Tecnica della Real-Time qPCR

La tecnica Real-Time PCR detta anche PCR quantitativa o più brevemente qPCR fornisce un metodo valido per lo studio quantitativo dell’espressione genica e come tale necessita preliminarmente di mRNA poi retrotrascritto in cDNA grazie alla Reverse Transcriptase.

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La Real-Time PCR monitorizza la fluorescenza emessa durante la reazione come indicatore della produzione di amplificati durante ogni ciclo di PCR.

Il sistema della Real-Time PCR è basato sull’analisi e la quantificazione di un reporter fluorescente; si utilizzano infatti marcatori fluorescenti, sonde (TaqMan) o agenti che si legano a DNA (SYBR green) il cui accumulo, a livello del prodotto di reazione, segue la stessa cinetica della PCR.

Questo segnale aumenta in maniera direttamente proporzionale alla quantità di prodotto di PCR in una reazione. Per registrare la quantità di emissione della fluorescenza ad ogni ciclo, è possibile monitorare la reazione di PCR durante la fase esponenziale dove il primo significativo aumento nella quantità dei prodotti di PCR correla con la quantità iniziale di templato del target. Il ciclo soglia si verifica quando il sistema di rivelazione inizia a captare un aumento nel segnale associato ad una crescita esponenziale dei prodotti di PCR durante la fase logaritmica-lineare.

Questa fase ci fornisce le informazioni più utili circa la reazione. La pendenza della fase log-lineare riflette l’efficienza di amplificazione.

Il diagramma che otteniamo, mostra infatti un andamento sigmoide caratterizzato da tre fasi.

Nella prima fase al susseguirsi dei cicli di amplificazione non corrisponde un significativo incremento di fluorescenza; ciò è dovuto al fatto che la quantità di prodotto amplificato genera un segnale fluorescente che si mantiene al di sotto della soglia di rilevabilità dello strumento. A questo punto si succede una fase esponenziale in cui, con l’avanzare dei cicli termici, inizia a diventare significativo l’incremento di fluorescenza dovuto all’accumulo di prodotto di amplificazione; in questa fase tutti i reagenti sono nel loro rapporto ottimale di concentrazione e per questo la quantità di amplificato che si forma risulta direttamente proporzionale alla quantità di templato iniziale. Infine si ha una fase di plateau in cui l’intensità di fluorescenza non aumenta in maniera significativa al progredire del numero dei cicli a causa di una ridotta disponibilità dei substrati consumati nel corso della reazione: la quantità di amplificato che si forma non è più direttamente proporzionale alla quantità di DNA stampo.

Il parametro più importante per la quantificazione è il Ct (Cycle threshold). Maggiore è la quantità iniziale di DNA, prima verrà rilevato il prodotto accumulato durante la

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PCR, e più basso sarà il valore di Ct. La scelta del ciclo soglia, che determinerà il valore di Ct, è determinata in modo automatico dalla macchina ma può essere effettuata anche dall’operatore. In quest’ultimo caso dovrebbe essere posto sopra ogni attività di base, nella fase di crescita esponenziale (che diventa lineare nella trasformazione logaritmica).

Per la corretta quantificazione si costruisce una curva di calibrazione: si effettuano delle diluizioni seriali su un pool di cDNA a concentrazione nota e dai risultati ottenuti da reazione di Real-Time PCR si riporta sull’asse delle ascisse il logaritmo della quantità di materiale di partenza mentre sull’asse delle ordinate i valori di Ct ottenuti dall’amplificazione di ogni diluizione.

Dall’equazione della retta di regressione lineare sopracitata e dal coefficiente di correlazione r è possibile trarre delle conclusioni importanti relative all’efficienza della reazione.

La linearità dei dati, che in qualche modo misura la variabilità presente tra le repliche è rappresentata da r o R2. Il valore di r deve essere maggiore di 0,990, mentre R2> 0,980; differenze significative tra i Ct delle repliche abbasserà il valore di r. La pendenza (slope = coefficiente angolare della curva) ricavata dall’equazione di tale retta può essere direttamente correlata all’efficienza della reazione di amplificazione mediante la seguente legge:

E=10 (-1/slope) oppure E%= (E-1) x 100% Dove:

slope = coefficiente angolare della curva

I valori di efficienza percentuale generalmente accettati vanno dal 90% al 110%, meglio se l’efficienza è del 100%, valore a cui si tende se la pendenza della curva è vicina a -3,33. Ciò assicura una buona riproducibilità dei dati, garanzia fondamentale per la standardizzazione della metodica.

Negli esperimenti di Real-Time qPCR condotti mediante l’impiego di sostanze fluorescenti che si intercalano in modo aspecifico alla doppia elica del DNA amplificato, come nel nostro caso, al termine del processo di amplificazione, il software elabora la curva di melting.

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Tale curva fornisce, infatti, importanti indicazioni sulla “purezza” del prodotto di amplificazione e quindi sull’attendibilità del risultato ottenuto.

La temperatura di melting (Tm) di un frammento di DNA a doppio filamento si definisce come la temperatura alla quale, nella miscela di reazione, il 50% del DNA

presente è organizzato a doppio filamento.

