Risultati Western Blot

Mdm2

Le figure 5.11 e 5.12 rappresentano il risultati ottenuti per la proteina Mdm2.

Figura 5.12: Istogramma rappresentante la media e la deviazione standard dei valori ottenuti

dall’analisi densitometrica delle bande relative alla proteina “Mdm2” nei tre campioni “A” e nei tre campioni “C” (bande riportate nella figura 5.11), in seguito alla normalizzazione con la β-actina.

Nonostante le bande per l’actina mostrino delle leggere differenze tra i campioni, è apprezzabile come l’intensità delle bande per Mdm2 nei campioni ottenuti da cellule trasfettate con “pDream 2.1 LGALS3 c.191C” sia circa 1,35 volte più alta rispetto a quelle relative alla trasfezione con il plasmide “pDream 2.1 LGALS3 c.191A” a sostegno dell’ipotesi che la variante “C”, più frequente nei casi, determina una diversa regolazione del gene MDM2. La banda di 85 KDa appena visibile nella lane relativa alle cellule TPC1 non trasfettate sottolinea il ruolo della Galectina-3 nella

Figura 5.11: Western Blot di Mdm2 negli estratti proteici ottenuti da cellule TPC1 trasfettate

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modulazione dell’espressione del gene in questione; la trasfezione, infatti, determina una sovraespressione della proteina esaminata.

P21

Nelle figure 5.13 e 5.14 sono riportati i risultati del western blot relativi a p21.

Figura 5.14: Istogramma rappresentante la media e la deviazione standard dei valori ottenuti

dall’analisi densitometrica delle bande relative alla proteina “p21” nei due campioni “A” e nei due campioni “C” (bande riportate nella figura 5.13), in seguito alla normalizzazione con la β-actina.

Anche proteina p21 risulta essere maggiormente espressa (2,34 volte) nelle cellule trasfettate con il plasmide esprimente la variante C del gene LGALS3, in accordo con i risultati ottenuti in Real Time qPCR e nel saggio della luciferasi. Anche in questo caso la bassa quantità di proteina riscontrabile nelle cellule non trasfettate contribuisce ad avvalorare l’ipotesi di un ruolo funzionale della galectina-3 nell’espressione di specifici geni.

Figura 5.13: Western Blot di p21 negli estratti proteici ottenuti da cellule TPC1

trasfettate con le due varianti alleliche (A e C) del gene LGALS3. NT: Cellule TPC1 non trasfettate.

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P53

Nella figura 5.15 sono riportati i risultati relativi all’espressione di p53.

Figura 5.15: Western Blot di p53 negli estratti proteici ottenuti da cellule TPC1 trasfettate con le due

varianti alleliche (A e C) del gene LGALS3. NT: Cellule TPC1 non trasfettate.

Figura 5.16: Istogramma rappresentante la media e la deviazione standard dei valori ottenuti

dall’analisi densitometrica delle bande relative alla proteina “p53” nei tre campioni “A” e nei tre campioni “C” (bande riportate nella figura 5.15), in seguito alla normalizzazione con la β-actina.

Nonostante i risultati ottenuti in Real Time qPCR abbiano mostrato un lieve aumento (1,61 volte) dell’ espressione del gene TP53 nelle cellule trasfettate con il plasmide “pDREAM 2.1 c.191 C” , che non ha raggiunto la significatività, dall’analisi in Western Blot, si può osservare piuttosto chiaramente che la trasfezione con la variante C determina un aumento di espressione di p53 di 3,2 volte rispetto alla variante A.

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CAPITOLO 6

DISCUSSIONE

Il tumore della tiroide è una neoplasia maligna relativamente rara; tuttavia rappresenta la neoplasia più comune del sistema endocrino (Kilfoy et al., 2009). La presenza concomitante di fattori ambientali e fattori genetici determina il superamento del valore soglia della suscettibilità e di conseguenza la manifestazione della condizione patologica; tali caratteristiche spiegano il carattere multifattoriale dei tumori e, tra questi, del carcinoma tiroideo. La costituzione genetica individuale può essere intesa come un complesso intreccio di loci polimorfici che possono alterare il normale funzionamento di geni implicati in processi cellulari determinanti, che influenzano la risposta cellulare alla dose di cancerogeni a cui un individuo è sottoposto.

Numerosi sono gli studi di associazione che hanno dimostrato l'effetto di tali polimorfismi sull'insorgenza del carcinoma tiroideo differenziato (DTC). Il polimorfismo rs4644 nel gene LGALS3 che si traduce nella sostituzione nucleotidica citosina>adenina al nucleotide 191 della sequenza codificante e quindi nella sostituzione amminoacidica prolina>istidina al residuo 64 della proteina galectina-3 è stato analizzato mediante analisi di associazione statistica in uno studio caso- controllo effettuato nel nostro laboratorio e poi rivisitato dal punto di vista funzionale nella presente tesi.

