Un metodo innovativo

basato sulla

degradazione

dell’acido

nicotinico per

la selezione di

microorganismi

antagonisti

contro il colpo

di fuoco

I

tutto il mondo, dove causa perdite rilevanti in importanti colture come melo e pero. Può colpire tutte le parti aeree della pianta, anche se i fi ori rappresentano il principale sito d’infezione (Fig. 1). Dopo una prima fase epifi ta sullo stigma, E. amylovora raggiunge il tubo fi orale (ipanzio) dove, in presenza di una elevata popolazione e di condizioni ambientali favorevoli (alta umidità relativa e /o pioggia), l’infezione general- mente prende avvio. Per prevenirne l’introduzione in aree fi nora esenti vengono attuate costose misure di quarantena. In caso di comparsa dei primi sintomi, i materiali infetti e potenzialmente contaminati vengono prontamente rimossi e distrutti. Quando anche queste misure non sono suffi cienti per il contenimento del patogeno, il controllo della malattia può avvenire solamente attraverso l’uso di antibiotici (non autorizzati in molti stati) o in agenti di controllo con attività parziale (rame e induttori di resistenza). In questo con- testo, l’uso di microorganismi antagonisti costituisce una misura alternativa o complementare all’uso degli antibiotici. Diverse specie, principalmente Pseudomonas fl uorescens, Pantoea agglomerans e Bacillus sub- tilis, sono attive contro E. amylovora ed alcuni isolati sono già stati sviluppati come prodotti commerciali.

La selezione di nuovi agenti di biocontrollo è gene- ralmente basata sulla valutazione della loro attività di controllo in pianta, processo generalmente estre- mamente costoso e lungo. E. amylovora richiede acido nicotinico (NiAc) come fattore di crescita nei terreni di coltura. Questa necessità non è comune nel genere Erwinia ed è stata perciò proposta come test biochimico per l’identifi cazione di E. amylovo- ra. Sulla base di queste evidenze, è stato sviluppato un nuovo approccio basato sull’ipotesi che un orga- nismo capace di eliminare o ridurre il contenuto in NiAc potrebbe effi cacemente inibire la crescita del patogeno e perciò controllare il colpo di fuoco. Quest’approccio ha permesso di selezionare come potenziali agenti di biocontrollo solamente i micror- ganismi capaci di degradare NiAc (nel nostro caso circa il 10% dei 2000 isolati raccolti da fi ori di melo e pero), riducendo così drasticamente il numero di candidati da testare successivamente. Il secondo passo consisteva nella selezione, tra questi ultimi, degli isolati caratterizzati da più rapida crescita. Sono stati quindi selezionati sei isolati per la valu- tazione di effi cacia in vitro e tra questi JAN è stato scelto come candidato fi nale.

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JAN ha evidenziato alta omologia di sequenza (16S rDNA) con Pseudomonas rhizosphaerae IH5. Non è risultato produrre composti antimicrobici attivi contro E. amylovora in vitro. Non cresce a 35°C e a 37°C (temperatura corporea), suggerendo assen- za di patogenicità per l’uomo. Queste proprietà potrebbero velocizzare e favorire la sua registrazio- ne come biofungicida, evitando costosi studi altri- menti necessari (es. in Pantoea agglomerans). L’ef- fi cacia di P. rhizosphaerae JAN contro E. amylovora è stata comparata a quella di P. fl uorescens A506, un antagonista disponibile in commercio (BlightBan A506®_{) incapace di degradare l’NiAc, e a quella di P.} Figura 2

