Localizzazione e funzioni della Galectina-3 Generalità

La galectina-3 è stata identificata nel nucleo, citoplasma e nello spazio extracellulare; ha ruolo importante nella regolazione dell’apoptosi, motilità cellulare e nella crescita delle cellule T e in più risulta implicato nella progressione tumorale del cancro alla tiroide (Chiu et al., 2010).

Figura 3.5: Struttura cristallina a raggi X

del CRD della gal-3 umana ad una risoluzione di 2,1 ANGSTROM.

Figura 3.6: Struttura in soluzione

della porzione C-terminale della gal-3 in assenza di ligando (in verde) comparata con la struttura cristallina ai raggi X legata a LacNAc (in violetto).

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Come tutte le galectine anche la galectina-3 mostra un pattern di espressione specifico per cellule e tessuti.

La galectina-3 è sintetizzata su ribosomi liberi nel citoplasma ed è priva della sequenza segnale per la traslocazione nel reticolo endoplasmatico. Infatti, le galectine presentano un meccanismo di secrezione completamente nuovo, indipendente dal sistema reticolo endoplasmatico/Golgi, e che dipende invece dalla presenza della porzione N-terminale (Krześlak & Lipińska, 2004).

L’accumulo sul versante citoplasmatico della membrana plasmatica della galectina-3 è lo step limitante affinché avvenga la secrezione della proteina; si osserva, quindi, una sorta di estroflessione della membrana nel punto di accumulo della proteina e il rilascio di vescicole extracellulari che proteggono la gal-3 dalla proteolisi (Baptiste et al., 2007; Krześlak & Lipińska, 2004).

La lisi delle vescicole rilasciate per via esosomiale permette il rilascio delle proteine che legano così i ligandi esposti sulla superficie delle cellule o componenti della matrice extracellulare quali laminina, fibronectina, elastina e collagene IV (Dumic et al., 2006).

Per quanto riguarda la localizzazione nucleare, è stato invece suggerito che la galectina-3 si comporti come una proteina shuttle tra il nucleo e il citoplasma, ossia che si muova attraverso il complesso del poro nucleare sulla base di sequenze segnale riconosciute dalle importine ed esportine (Haudek et al., 2010).

La traslocazione della galectina-3 dal citoplasma al nucleo è attribuito al suo dominio N-terminale (Gong et al., 1999) nonostante alcuni studi suggeriscano anche l’implicazione del CRD (Gaudin et al., 2000). D’altra parte, invece, il trasporto della galectina-3 dal nucleo al citoplasma richiede la presenza di una specifica sequenza contenuta all’interno del CRD (Tsay et al., 1999).

Questa differente localizzazione all'interno della cellula risulta essere importante e significativa anche per lo svolgimento delle funzioni della proteina (figura 3.7).

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Figura 3.7: Ruoli e localizzazione della gal-3.

I numerosi ligandi con cui la galectina-3 interagisce all’interno della cellula ne fanno una molecola in grado di regolare diversi processi cellulari quali proliferazione, differenziazione, sopravvivenza e morte cellulare; si tratta perlopiù di interazioni di tipo proteina-proteina piuttosto che di tipo lectina-glicoconiugato (Krześlak & Lipińska, 2004) (figura 3.8).

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La galectina-3 citoplasmatica può interagire con Bcl-2 inibendo in questo modo l’apoptosi, ma è in grado di interagire anche con K-RAS legata al GTP (Elad- Sfadiaet al., 2004) ed influenzare il signaling di AKT mediato da RAS (Oka et al., 2005).

E’ stato dimostrato che la galectina-3 è in grado di interagire con Gemin4 (Park et al., 2001), un componente del complesso macromolecolare conosciuto come complesso di sopravvivenza dei motoneuroni SMN (survival motor neuron) (Charroux et al., 2000).

Questo complesso funziona sia nel nucleo che nel citoplasma: nel citoplasma media l’assemblaggio di piccole particelle ribonucleoproteiche nucleari (snRNP) mentre nel nucleo dirige le snRNPs a livello del pre-mRNA durante i primi stadi di formazione dello spliceosoma (Davidson et al., 2002).

Il ruolo extracellulare della galectina-3, come rappresentato schematicamente nella figura 3.8 risulta molteplice e complicato; qui svolge infatti funzioni di ancoraggio, angiogenesi e metastatizzazione.

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Galectina-3: trasformazione neoplastica e metastasi

Il processo di trasformazione neoplastica avviene attraverso l’accumulo successivo di mutazioni a carico dei geni che governano la proliferazione cellulare e la morte cellulare programmata (apoptosi). Le alterazioni che portano alla trasformazione maligna possono essere raggruppate secondo alcune caratteristiche essenziali: la capacità di proliferare indipendentemente dalla presenza di fattori di crescita (attivazione oncogeni); l’insensibilità ai segnali antiproliferativi (inattivazione degli oncosoppressori); la capacità di sfuggire ai segnali apoptotici, favorenti la morte cellulare; la capacità di divisioni cellulari illimitate; la capacità di stimolare la produzione di nuovi vasi sanguigni (neoangiogenesi); la potenzialità di colonizzare sedi distanti dall’insorgenza (metastasi).

