Materiali e metod

7.1.1 Preparazione del campione

Nel mese di Ottobre 2011 sono stati raccolti, a maturazione ultimata e presso l’azienda Miceli srl, i frutti di peperoncino delle venti cultivar (Vedi Tabella generale nel capitolo introduttivo).

I frutti sono stati esaminati al fine di eliminare eventuali residui di polvere e/o insetti. Tutte le varietà hanno ricevuto un quantitativo simile di acqua ed di fertilizzante e sono stati raccolti completa maturazione. La procedura di digestione in vitro è stata eseguita secondo il metodo di Aherne et al. (2009). Tutte le operazioni di lavorazione dei campioni, sono state eseguite in laboratori dotati di luce gialla, così da minimizzare l’eventuale foto-decomposizione dei carotenoidi.

Essendo lo scopo del presente lavoro di dottorato quello di approfondire le conoscenze sull’effetto dei metodi di processazione tipici della tradizione calabrese, i frutti sono stati analizzati, oltre che allo stato crudo (fresco), anche dopo averli sottoposti a tre metodi di processazione: cottura, congelamento e essiccazione. La procedura di cottura è stata eseguita immergendo i peperoncini in acqua bollente e cuocendoli per dieci minuti; al fine di simulare i l tipico metodo tradizionale e domestico di conservazione dei peperoncini tramite l’utilizzo della basse temperature si è proceduto al congelamento in un tipico freezer domestico (-20°C) per un periodo di mesi; mentre come metodo di essiccazione i peperoncini sono stati essiccati al sole secondo la metodologia tradizionale. Questo tradizionale metodo di conservazione degli alimenti consiste nel lasciare all’aria aperta e al sole i peperoncini freschi e lasciarli appesi a un

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filo per un mese e fino a completa essiccazione. I frutti sono infilati e appesi interi e intatti, con i semi ancora all’interno del frutto.

I frutti sono stati lavati con acqua distillata deionizzata e sono stati tagliati longitudinalmente in pezzettini standardizzati al fine di garantire quanto più

possibile la replicazione delle condizioni. Dopo averne pesato

approssimativamente 2 g, i frutti sono stati omogeneizzati in 5 mL di HBSS (Hank's Buffered Salt Solution).

7.1.2 Digestione in vitro

La digestione è stata eseguita aggiungendo all’omogeneizzato pepsina suina sciolta in HCl 0.1 M e acidificando con HCl 1 M fino a pH 2. Subito dopo i campioni sono stati incubati in bagnetto termostato (37°C) sotto agitazione per simulare al meglio la fase gastrica. Dopo un’ora si è innalzato il pH a 5.3 con bicarbonato di sodio e sono stati aggiunti alla soluzione i sali biliari (glicodeossicolato 0.8 mmol/L, taurodeossicolato 0.45 mmol/L e taurocolato 0.75 mmol/L), la pancreatina suina (0.08 g/mL) e l’enzima colesterolo esterasi (1U/mL). Granado-Lorencio et al. (2007a) furono i primi a introdurre l'uso della colesterolo esterasi nel modello di digestione in vitro. Infatti, loro per primi capirono l’importanza di usare questo enzima, fondamentale per scindere eventuali esteri dei carotenoidi.

Dopo aver portato il pH di ciascun campione al valore di 7.4 utilizzando NaOH il volume è stato uniformato a 20 mL aggiungendo HBSS.

Quindi, i campioni sono stati incubati per 2.5 ore in bagnetto termostatato e orbitante per altre due ore così da completare la simulazione della fase intestinale.

Cinque millilitri della soluzione risultante sono stati ultracentrifugati per 95 min al fine di isolare le micelle contenenti il materiale lipofilo. Il surnatante di ogni campione è stato raccolto con una siringa sterilizzata ed è stato filtrato per rimuovere eventuali aggregati microcristallini.

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7.1.3 Estrazione di carotenoidi e saponificazione

Una volta ottenuta la separazione delle micelle si è potuto procedere all’estrazione dei carotenoidi così da separarli dal resto della componente lipidica indesiderata, dalla clorofilla e da altre sostanze che potrebbero interferire come i prodotti di degradazione degli esteri dei carotenoidi (Olives-Barba et al., 2006; Granado et al., 2001).

L'inclusione di questo passaggio non comporta alcuna perdita di contenuto di carotenoidi (O’Sullivan et al., 2008).

Nello specifico, i campioni sono stati estratti due volte per mezzo di una soluzione esano/etanolo/acetone (50:25:25 v/v/v) e centrifugati per 5 min. Quindi si è potuto saponificare con KOH ed estrarre per mezzo di una soluzione di diclorometano/metanolo 5:1. I risultanti surnatanti sono stati rimossi, riuniti ed essiccati.

I campioni sono stati quindi congelati e conservati a -80°C sotto azoto fino al momento dell’analisi in HPLC.

La medesima estrazione è stata eseguita sul frutto prima dell’operazione digestiva, così da poter comparare il contenuto di caroteno idi prima e dopo la digestione.

7.1.4 Analisi HPLC

I vari campioni precedentemente congelati a -80°C sono stati ricostituiti sciogliendo il contenuto secco in 1 mL di soluzione di metanolo e etilacetato (MeOH/ EtOAc) 4:1. Successivamente, 20 microlitri della soluzione preparata sono stati iniettati in HPLC. Lo stumento è dotato di una colonna YMC C30 a fase inversa. I campioni sono stati fatti eluire tramite l’utilizzo di due fasi mobili costituite la prima (A) da metanolo/acqua (10 mmol/L acetate di ammonio) e la seconda (B) da Terz-metil-butil-etere (4.5 mmol/L idrossitoluene butilato, e 3.6

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mmol/L di trietilammina). Si è proceduto a una analisi in eluizione a gradiente così da permettere una ottimale separazione dei picchi dei relativi carotenoidi: 95% di A per 35° minuti, 62% di A al 36° minuto, 32% A al 39° minuto, e successivamente di nuovo a 95% di A al 45° minuto, ed, infine, 10 minuti di A al 100%. La velocità di eluizione è stata impostata ad 1 mL/min e l’analisi dei picchi è stata effettuata a 450 nm.

I risultati sono stati raccolti e analizzati mediante il software ChromQuest.

Le concentrazioni dei carotenoidi sono state calcolate confrontando i tempi di ritenzione e le aree delle rispettive curve con quelle di autentici standard di carotenoidi. Infine, grazie all’utilizzo di β-apo-8’-carotenale come standard interno si potrà correggere il valore ottenuto dal precedente calcolo così da tener conto dell’efficienza della metodica estrattiva.

7.1.5 Analisi statistica

Col termine bioaccessibilità s’intende la frazione di un nutriente disponibile per l'assorbimento da parte della mucosa dell'intestino durante la digestione umana. Essa viene quantificata calcolando la quantità di carotenoide presente nelle micelle rispetto alla quantità di carotenoide presente nel cibo crudo non digerito. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I dati sono stati espressi come media ± SEM. I risultati tra le diverse cultivar di peperoncino e tra i diversi metodi di processazione sono stati analizzati mediante il test della varianza ANOVA a due vie seguito dal test di Bonferroni come post hoc test. Queste statistiche sono state eseguite col programma Prism GraphPad versione 5.0 per Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, Stati Uniti d'America).