Sodio Dodecil Solfato Poliacrilamide Gel Elettroforesi (SDS-PAGE) 1 Fase di preparazione di gel di poliacrilammide

Questa metodica consente di separare proteine di diverso peso molecolare mediante migrazione attraverso le maglie di un gel di poliacrilamide sotto l’azione di un campo elettrico.

Ciò è consentito dalla presenza del sodiododecilsolfato (SDS), un detergente anionico presente sia nel Loading buffer che nel buffer di corsa, capace di complessarsi alle proteine e di conferire loro una carica netta negativa costante per unità di massa. A favorire la denaturazione delle proteine è anche un un ciclo ad alta temperatura (97°C) per 10 minuti, in presenza di ß-mercaptoetanolo, in fase di preparazione dei campioni. Ne consegue che le proteine vengono separate, mediante elettroforesi in verticale, sulla base del loro peso molecolare. Il gel di poliacrilamide,

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in cui vengono fatte separare le proteine, è un gel dello spessore di circa 1 mm formato da un gradiente discontinuo di due gel a pH e concentrazioni di acrilamide diversi:

Lo stacking gel, ovvero il gel superiore di impacchettamento, e il running gel che si trova nella parte inferiore in cui avviene la vera e propria separazione delle proteine. Lo stacking gel è stato preparato al 5% mentre il running gel al 12 % di acrilamide (tabella 4.6).

Running gel 12% Stacking gel 5%

Acqua deionizzata 3,4 ml 5,7 ml 4% Gel Buffer* 2,5 ml 2,5 ml 10% (w/v) SDS 0,1 ml 0,1 ml Soluzione acrylamide/bis 30% 4,0 ml 1,7 ml 10% (w/v) APS** 50 µl 50 µl TEMED 5 µl 10 µl

Tabella 4.6: I quantitativi sono relativi alla preparazione di 10 ml dei due gel.

*composizione dei gel buffers: running gel : 1.5M Tris-HCl, pH 8.8; stacking gel: 0.5M Tris-HCl,

pH 6.8.

**10% (w/v) APS: si dissolvono 100 mg di APS in polvere in 1 ml di acqua deionizzata.

L’APS (ammonio-persolfato) e il TEMED (N,N,N',N'-tetrametiletilendiammina) che determinano una co-polimerizzazione di acrilammide e metilene-bis-acrilammide portando alla formazione delle tipiche maglie del gel, vengono aggiunte alla miscela solo qualche istante prima di colarla nell’apposito spazio tra i due vetrini, dove avviene la polimerizzazione del gel. L’APS promuove l’innesco della polimerizzazione insieme al TEMED che funge da catalizzatore.

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Figura 4.7: polimerizzazione dei monomeri di acrilammide e bis-acrilammide.

Si lascia solidificare per circa 30 minuti il running gel e si aggiunge lo stacking gel, nel quale si inserisce il bio-rad combs che permette la formazione dei pozzetti in cui caricare i campioni.

4.7.3.2. Preparazione dei campioni di proteine

Per le diverse proteine da saggiare (β-actina, Mdm2, p21, p53) si è caricato una certa quantità di estratto proteico, che è stato deciso in seguito ad una serie di prove sperimentali che hanno consentito di individuare, per ogni proteina cercata, le condizioni migliori e quindi anche la quantità di proteine da caricare sul gel per ottenere una visualizzazione ottimale (tabella 4.7).

Proteine β-actina Mdm2 p21 p53

Quantità caricata

10 µg 5 µg 10 µg 20 µg

Tabella 4.7: quantità di estratto proteico caricato per l’analisi dell’espressione di specifiche proteine. I

volumi sono stati determinati dalle concentrazioni proteiche misurate con il metodo descritto in §4.6.2.

È stato utilizzato, come controllo, la proteina β-Actina che essendo codificata da un gene Housekeeping dovrebbe mantenere lo stesso livello di espressione nelle cellule: ne consegue che, alterazioni nei livelli di espressione potrebbero essere attribuibili ad

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errori tecnici relativi al caricamento errato conseguente, ad esempio, al problema dei piccoli volumi utilizzati. La densità della banda relativa alla proteina β-Actina, che si ottiene dopo rivelazione chemiluminescente, verrà utilizzata per la normalizzazione delle altre proteine, in modo da evidenziare la reale variazione di espressione proteica, escludendo variazioni non veritiere determinate da errori sperimentali. L’analisi delle proteine ha inizio con la loro separazione, per analizzarle in maniera qualitativa in seguito.