Evidenze sperimentali hanno dimostrato che la sovraespressione della galectina-3 promuove la trasformazione neoplastica.

Era stato osservato, infatti, che l’inibizione dell’espressione della galectina-3, mediante cDNA antisenso in cellule di carcinoma papillare tiroideo umano, risultava in una soppressione della crescita cellulare indipendentemente dall’ancoraggio (Yoshii et al., 2001).

Tuttavia, la trasfezione di cDNA di galectina-3 in cellule follicolari della tiroide normali portavano ad un’alterazione dell’espressione genica, perdita dell’inibizione da contatto e crescita indipendentemente dalla presenza di siero (Takenaka et al., 2003). È stato possibile concludere che il mantenimento del fenotipo tumorale dei tireociti è strettamente associato all’espressione della galectina-3.

Il meccanismo molecolare che sta alla base di questo processo di trasformazione mediato dalla galectina-3 è stato attribuito, in parte, all’interazione tra la galectina-3 e l’oncogene K-RAS (Elad-Sfadia et al., 2004). Tale interazione promuove l’attivazione costitutiva del fosfoinositolo 3-kinasi dipendente da RAS e l’attivazione di RAF-1 (Newlaczyl & Yu, 2011).

La localizzazione nucleare della galectina-3 fa presupporre un’interazione molto stretta tra galectina-3 e DNA e quindi un ruolo della galectina nella regolazione dell’espressione genica. Lin e collaboratori (2002) hanno cercato di comprendere la

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funzione della galectina-3 nelle cellule epiteliali di tumore al seno. A livello del promotore della ciclina D, che è un importante regolatore del ciclo cellulare, gal-3 incrementa e stabilizza l’interazione dei fattori di trascrizione CREB ed SP1 ai rispettivi siti di legame, promuovendo in questo modo l’attivazione della trascrizione della ciclina D. Dal momento che i siti CRE ed SP1 sono stati ritrovati anche nelle regioni promotrici di molti geni, verosimilmente si può ritenere che la galectina-3 possa modulare la trascrizione anche di altri geni quali la ciclina A, p21WAF1/CIP1 e p27KIP1, mentre down-regola l’espressione della ciclina E (Kim et al., 1999).

L’up-regulation della galectina-3 e la sua traslocazione nel nucleo si verifica nelle cellule proliferanti, suggerendo una funzione nella normale crescita cellulare (Yang et al., 1998). La galectina-3 è risultata sovraespressa anche nel compartimento nucleare delle cellule proliferanti di carcinoma papillare alla tiroide. Qui gal-3 stimola l’attività trascrizionale del fattore di trascrizione 1 (TTF-1) specifico della tiroide, contribuendo in questo modo all’elevata capacità proliferativa di queste cellule (Paron et al., 2003) (figura 3.10).

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La galectina-3 extracellulare risulta implicata principalmente nelle interazioni cellula-cellula, cellula-matrice (Sawangareetrakul et al., 2008) e dunque nella metastatizzazione, fenomeno, quest’ultimo, in cui risulta coinvolta anche l’interazione della galectina-3 con l’antigene di superficie Tf, noto per essere espresso da cellule altamente metastatizzanti (Khaldoyanidi et al., 2003) (figura3.7).

L’espressione della galectina-3 è associata, infatti, all’invasione cellulare e ad un potenziale metastatico nei tumori alla tiroide ma anche a testa-collo, colon e stomaco (Takenaka et al., 2004 (b)). Esistono tuttavia dei risultati discordanti: nei topi era stato osservato che il potenziale metastatico delle cellule di fibrosarcoma e melanoma era correlato all’aumento di espressione della gal-3 sulla superficie cellulare (Raz et al., 1987). Il contrario si verifica per alcuni tumori quali il cancro al seno ovaie e prostata, nell’uomo (Takenaka et al., 2004 (b)).

Angiogenesi e galectina-3

L’angiogenesi è un complesso processo multistep associato ad infiammazione, crescita tumorale e metastasi (Folkman, 1995). La formazione di nuovi vasi è richiesta per la crescita del tumore nei siti primario e secondario e fornisce la strada per la disseminazione attraverso il flusso sanguigno. La gal-3, come emerso da alcuni studi, risultava implicata nell’angiogenesi associata a tumore (Nangia-Makker et al., 2000). Era stato dimostrato che la galectina-3 promuoveva neovascolarizzazione in vivo e la formazione di un tubo capillare, in vitro, a partire da cellule endoteliali di cordone ombelicale umano (Takenaka et al., 2004 (b)). È probabile che dopo la secrezione, la galectina-3 venga mantenuta in una forma legata ai propri ligandi presenti nella matrice extracellulare o che possa interagire direttamente con le cellule endoteliali (Nangia-Makker et al., 2000). L’interazione della galectina in questione con i glicani o le integrine espressi sulle molecole della superficie cellulare innesca il processo di angiogenesi: si ha clustering della galectina 3 con i suoi ligandi sulla superficie cellulare e l’attivazione della kinasi FAK (focal adesion kinase) che modula l’angiogenesi mediata dai fattori VEGF (vascular endothelial growth factor) e bFGF (basic fibroblast growth factor) (figura 3.11) (Markowska et al., 2010).