In questa maniera, all’aumentare della temperatura, si assiste ad un graduale decremento della fluorescenza generato dalla denaturazione del prodotto di reazione (DNA a doppio filamento) e dal conseguente rilascio nel mezzo di reazione del colorante intercalante. La costruzione della curva di melting è resa possibile impostando, a livello del termociclatore, lievi incrementi di temperatura al termine del processo di amplificazione.

A livello grafico, la Tm è rappresentata da un punto di flesso della curva di melting. Riportando in ascissa la temperatura e in ordinata la derivata prima del rapporto tra l’intensità di fluorescenza rispetto alla temperatura (-dI/dT), il punto di flesso viene convertito in un picco: il picco di melting.

I prodotti di amplificazione possono essere quantizzati in modo assoluto o relativo: il metodo di quantificazione assoluta richiede la costruzione della curva di calibrazione utilizzando campioni standard a concentrazione nota mentre la quantificazione relativa e richiede la quantificazione di geni di controllo o Housekeeping per normalizzare l'espressione del gene studiato.

Protocollo per la Real-Time PCR

Per preparare la miscela di amplificazione è stata utilizzata la soluzione 5X HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus (ROX), la quale contiene una serie di componenti utili al processo di amplificazione quali la DNA polimerasi, i dNTPs, l’Mgcl2 , e infine il DNA-binding dye, EvaGreen (figura 4.3) usato al posto del SYBR

Green in quanto meno tossico e ROX, che serve da normalizzatore.

L’ipotetica variazione di espressione dei geni sopracitati, è stata valutata, per ogni gene in triplicato, nelle due diverse condizioni sperimentali ovvero per le cellule TPC1 trasfettate con le due varianti del gene LGALS3. Come in tutti gli esperimenti anche in questo caso è stato previsto l’utilizzo di un controllo, negativo, contenente solamente la miscela di reazione: in questo pozzetto non dovrebbe verificarsi

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amplificazione per assenza del templato (cDNA) e se questo accade si possono escludere eventuali contaminazioni. Altro controllo preso in considerazione è rappresentato dall’analisi dell’espressione genica in cellule di TPC1 non trasfettate.

Reagenti Volume per un campione (µl)

HOT FIREPol EvaGreen qPCR Mix Plus 5X

4

Primer_F x (a seconda della concentrazione usata)*

Primer_R x (a seconda della concentrazione usata)*

cDNA 1

Acqua sterile x (a seconda dei volumi usati per i primers)

Totale 20

Tabella 4.4 : Reagenti per Real-Time qPCR con EvaGreen.*Le concentrazioni usate sono diverse a seconda dei primers. Vanno da 100 a 300 nM.

E’ stata utilizzata a tale scopo una piastra da 96 pozzetti per Real-Time in cui è stata dispensata la mix preparata secondo quanto riportato dal protocollo.

L’analisi delle piastre relative ai campioni presi in esame è stata condotta utilizzando il termociclatore iCycler. L’amplificazione ha previsto l’adozione delle seguenti condizioni:

 Incubazione iniziale a 95°C per 15’: inattivazione dell’enzima.  Denaturazione iniziale a 95°C per 15’’.

 Annealing dei primers alla Tm prevista e polimerizzazione a 72°C per 20’’. Al termine della reazione di amplificazione l’allestimento delle curve di melting relative a ciascun amplificato è stato condotto secondo il seguente protocollo:

Figura 4.3: Meccanismo di azione del reagente Eva-Green

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 Incrementi consecutivi di 0,3°C (da 65°C a 95°C) compiuti ogni 10’’.

Fasi di allestimento della reazione di Real-Time PCR per le cellule TPC1 trasfettate

Sono state calcolate le efficienze di tutte le coppie dei primers per verifcare che rientrassero nel range di accettabilità (90%-110%). Sono state allestite a tale scopo, delle diluizioni seriali partendo da cDNA non diluito (1:1), cDNA diluito 1:5, cDNA diluito 1:25, cDNA diluito 1:125 e cDNA diluito 1:625 e si è sottoposto a Real-Time PCR in modo da costruire la retta di taratura, dal cui coefficiente angolare si è ricavato il valore dell’efficienza di reazione secondo la formula:

E =(10-1/slope)

Una volta accertata l’efficienza dei primers è stata effettuata la Real-Time qPCR e per trovare la quantità (Quantity) di cDNA presente in ogni campione è stata applicata la formula:

Q=E (-ΔCt)

Dove ΔCt si ottiene sottraendo il Ct più basso a quello ottenuto per ogni campione.

Infine per la normalizzazione, mediante il software geNORM

(URL:http://medgen.ugent.be/genorm/) sono stati selezionati i geni Housekeeping più stabili. L’algoritmo in questione fornisce, infatti, per un gruppo di “reference genes” una scala di stabilità in uno specifico tessuto (i valori più bassi di M, che rappresenta la variazione media a coppie (V) tra ogni gene di riferimento e gli altri geni di riferimento inclusi nell'analisi, denotano i geni di riferimento più stabili) sulla quale viene calcolato il Fattore di Normalizzazione (NF) che è una media geometrica delle Quantity dei geni di riferimento selezionati.

Una volta ottenute le Quantity anche dai geni target si è diviso le Quantity del campione per il suddetto fattore di normalizzazione precedentemente individuato. Infine l’analisi statistica mediante il T-test ha permesso di indagare sulla significatività della differenza tra i valori medi dei due campioni.

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