Il sistema richiede la micropa- gazione in vitro sia del genotipo da analizzare, sia del fi toplasma nel suo ospite di melo. Sono sta- te pertanto predisposte colture sane di M. sieboldii, donatore di resistenza ad AP, di D2212 con- siderato altamente resistente, di H0909, incrocio derivato da M9 e dei due genotipi suscettibili GD e M9, nonché di GD infetta da AP (Ciccotti et al., Agronomy Rese- arch 6/2(2008): 445-458).
Per questo studio sono stati scelti due differenti ceppi di AP: PM6 e PM4. Germogli sani in vitro sono stati inoculati tramite microinne- sto con apici di germoglio infetti. Per ogni combinazione genotipo x ceppo sono state effettuate almeno 10 ripetizioni.
La verifi ca della qualità di innesto è stata fatta dopo 1,5 mesi e solo gli innesti per i quali si è verifi ca- ta una forte connessione di tes- suti sono stati successivamente parte aerea. Secondo la terminologia proposta da Cooper & Jones (Phytopathology, 73(1983):127- 8), i genotipi testati sono risultati resistenti a ‘Ca. Phytoplasma mali’ e tolleranti alla malattia. Sfor- tunatamente tutti gli ibridi derivati da M. sieboldii sono troppo vigorosi per essere utilizzati come vali- di portinnesti. Nell’ambito del progetto SMAP si è pertanto iniziato un nuovo programma di breeding per ottenere un portinnesto comparabile a M9 e nel contempo resistente ad AP. Sono state predisposte pertanto diverse combinazioni di incrocio tra paren- tali apomittici resistenti e M. x domestica. Tradizio- nalmente i semenzali ottenuti da breeding vengono testati, per la resistenza ad AP, inoculando il fi to- plasma tramite innesto e osservandone i sintomi in vivaio per un periodo che va dai 2 ai 5 anni. In alter- nativa a questo lavoro così impegnativo in termini di tempo, è stato sviluppato un sistema di selezione basato sull’impiego del microinnesto in vitro (Biso- gnin et al., Plant Pathology 57(2008): 1163-1171) che consente di analizzare in condizioni standardiz- zate la risposta all’infezione da parte di genotipi resistenti a confronto con controlli suscettibili.
Fig. 1 - Sintomi specifi ci di AP in vitro: sviluppo abnorme di stipole
genotipi sensibili di M. x dome- stica mostrano in vitro una cre- scita molto ridotta con elevata proliferazione di germogli, foglie di taglia ridotta e sviluppo abnor- me di stipole (Fig. 1). D’altra parte, come in vivo, il genotipo resistente D2212 non manifesta la malattia nemmeno in vitro. M. sieboldii presenta solo legge- ri sintomi e quindi rientra nella categoria di resistente, mentre H0909 manifesta un comporta- mento intermedio caratterizzato da una più elevata concentra- zione di fi toplasma (Tab.1). Nei due ceppi la concentrazione di fi toplasma è risultata signifi cati- vamente differente con un valore medio di 54528 copie di fi topla- sma/ng di DNA di melo per il cep- po PM4, a confronto del valore medio di 33292 copie per PM6. Ciò è indicativo di una diversa virulenza tra i ceppi. Il metodo può quindi essere utile per studia- subcoltivati e analizzati per con-
fermare la presenza del fi topla- sma. Sono stati osservati anche altri parametri come la qualità dell’innesto, la percentuale di trasmissione e la mortalità degli espianti a 3 mesi dall’inoculo. La concentrazione di fi toplasma è stata determinata ogni mese fi no a 12 mesi, tramite PCR quantitati- va con metodo TaqMan TM, mentre a 6 e a 12 mesi dall’innesto sono stati valutati la sopravvivenza, il tipo di crescita e la presenza di sintomi in rapporto al control- lo sano. Per questi parametri è stato quindi defi nito un apposito indice di malattia (D.I.) (Tab. 1).
Risultati
Come in campo, anche in vitro la valutazione della concentrazione di fi toplasma e una manifestazio- ne lieve o assente di sintomi sono i due elementi che consentono di individuare soggetti resistenti. I
Conclusioni e prospettive future
I risultati ottenuti con questo studio indicano che la resistenza a ‘Ca. P. mali’ può essere valutata con un sistema in vitro in grado anche di accelerare la procedura di screening per la resistenza. Questo metodo in vitro si rivela altresì interessante nel lavoro di screening quando si hanno disponibili soltanto singole piante di un genotipo, come è il caso di una progenie da incrocio. Attualmente si sta utilizzando questo metodo proprio per testare l’elevato numero di singoli genotipi deri- vati dal programma di incrocio. Il sistema in vitro messo a punto potrà essere inoltre un utile e valido strumento per studiare, in condizioni controllate, interazioni specifi che pianta-patogeno o valutare contem- poraneamente la virulenza di differenti ceppi del patogeno.
PARTE
2
| DIPARTIMENTI | DIPARTIMENTO PROTEZIONE DELLE PIANTEa espresso come n. di copie di fi toplasma/ng DNA di melo
b Indice di malattia (D.I.: Disease index) 12 mesi post inoculo: 0 = assenza di
sintomi, come il controllo sano; 1 = debole riduzione di crescita, foglie più piccole del controllo sano, 2 = riduzione di crescita, foglie piccole; 3 = forte riduzione di crescita, proliferazione, sviluppo abnorme di stipole, foglie piccole Tab. 1 - Concentrazione di fi toplasma e fenotipo dei genotipi infettati
con il ceppo PM6
Genotipo Ceppo Concentrazione del fi toplasma a 3 m.p.i.
Indice di malattia (D.I.) b 12 m.p.i.
M. sieboldii PM6 (AT2 subtype) 11289±4905 ab 1 D2212 PM6 (AT2 subtype) 6955±4477 a 0 H0909 PM6 (AT2 subtype) 16481±4905 ab 2 GD PM6 (AT2 subtype) 24702±6332 b 3 M 9 PM6 (AT2 subtype) 18162±7755 ab 2,5
re sia l’effetto tra ceppi di diffe- rente virulenza, sia le interazioni pianta-patogeno. Quest’ultimo aspetto, in particolare, si è reso evidente durante l’analisi della dinamica dell’infezione nel corso del tempo: la concentrazione del patogeno tende ad aumentare, per entrambi i ceppi nei primi 6-8 mesi (Fig. 2). Negli individui resi- stenti e suscettibili la concentra- zione di fi toplasma segue stabil- mente la stessa dinamica. Dopo questo primo periodo, la pianta reagisce attivamente e la con- centrazione del patogeno tende a decrescere e dopo un periodo di 10-12 mesi si stabilizza su valori simili a quelli riscontrati a 3 mesi p.i.. Pertanto il tempo a 3 mesi p.i. è stato individuato come il momento più adatto per misurare la concentrazione di fi toplasma e osservare il tipo di crescita della coltura per valutare la resistenza ad AP in vitro.
Fig. 2 - Dinamiche di infezione con ‘Ca. Phytoplasma mali’, ceppo PM4 e PM 6 in tutti i germogli in vitro inoculati con il rispettivo ceppo. I dati sono relativi ai prelievi effettuati mensilmente e sono espressi come media della concentrazione di fi toplasma (n. di copie di fi toplasma /ng di DNA di melo) analisi ANOVA