coinvolto nella resistenza terapeutica. Questa sua competenza è strettamente correlata alla sua capacità di indurre nelle cellule la crescita invasiva, ossia la modifica della plasticità e forma che consente loro di acquisire motilità, crescere e invadere i tessuti anche distanti da sito di origine[83].
c-Kit
Conosciuta anche con il nome di Stem Cells Growth Factor Receptor ed è un recettore ad attività tirosin chinasica codificata da KIT, un noto proto-oncogene[28].
Il recettore c-Kit è espresso nelle cellule ematopoietiche e anche in diversi tessuti e tumori non ematopoietici.
È classificato come un recettore tirosin chinasico di tipo III, contiene cinque domini extracellulari immunoglobulino-simili, un dominio transmembrana e un dominio tirosin chinasico diviso in due regioni, una prossimale e una distale, separate da inserti di lunghezza variabile, oltre a queste caratteristiche, il recettore c-KIT è comune a molti altri RTK.
La stimolazione di c-Kit da parte del suo ligando porta all’attivazione di diverse vie di segnalazione intracellulare, tra cui la cascata di chinasi a partire da Ras che attiva MAPK con conseguente effetti proliferativi, oppure la via della PI3K/Akt/PKB che ha effetti antiapoptotici[84].
Mutazioni a carico del recettore c-Kit espongono la cellula al forte potenziale oncogeno e si sono ritrovate nei tumori dello stroma gastrointestinali, nel seminoma testicolare, nel melanoma e nella leucemia mieloide acuta[85].
47
FGFR
È il recettore per il fattore di crescita dei fibroblasti (Fibroblast Growth Factor
Receptor, FGFR) che ha come suo ligando il FGF (Fibroblast Growth Factor, fattore
di crescita dei fibroblasti).
La famiglia FGF è composta da 22 sottotipi di glicoproteine che producono numerosi effetti a valle che includono la sopravvivenza, la differenziazione e la migrazione delle cellule e l’angiogenesi. È importante osservare che questi ligandi si legano ai polisaccaridi caricati negativamente degli HSPG (eparin solfato proteoglicani) attraverso interazioni elettrostatiche, così facendo, gli HSPG possono proteggere FGF dalle degradazioni e stabilizzare il complesso FGF-FGFR formando un complesso ternario con il recettore[86].
I FGFR sono recettori transmembrana tirosin chinasici che appartengono alla famiglia delle immunoglobuline. Sono di 4 tipi da 1 a 4, e ogni monomero di FGFR è costituito da un dominio extracellulare che possiede il sito di legame per il ligando, due o tre loop di Ig, un dominio transmembrana e un dominio tirosin chinasico diviso.
FGFR viene attivato mediante dimerizzazione e, attraverso un cambio conformazionale indotto dal ligando, permette la fosforilazione delle tirosine presenti nel dominio citoplasmatico. Questo evento funge da segnale per il legame con varie proteine che portano poi all’attivazione di numerose vie, tra cui: Ras/Raf/MAPK, PI3K/Akt, Stats, e PLCγ, tutte vie coinvolte nella proliferazione e sopravvivenza cellulare[86].
Tenendo conto delle vie coinvolte nell’attivazione di questo recettore non ci stupisce se mutazioni a carico del pattern FGF-FGFR siano alla base di numerose forme tumorali; infatti si sono trovate mutazioni a carico di FGFR3 nel cancro alla vescica, amplificazioni di FGFR1 e 2, e polimorfismo in FGFR2 e 4 nel cancro al seno, mutazioni di FGFR2 nel cancro all’endometrio, traslocazione FGFR3 nel mieloma multiplo e mutazione su FGFR4 nel sarcoma[86].
48
Tirosina chinasi non recettoriali (NRTK)
Differiscono dalle precedenti perché non possiedono un dominio extracellulare, spesso si trovano nel citoplasma, ma talvolta possono trovarsi anche sulla membrana plasmatica, sono infatti proteine citoplasmatiche che mostrano una notevole variabilità strutturale.
Sono coinvolte nella segnalazione intracellulare in seguito all’attivazione dei recettori tirosin chinasici o di altri recettori. Queste interagiscono con i domini intracellulari autofosforilati dalle RTK, vengono attivate e promuovono la cascata del segnale all’interno della cellula. Due esempi sono Src e Abl (Abelson kinase)[87].
Src
È espresso in modo ubiquitario nei diversi tessuti con concentrazioni più elevate nei neuroni, piastrine e osteoclasti. Src è coinvolto nel mantenimento della normale omeostasi cellulare e in una ampia gamma di funzioni fisiologiche tra cui proliferazione e sopravvivenza cellulare, regolazione del citoscheletro, controllo della forma cellulare, mantenimento dei contatti intercellulari, motilità e migrazione.
Src si colloca adeso alla membrana citoplasmatica sul lato interno, interagisce fisicamente con i RTK attivati e, essedo un substrato e un attivatore, crea un meccanismo a feedback positivo che contribuisce a stabilizzare la forma attiva di RTK, e quindi il perdurare del segnale.
All’interno del tumore Src può indurre da un lato un aumento della crescita cellulare e sopravvivenza e, dall’altro può promuovere la riorganizzazione dei filamenti di actina del citoscheletro e una diminuzione dell’adesione cellula-cellula e cellula-matrice che facilitano motilità e l’invasione. Src iperespresso o iperattivato è stato ritrovato in un’alta percentuale di neoplasie come il carcinoma del colon-retto, della mammella, della prostata, del pancreas, del collo e del polmone[88].
49
Abl
È una tirosina chinasi che si trova sia nel citoplasma, dove lega i filamenti di actina nel citoscheletro, che nel nucleo. Le funzioni di Abl comprendono la regolazione del ciclo cellulare e del citoscheletro, inoltre influenza la trascrizione dei geni (a causa della sua localizzazione nucleare). Normalmente l’attività di Abl è strettamente regolamentata da alcuni domini presenti nella regione ammino-terminale; infatti una perdita di essi determina un’attivazione costitutiva dell’enzima, un fattore chiave nella trasformazione oncogenica di Abl. Una mutazione molto conosciuta a carico dei geni di Abl è la proteina BCR-ABL. Questa alterazione si viene a creare in seguito alla traslocazione di un gene tra il cromosoma 22 e il cromosoma 9 dando vita al cromosoma Philadelphia. Viene prodotta una proteina chinasi denominata BCR-ABL con intensa attività chinasica anche in assenza del ligando, questo porta a: una sovraespresione di molecole che stimolano il ciclo cellulare; modifiche del citoscheletro; perdita di inibizione da contatto e modifiche alla morfologia della cellula. L’espressione della proteina BCR-ABL è collegata in modo causale alla leucemia mieloide cronica e ad alcuni sottotipi di leucemia linfatica acuta[89].
50