Una volta determinata sperimentalmente la quantità ideale è stato aggiunto un volume di RIPA buffer in modo da caricare lo stesso volume finale per tutti i campioni. A questi si è aggiunto un uguale volume di Loading buffer composto dal 95% di Sample buffer (0.5 M Tris-HCl, pH 6.8, glicerolo, 10% (w/v) SDS, 0.5% (w/v) Blu di Bromofenolo, e acqua deionizzata) e dal 5% di ß-mercaptoetanolo, per poi incubare 10 min a 97°C in termociclizzatore in modo da favorire la denaturazione delle proteine (tabella 4.8). Si ha così la distruzione delle strutture secondaria e terziaria delle proteine, in quanto i ponti disolfuro sono rotti dal ß-mercaptoetanolo , mentre la destabilizzazione viene operata dal calore e dall’SDS, che contribuisce inoltre a conferire alle proteine una carica negativa (figura 4.8). Le proteine, ormai ridotte a catene filamentose, sono separate secondo il loro peso molecolare con l’utilizzo di un campo elettrico uniforme.

Proteine β-actina Mdm2 p21 p53 Volume RIPA buffer 5 µl - x µl 3 µl - x µl 5 µl - x µl 7 µl – x µl

Volume Loading buffer 5 µl 3 µl 5 µl 7 µl

Tabella 4.8: Volumi di RIPA buffer e Loading buffer da aggiungere al volume di estratto proteico,

prima di sottoporre a denaturazione a 97°C. x µl = volume di estratto proteico corrispondente alla quantità di proteine riportata nella tabella 4.7.

Contemporaneamente ai campioni sono stati caricati in uno dei pozzetti del gel 4 µl di Precision Plus Protein™ Dual Color Standards (BioRad) che consentirà poi di discriminare le proteine in base al peso molecolare (figura 4.9).

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Figura 4.9: Precision Plus Protein prestained standard (dual color).

I campioni sono stati caricati sul gel, previo montaggio dello stesso su cella per elettroforesi (Mini-PROTEAN® Tetra Cell for Mini Precast Gels, Bio-Rad) e quindi sottoposti ad una differenza di potenziale costante pari a 150 V in un tampone di corsa opportuno (Electrophoresis running buffer 10x Tris/glycine/SDS: 250 mM Tris, 1,92 M glicina, 1% SDS, pH 8.3, Bio-Rad) per 1 ora o fino a quando il fronte del colorante (presente nel campione) raggiunge la prossimità del fondo del gel.

Figura4.8 : effetto dell’SDS sulla conformazione e carica della proteina

4.7.4. Elettroblotting

Il metodo consiste nell’elettrotrasferimento di proteine dalla matrice del gel di acrilamide, in cui sono state fatte migrare, ad una membrana di nitrocellulosa. Una volta fissate nella membrana, le proteine possono poi essere analizzate per mezzo di anticorpi specifici diretti contro epitopi antigenici esposti dalle proteine stesse.

Il trasferimento delle proteine dal gel alla membrana di nitrocellulosa è stato effettuato mediante il Mini Trans-Blot® Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad);

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dall’anodo verso il catodo è stato allestito il “blotting sandwich” formato da una spugna, due fogli di carta da filtro, la membrana di nitrocellulosa, il gel di poliacrilammide, altri due fogli di carta da filtro e infine da un’ulteriore spugna. I fogli di carta da filtro e la membrana di nitrocelluosa sono stati precedentemente immersi per qualche minuto nel tampone di trasferimento (Tris/Glycine buffer: 25mM Tris, 192mM glicina, pH 8,3. Il tampone fornito da BioRad è un tampone 10x, privo di metanolo che sarà aggiunto al momento dell’utilizzo fino al 20% v/v).

L’assemblato è stato inserito, quindi, in una camera di corsa contenente il tampone di trasferimento e, applicando un amperaggio costante di 200 mA per 1 ora, si è ottenuto il trasferimento e l’ancoraggio delle proteine al filtro di nitrocellulosa.