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Figura 3.11: Processo angiogenetico indotto dalla galectina-3.

La formazione dei capillari indotta dalla galectina-3 veniva inibita dalla neutralizzazione dell’azione della galectina-3 ad opera di specifici carboidrati inibitori o di anticorpi specifici; la neutralizzazione del dominio di riconoscimento dei carboidrati della gal-3 mostra l’importanza delle interazioni proteina-carboidrati nel processo angiogenetico (Takenaka et al., 2004(b)).

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Regolazione dell’apoptosi

L'apoptosi è un processo biologico nel quale una serie di eventi geneticamente determinati portano alla morte cellulare, contribuendo al mantenimento dell'omeostasi tissutale; normalmente, questo processo si verifica durante il differenziamento, nell'ambito della risposta immunitaria, oppure a carico delle cellule tumorali sottoposte a chemio/radioterapia. La resistenza agli stimoli apoptotici rende però le cellule tumorali capaci di evadere la morte cellulare indotta dalle terapie o dalle cellule del sistema immunitario, determinando la progressione della malattia (Nakahara et al., 2005).

Tuttavia è stato visto che una riduzione dell’espressione della galectina-3 mediante l’utilizzo di siRNA induce l’apoptosi in linee cellulari umane di carcinoma papillare alla tiroide (Lin et al., 2009).

La capacità della galectina-3 di proteggere le cellule dall’apoptosi suggerisce che la galectina-3 regola specifici step del processo apoptotico. Studi relativamente recenti hanno suggerito l’importanza di due siti presenti a livello della sequenza amminoacidica: il motivo Asp-Trp-Gly-Arg (NWGR) e la Ser6, target della casein kinasi1 (CK1) (Takenaka et al., 2004 (a)) (figura 3.12).

NWGR è un motivo conservato nel dominio di omologia (BH1) della proteina Bcl-2 appartenente alla famiglia Bcl-2. Tale motivo spiega l’attività anti-apoptotica della famiglia Bcl-2 grazie all’inibizione del rilascio del citocromo C dai mitocondri (Yu et al., 2002). È pertanto possibile che la galectina-3 agisca sostituendo o mimando l'azione della proteina anti-apoptotica Bcl-2 attivando, almeno in parte, i pathway di ERK e JNK (Zörnig et al., 2001).

Figura 3.12: Processo di inibizione dell’apoptosi da parte

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Esperimenti di mutagenesi sito-diretta hanno messo in evidenza il ruolo fondamentale di questi due siti nel processo anti-apoptotico ad opera della galectina- 3, in modo analogo a quello che accade per Bcl-2 (Akahani et al., 1997). Tuttavia la relazione tra la regolazione della fosforilazione nel dominio N-terminale della galectina-3 (Ser6) e la sua funzione anti-apoptotica è ancora poco chiara. Studi recenti hanno mostrato che la fosforilazione della Ser70 nella proteina Bcl-2 ad opera della proteina kinasi C può essere responsabile dell’attivazione o inattivazione del processo anti-apoptotico a seconda del tipo cellulare e delle molecole inducenti il processo apoptotico (Haldar et al., 1998).

Bcl-2, se fosforilata, perde la capacità di eterodimerizzare con Bax, membro anche questo della famiglia Bcl-2 (Shitashige et al., 2001). La similarità funzionale tra Bcl- 2 e gal-3 e la fosforilazione della serina (Ser70 in Bcl-2 e Ser6 in gal-3) ha indotto ad investigare sul ruolo della fosforilazione della gal-3 e sulla sua localizzazione subcellulare.

È stato riscontrato che la fosforilazione è un comune meccanismo di regolazione che determina la compartimentalizzazione subcellulare di un gran numero di proteine.

La traslocazione della galectina-3 dal nucleo al citoplasma, in seguito alla fosforilazione della serina-6, è un prerequisito per la sua attività anti-apoptotica (Takenaka et al., 2004 (a)).

Recentemente la galectina-3 è stata ritrovata nel pathway apoptotico di p53/HIPK2: HIPK2 attivato da p53 reprime la trascrizione del gene LGALS3 inducendo, da una parte, una diminuzione sia dell’mRNA che del prodotto proteico, dall’altra un incremento del processo apoptotico (Cecchinelli et al., 2006).

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