Microscopia Ottica

Per le varie analisi condotte in microscopia ottica, le cellule sono state inizialmente fissate con paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M, pH 7,3 e, dopo alcuni lavaggi, sono state destinate alla colorazione con ematossilina-eosina o a specifiche reazioni immunocitochimiche.

5.4.1 Analisi della vitalità cellulare dopo fissazione

Per validare ulteriormente l’analisi della vitalità cellulare ottenuta in cellule non fissate con il metodo del Trypan blu, la conta cellulare è stata eseguita, anche dopo fissazione, in microscopia ottica. In particolare, sono state utilizzate sia cellule colorate con E/E, sia cellule evidenziate con il colorante nucleare DAPI. La conta delle cellule è stata eseguita all’ingrandimento di 20x, spostando manualmente il piatto del microscopio, in modo da analizzare l’intera superficie del vetrino, contando le cellule presenti al suo interno.

Per ogni gruppo sperimentale i valori ottenuti sono stati espressi come numero medio ± SEM di cellule rilevate da ciascun tipo di colorazione in tre esperimenti indipendenti.

5.4.2 Colorazioni istologiche con Ematossilina-Eosina

La colorazione istologica con ematossilina-eosina (E/E) prevede l’utilizzo di due coloranti. Il primo è un colorante basico, l’emallume di Mayer (Carlo Erba Reagents; Milano Italia), che è affine alle componenti cellulari basofile (acidi nucleici, proteine di membrana, membrane cellulari). Grazie a questa sua proprietà, permette di evidenziare prevalentemente i nuclei delle cellule, che appaiono di un colore blu violaceo e i profili del reticolo endoplasmatico rugoso, ricchi di ribosomi. L’eosina (Sigma) è invece un colorante acido, affine alle componenti cellulari acidofile (proteine mitocondriali, fibre collagene) e permette di evidenziare i componenti acidofili sia intracellulari che extracellulari, che appaiono di colore rosa-fucsia. Le cellule sono state inizialmente incubate con emallume per circa 10-15 minuti; rimosso l’eccesso di colorante mediante un lavaggio in acqua corrente per un tempo corrispondente al tempo di incubazione con l’emallume, le cellule sono state incubate con l’eosina per circa 1-3 minuti. In questo caso l’eccesso di colorante è stato rimosso mediante brevi lavaggi in acqua distillata

(3x5 min). Infine, le cellule sono state disidratate mediante passaggi in alcol a concentrazione crescente (etanolo 80%, etanolo 96% e etanolo 100%, xilolo). Quindi i vetrini sono stati estratti dai pozzetti e montati con balsamo DPX (Sigma) su vetrini portaoggetto per la successiva analisi al microscopio ottico (Nikon Eclipse 80i; Giappone), dotato di telecamera equipaggiata del software Nis Element (Nikon; Giappone) per l’analisi d’immagine.

5.4.3 Analisi morfometrica

L’analisi morfometrica in seguito al trattamento con rapamicina è stata condotta su cellule U87MG colorate con E/E.

Gli effetti morfometrici analizzati sono stati: la morfologia cellulare, il numero dei prolungamenti cellulari e la loro lunghezza. In particolare:

- la morfologia cellulare è stata valutata tenendo conto della forma prevalente del corpo cellulare osservata in ciascun gruppo sperimentale;

- il numero dei prolungamenti cellulari è stato misurato osservando, per ogni vetrino, campi successivi e non sovrapposti ad ingrandimento 20x, fino all’osservazione completa del vetrino stesso. Dopo aver contato, all’interno di ogni campo microscopico, i processi cellulari e le cellule totali, il valore finale è stato espresso come numero medio ± SEM di prolungamenti per cellula;

- la lunghezza dei prolungamenti è stata misurata utilizzando il plugin NeuronJ del software ImageJ, appositamente elaborato per misurare strutture allungate come assoni e altri prolungamenti cellulari. Ogni vetrino è stato osservato all’ingrandimento di 20x in modo da ottenerne l’analisi completa attraverso la successione di campi microscopici non sovrapposti. Le immagini RGB ottenute sono state convertite in immagini in scala

di grigi per essere successivamente analizzate con NeuronJ. I valori sono stati espressi come lunghezza media (in m) ± SEM dei prolungamenti per cellula.

I valori finali rappresentano la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.

5.4.4 Immunoistochimica

Le cellule U87MG sono state sottoposte a reazioni immunocitochimiche eseguite con la tecnica dell’immunofluorescenza. Dopo la fissazione, le cellule sono state incubate con Triton X-100 (Sigma) allo 0,1% e successivamente con una soluzione di siero bloccante (normal goat serum, Vector Laboratories; Burlingame, CA USA) al 10% in tampone fosfato per 1 ora a temperatura ambiente; quindi le cellule sono state incubate overnight a 4°C con la soluzione contenente l’anticorpo primario sciolto in PBS. Le soluzioni di incubazione contenevano i seguenti anticorpi primari:

- rabbit anti-nestina (Abcam; Cambridge, UK) alla diluizione di 1:300; - mouse anti-βIII tubulina (Abcam) alla diluizione di 1:400;

- rabbit anti-GFAP (proteina fibrillare acida della glia) (Sigma) alla diluizione di 1:400; - mouse anti-α-sinucleina (BD Bioscience; NJ USA) alla diluizione di 1:100.

Il giorno seguente, le cellule sono state incubate con una soluzione contenente l’anticorpo secondario anti-mouse AlexaFluor 488 (verde, Life Technologies; CA USA) alla diluizione di 1:200 in PBS per rilevare l’anticorpo primario anti-βIII tubulina e anti- α sinucleina, l’anticorpo secondario anti-rabbit Cy2 (verde, Vector Laboratories) alla diluizione di 1:200 per rilevare l’anticorpo primario anti-nestina e, infine, l’anticorpo secondario anti-rabbit Cy3 (rosso, Vector Laboratories) alla diluizione di 1:400 per rilevare l’anticorpo primario anti-GFAP. Dopo lavaggio con PBS, le cellule sono state incubate con una soluzione di DAPI (blu, Sigma) diluito 1:1000 in PBS. I vetrini sono stati estratti dalla piastra, montati con fluoroshield (Sigma) ed osservati al microscopio

ottico Nikon Eclipse 80i dotato di lampada a fluorescenza e filtri in grado di selezionare la lunghezza d’onda alla quale eccitare ogni specifico fluoroforo. Le immagini mostrano una fluorescenza doppia, corrispondente all’anticorpo secondario (rosso o verde) e al DAPI (blu), ottenuta mediante un merge delle singole immagini di immunofluorescenza.

5.4.5 Quantificazione dell’immunopositività in microscopia

ottica

Allo scopo di quantificare l’immunopositività delle cellule U87MG per ciascun antigene in seguito al trattamento con rapamicina, ogni vetrino è stato osservato al microscopio ottico a fluorescenza all’ingrandimento 20x analizzando campi successivi e non sovrapposti, fino all’osservazione completa del vetrino stesso. All’interno di ogni campo microscopico sono stati contati sia il numero totale di cellule positive per ciascun anticorpo che il numero totale di nuclei (DAPI-positivi). In questo modo, per ogni gruppo sperimentale è stata calcolata la percentuale di cellule positive rispetto al totale delle cellule presenti. Il valore finale rappresenta la media ± SEM di tre esperimenti indipendenti.