Sebbene alcuni dati riportati in letteratura mostrino risultati discordanti per quanto concerne l’associazione tra il polimorfismo in esame e il rischio di sviluppare neoplasie, lo studio effettuato nel nostro laboratorio, dal quale siamo partiti per intraprendere il nostro studio di analisi funzionale, ha evidenziato un ruolo protettivo dell'allele A (OR=0,66; IC 95% 0,46-0,93) e quindi un aumento consistente della suscettibilità nel caso sia presente la forma allelica “C”. I risultati discordanti sul ruolo protettivo o predisponente del polimorfismo in questione, nelle diverse

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neoplasie, possono essere ricondotti al fatto che l’espressione del gene LGALS3 viene regolata in modo differente nei diversi tipi cellulari (Takenaka et al., 2004 (a)). Per quanto concerne lo studio funzionale condotto in vitro su cellule TPC1, è emerso che le due varianti del gene LGALS3 prese in considerazione hanno un diverso ruolo nel modulare l'espressione di alcuni geni target, come evidenziato dagli studi condotti con l’ausilio della Real-Time qPCR e del saggio della doppia luciferasi. Inoltre, l’andamento relativo all’analisi di espressione dei geni MDM2 e P21, evidenziato con le due tecniche precedenti, è stato comprovato qualitativamente da studi successivi effettuati con la tecnica del Western Blot. Un risultato di particolare rilievo si è avuto per il gene CDKN1A (P21), per il quale abbiamo riscontrato un aumento trascrizionale, ma anche un lieve aumento a livello proteico, nelle cellule TPC1 trasfettate con il plasmide “pDream 2.1 LGALS3 c.191C”.

Il gene CDKN1A (P21) mappa sul cromosoma 6 codifica per l’inibitore 1 di una kinasi ciclina dipendente. P21 fu originariamente descritto come un potente regolatore negativo della progressione del ciclo cellulare in quanto inibisce l’azione del complesso ciclina-kinasi ciclina dipendente (Brugarolas et al., 1999), tuttavia più recentemente gli è stato riconosciuto un ruolo determinante anche nei processi di apoptosi, trascrizione e riparazione del DNA. L’inibizione dell’apoptosi ad opera di p21, funzione che gli conferisce l’accezione di oncogene oltre a quella già riconosciuta di oncosoppressore, si esplica principalmente grazie all’interazione di p21 con una serie di proteine pro-apoptotiche quali pro-caspasi 3, caspasi 8, e ASK1 o inducendo l’arresto del ciclo cellulare in seguito all’interazione con i complessi ciclina A-CDK2 e ciclina E-CDK2 (Gartel & Tyner, 2002). Nonostante il suo ruolo nella proliferazione del ciclo cellulare e la sua abilità nel promuovere il differenziamento e la senescenza cellulare studi recenti suggeriscono che sotto certe condizioni p21 può promuovere la proliferazione cellulare e l’oncogenicità (Roninson, 2002). Ne consegue che tale gene è spesso deregolato nei tumori umani ed evidenze sperimentali, a seconda delle circostanze e del contesto cellulare, mostrano che p21 può agire sia come soppressore tumorale che come oncogene. In accordo con i risultati da noi riportati p21 è sovraespresso in una varietà di tumori umani come il tumore della prostata o del polmone e in molti casi l’upregulation di

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p21 correla positivamente con il grado del tumore, l’invasività e l’aggressività (Abbas & Dutta, 2009).

Anche in uno studio condotto da Akslen e Varhaug nel 1995 era stato dimostrato che l’espressione della proteina p21 era aumentata in pazienti con PTC e metastasi ai linfonodi. Inoltre, ulteriori studi hanno dimostrato che p21 è correlato ad una maggiore aggressività del tumore in PTC, in quanto la sua espressione era significativamente più elevata in casi fatali (Basolo et al., 1994). Possiamo supporre che, con molta probabilità, l’aumentata trascrizione del gene CDKN1A evidenziata mediante Real-Time PCR sia dovuta ad una regolazione indiretta ad opera della Galectina-3. Era stato mostrato infatti il ruolo di tale proteina nell’incrementare o stabilizzare il legame di specifici fattori di trascrizione a elementi in cis presenti nel promotore del gene che codifica per la ciclina D1 e tra questi i siti CRE e SP1 (Lin et al., 2002). La presenza di tali siti in molte sequenze promotrici fa presuppore il ruolo di gal-3 nella regolazione della trascrizione di un gran numero di geni quali la ciclina

