Materiali e metodi

Lo studio è stato svolto presso la Chungnam National University (CNU) in Corea del sud tra luglio e ottobre 2012 dopo l’approvazione del protocollo sperimentale da parte del comitato etico del CNU. Dieci cani beagle, di età compresa tra 4 e 7 anni e peso compreso tra 7 e 11kg sono stati arruolati dopo essere stati sottoposti a visita clinica completa e un esame approfondito dell’apparato cardiovascolare che ha previsto: rilevazione della pressione sistemica, esame elettrocardiografico, esame radiografico in doppia proiezione e studio ecocardiografico completo.

È stato utilizzato un protocollo randomizzato aperto a due fasi che ha previsto la somministrazione di due diversi dosaggi di farmaco in singola somministrazione giornaliera. I cani sono stati divisi in maniera casuale in due gruppi:

- Al primo gruppo (n=5) sono stati somministrati 5 mg/kg di irbesartan per os dopo previo digiuno di dodici ore prima della sperimentazione, l’acqua è stata fornita ad libitum;

- al secondo sottogruppo (n=5) sono stati somministrati 2 mg/kg di IRB per os seguendo le stesse modalità del gruppo 1.

I dosaggi di Irb sono stati determinati basandosi sia su evidenze cliniche riportate dal gruppo di Medicina Interna del CNU sia utilizzando i dosaggi riportati in bibliografia

131_{. Le capsule contenenti la quantità desiderata per ciascun soggetto, sono state}

preparate dai colleghi del gruppo di farmacologia del CNU.

Dopo tre settimane, periodo notevolmente superiore a quello di wash-out dell’Irb, la prova è stata ripetuta secondo la stessa metodica, ma invertendo i gruppi. Al primo gruppo è stato somministrato 2 mg/kg di irbesartan, al secondo 5 mg/kg, con le stesse modalità.

A partire dalla settimana precedente all’inizio dello studio i cani sono stati alimentati con cibo commerciale di mantenimento (Hill’s Science Plan) per evitare la presenza di impurità legate ai diversi tipi di mangimi nel sangue.

A ogni cane è stato inserito un catetere venoso nella vena cefalica a seguito di una lieve anestesia ottenuta con anestetico locale in pomata. I prelievi ematici (3 ml) sono stati effettuati a intervalli di tempo regolari (0; 0.5; 0.75; 1; 1.5; 2; 4; 6; 8; 10; e 24 h dalla somministrazione del farmaco). Il sangue è stato messo in provette eparinizzate e tutti i campioni sono stati centrifugate entro 30’ dal prelievo. Il plasma è stato prelevato e conservato a -80°C fino al momento dell’analisi.

Le concentrazioni plasmatiche di farmaco sono state determinate basandosi su una metodica HPLC illustrata in bibliografia11, 150_{. L’irb (>99.8% di purezza) è stato}

acquistato dalla Sigm Aldrich (St. Luis, MI, USA), Il losartan (>99.8%) dalla LCG Promochem (Milano, Italia) ed è stato usato come standard interno (IS). La valutazione della concentrazione plasmatica di Irb è stata effettuata utilizzando l’apposito strumento HPLC (LC Jasco, Como, Italia) dotato di detector fluorimetrico (FL 2020 plus); colonna Poroshell C18 (100x3.0mm diametro interno, 2.7µm dimensione delle particelle, Agilent) a una temperatura di 25°C. La fase mobile era costituita da un soluzione tampone di potassio diidrogeno fosfato a pH 4.2 (la soluzione è stata portata a valori di pH 4.2 aggiungendo gradualmente alcune gocce di trietilammina 0.06%) e ACN in rapporto percentuale 60:40, v/v; eluizione isocratica e flusso 0.3 ml/min; lunghezza d’onda di eccitazione 259nm e di emissione 385nm I dati ottenuti sono stati elaborati utilizzando il software Borwin (Jasco, Japan). La curva di calibrazione per l’analita è stata costruita utilizzando 10 differenti concentrazione comprese tra 5 e