fl uorescens TN5, un microrganismo la cui capacità di degradare NiAc è stata ben descritta, ma mai pro- vato contro il colpo di fuoco. I tre microganismi sono stati inoculati su fettine di pere immature (Fig. 2) 24 h prima del patogeno e testati a tre diverse concentrazioni (107_{, 10}6_{, or 10}5 _{cfu/ml). Dopo set-} te giorni di incubazione, P. rhizosphaerae JAN ha mostrato un’effi cacia maggiore del 90% nel control- lare il colpo di fuoco a tutte e tre le concentrazioni usate. P. fl uorescens A506 e TN5 hanno mostrato livelli di effi cacia similari a quelli di P. rhizosphae- rae JAN quando usati alle due maggiori concentra- zioni, ma i valori erano nettamente inferiori se usati a 105 _{cfu/ml. P. rhizosphaerae JAN ha mantenuto la} stessa effi cacia dopo 7, 9 e 12 giorni di incubazione, indicando una persistente attività di biocontrollo, mentre P. fl uorescens A506 e TN5 hanno perso effi - cacia nel tempo quando usati alla concentrazione minore. Inoculati in fi ori di melo, i tre microrgani- smi sono cresciuti esponenzialmente nelle prime 24 h e hanno raggiunto la popolazione massima dopo 48 h, dimostrandosi validi colonizzatori dell’ipanzio di fi ori di melo (Fig. 3). La presenza contempora- nea del patogeno non ha alterato statisticamente la crescita dei tre microganismi. Inoculati 24 h prima del patogeno, P. rhizosphaerae JAN e P. fl uorescens A506 hanno controllato effi cacemente la crescita di E. amylovora, mentre nei fi ori non trattati la popo- Fig. 2 - Fettine di pere immature

inoculate con Erwinia amylovora (A) e pre-trattate con JAN (B) Fig. 3 - Popolazione di

Pseudomonas rhizosphaerae JAN, P. fl uorescens A506 e P. fl uorescens TN5 in fi ori di melo

Fig. 4 - Popolazione di Erwinia

amylovora in fi ori di melo dopo trattamento con Pseudomonas rhizosphaerae JAN, P. fl uorescens A506 e P. fl uorescens TN5 Fig. 5 - Effi cacia dell’agente di biocontrollo Pseudomonas rhizosphaerae JAN e del ceppo di riferimento P. fl uorescens A506, in esperimenti condotti su piante di melo in condizioni controllate

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lazione del patogeno è cresciuta rapidamente fi no a raggiungere 3.9 × 106 _{ufc/fi ore dopo 48 h. Anche P.} fl uorescens TN5 ha mostrato capacità di sopprimere la crescita di E. amylovora seppur in maniera ridot- ta rispetto a P. rhizosphaerae JAN e P. fl uorescens A506 (Fig. 4). L’effi cacia di P. rhizosphaerae JAN e P. fl uorescens A506 è stata in seguito determina- ta in esperimenti condotti su piante di melo (cv. Gala) in serra da quarantena. Gli esperimenti sono stati condotti a una temperatura di 18 ± 6 °C, corri- spondente alle normali fl uttuazioni di temperatura

L’effi cacia di P. rhizosphaerae JAN nel controllare il colpo di fuoco in diverse varietà di melo e pero potrebbe essere diretta- mente correlata con il conte- nuto di NiAc presente a livello dell’ipanzio del fi ore. Allo stesso modo, la suscettibilità tra ospi- ti e non-ospiti, come pure tra diverse varietà di melo e pero, potrebbe dipendere dalla pre- senza e/o differente concen- trazione di NiAc nell’ipanzio. Al momento non sono disponibili metodi per la determinazione di NiAc contenuto in fi ori di melo e pero, perciò successivi studi saranno condotti per la delucida- zione di quest’aspetto. Prossimo passo nello sviluppo commercia- le di P. rhizosphaerae JAN sarà la conferma della sua effi cacia in condizioni di campo, attraver- so prove da eseguire in diverse località e con diverse condizioni ambientali.

Figura 5

presenti durante il periodo della fi oritura del melo e del pero in Trentino e Svizzera. P. rhizosphaerae JAN ha mostrato un’effi cacia costante in tutti tre gli esperimenti (Fig. 5), indicando la sua validità come antagonista contro il colpo di fuoco in aree come il Trentino (Italia settentrionale) e Svizzera.

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