A, p21WAF1/CIP1 and p27KIP1 (Kim et al., 1999). I nostri risultati, quindi, potrebbero essere spiegati secondo questo meccanismo. Inoltre c’e’ da aggiungere che Gal-3 potrebbe anche agire con meccanismi post-trascrizionali nel modulare l’attivita’ di p21. Infatti in uno studio effettuato nel 2012 da Wang e collaboratori (2012) è stata evidenziata un’associazione tra i livelli della proteina galectina-3 e i livelli di espressione della proteina p21 in cellule umane di tumore alla prostata. In quello studio era stato evidenziato che una sovraespressione della galectina-3 fosse in grado di aumentare la stabilità di p21 attraverso il carbohydrate-recognition domain (figura 5.1).

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Si può ipotizzare, dunque, che individui con genotipo C/C nel gene LGALS3 avrebbero un aumento dell’attivita’ trascrizionale di p21 e di altri geni target recanti siti di legame per CREB e Sp1 al promotore, con potenziali conseguenze per il rischio di insorgenza del carcinoma papillare tiroideo.

Un altro risultato interessante è emerso dai dati relativi all'analisi d'espressione del gene MDM2, posizionato sul braccio lungo del cromosoma 12, importante per la regolazione della proliferazione sia delle cellule normali, sia di quelle cancerose. Il prodotto di questo gene, infatti, è una ubiquitina-ligasi con localizzazione nucleare, il cui target principale è rappresentato dalla proteina p53, fondamentale per l'inibizione della proliferazione cellulare, l'induzione dell'apoptosi e il mantenimento dell'integrità del genoma. In condizioni normali, Mdm2 attacca molecole di ubiquitina alla proteina p53 che, una volta ubiquitinata, viene portata fuori dal nucleo e degradata dal proteasoma: i livelli dell’oncosoppressore p53 devono essere mantenuti, infatti, a bassi livelli nelle cellule normali.

Si è visto, in accordo con i nostri risultati, che MDM2 è un oncogene espresso ad elevati livelli in un gran numero di tumori umani (Rayburn E et al., 2005); inoltre numerosi studi hanno dimostrato che una sovraespressione di MDM2 è associata a tumori con un più elevato grado di invasività, in stadi più avanzati, aventi una maggiore potenzialità metastatica e una più elevata resistenza ad agenti chemioterapici e radiazioni (Rayburn ER et al., 2009).

Dalle analisi sperimentali condotte da Xiaofeng Chen e collaboratori nel 2013 si è concluso che Mdm2 svolge un ruolo chiave nel processo invasivo e metastatico del carcinoma al polmone grazie alla degradazione della matrice extracellulare che circonda le cellule tumorali: Mdm2 stimola l’espressione della proteina MMP9 (matrix metalloproteinase 9) che degrada i componenti della matrice extracellulare, in maniera dose-dipendente.

Si può ragionevolmente pensare che la galectina-3 recante la variante “C”, che risulta maggiormente espressa nei casi rispetto ai controlli, sia implicata in un aumento dell’espressione del gene MDM2, il quale da una parte può agire inibendo e degradando la proteina soppressore-tumorale p53, favorendo in tal modo la

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progressione del tumore, dall’altra può indurre l’espressione di altre proteine come MMP9, che spiegano parzialmente la capacità invasiva e metastatica del tumore. Un discorso particolare merita p53. I risultati indicano che il livello dell’mRNA di TP53 non varia particolarmente in seguito a trasfezione con LGALS3 “A” o LGALS3 “C”, tuttavia si osserva un aumento della quantità di proteina solo in seguito a trasfezione con LGALS3 “C”, mentre la trasfezione con il plasmide esprimente la variante “A” del gene produce livelli di proteina p53 simili al non trasfettato. In un recente lavoro (Wang et al., 2014) era stato dimostrato che le galectine ricombinanti appartenenti al nematode parassita Haemonchus contortus erano in grado di legarsi alla membrana delle cellule mononucleate del sangue periferico di capra (PBMC) e di attivare specifici pathway e inibirne altri. Tra le vie inibite vi è il pathway dell’ubiquitina-proteasoma. In questo studio è stata evidenziata, infatti, una downregolazione di PSMA1 (subunità core del proteasoma 20S) nei PBMC trattati con le galectine ricombinanti. Possiamo quindi concludere che con molta probabilità l’espressione del gene TP53, a livello trascrizionale, non venga particolarmente alterata dalla trasfezione con l’una o l’altra variante allelica e che il più alto livello di proteina in presenza della variante “C” sia ascrivibile in larga parte all’inibizione del pathway dell’ubiquitina-proteasoma.

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