2500ng/ml. Queste concentrazioni sono state preparate a partire da una soluzione madre di 10µg/mL di Irb disciolta in MeOh. Il limite di quantificazione (LOQ) è stato calcolato determinando il rapporto segnale-rumore ottenuto confrontando i segnali misurati su campioni contenenti concentrazioni note di Irb con quelle di campioni bianchi. Il LOQ ottenuto è stato di 10ng/mL. Il valore dell’analita era sempre inferiore o uguale al 10% (CV%) mentre l’accuratezza era maggiore del 92%.

In breve, 100µL di soluzione con IS (20µg/mL) sono stati aggiunti in provette da 15 mL contenenti 500 µL di plasma. Ai campioni vortexati sono stati aggiunti 150 µL di acido ortofosforico (1 M) e vortexati nuovamente. Successivamente sono stati addizionati 6 mL di solventi di estrazione (Et2O:CH2Cl2 in rapporto 7:3 v/v) vortexati per

30 sec, agitati per 5 min e centrifugati per 10 min a 15,625 giri. Cinque mL di sovranatante organico sono stati trasferiti in una provetta pulita da 15 mL, aggiunti 200 µL diidrossido di sodio 0.05 M a pH=11, vortexati, posti nell’agitatore per 5 min e nuovamente centrifugati per 10 min a 15,625 giri. La fase organica è stata separata dalla fase acquosa (congelata a -80°C) e successivamente acidificata con 100 µL di 0.2 M di acido ortofosforico. Aliquote di 20 µL sono state infine iniettate nel sistema HPLC-FL

Farmacocinetica

I principali parametri farmacocinetici come la concentrazione massima (Cmax) di Irb nel plasma, il tempo necessario per raggiungerla (Tmax) e l’area sotto la curva di concentrazione (AUC0) sono stati ottenuti utilizzando WinNonLin v 5.3 (Pharsight Corp). Le variazioni della concentrazione plasmatica di Irb sono state determinate grazie a un’analisi di tipo compartimentale.

Farmacodinamica

Ciascun cane, dopo ogni prelievo ematico, è stato monitorato. In particolare sono stati misurate:

- la pressione sistolica (SBP); - la frequenza respiratoria; - la frequenza cardiaca; - il colore delle mucose;

- il tempo di riempimento capillare (TRC); - la temperatura rettale.

Sono stati effettuati, inoltre, il monitoraggio della SBP utilizzando la metodica Doppler (Parks Doppler Ultrasonic Flow Detector System model 811 [NV, USA], con sonda pediatrica)172_{. La sonda Doppler è stata posizionata sull’arteria radiale}

utilizzando del gel per favorire la trasmissione, mentre il manicotto è stato posto subito sotto il gomito e insufflato a 30 mmHg al di sopra della scomparsa del suono del Doppler e poi lentamente scuffiato finché l’operatore non percepiva chiaramente il suono. A quel punto è stato letto sul manometro il valore della pressione e annotato.

La frequenza respiratoria e la frequenza cardiaca sono state valutate in un minuto, la prima osservando l’escursione toraco-addominale dei soggetti, la seconda attraverso la palpazione del polso femorale e la contemporanea auscultazione cardiaca eseguita con fonendoscopio a livello del IV-V spazio intercostale sull’emitorace sinistro. Il colore delle mucose è stato classificato come roseo, pallido, congesto e cianotico; il TRC è stato considerato normale se inferiore ai 2 secondi.

Tutti i parametri sono stati misurati dallo stesso operatore.

Analisi Statistica

I dati sono stati analizzati utilizzando GraphPad InStat (GraphPad Software) eseguendo il test ANOVA e il test di Pearson per correlare i valori dei gruppi (media ±SEM).

Le differenze sono state considerate significative per p<0.05.