Ottimizzazione delle condizioni di reazione on line post colonna.

Per ottimizzare la determinazione on-line dell’attività delle frazioni di GGT sierica separate in cromatografia liquida si è operato in flow injection, omettendo la colonna cromatografica dall’apparto descritto in figura 3.2.

Ciò permette di realizzare velocemente una valutazione della reazione e del rapporto segnale/rumore nelle varie condizioni di lavoro esplorate. In questa fase e’ stato utilizzato un preparato commerciale di GGT bovina.

Le condizioni di lavoro studiate hanno previsto l’ottimizzazione dei seguenti parametri:

i) concentrazione dell’accettore GlyGly nell’intervallo da 1 a 20 mmol/l; ii) concentrazione del substrato γGluAMC nell’intervallo da 0.1 a 50

µmol/l;

iii) materiale e dimensioni della spira di reazione; iv) durata e temperatura di reazione post-colonna.

4.1.1. Ottimizzazione della concentrazione di substrato

In questa parte del lavoro di tesi si e’ variata la concentrazione di γGluAMC a partire dalla concentrazione comunemente usata in letteratura (50 µM) al fine di ottimizzare il rapporto segnale/rumore.

Tabella 4.1

Condizioni di lavoro Valore Flusso in colonna

(HPLC) 0.5 ml/min

Flusso della pompa d’iniezione post-colonna

0.5 ml/min

Spira di rezione PFA, 0.75 mm id; V=2.6 ml Temperatura della

reazione 37°C

Concentrazione di GlyGly

20 mM

La Figura 4.1. mostra l’andamento dell’area del picco della GGT bovina iniettata in flow injection al variare della concentrazione del substrato nell’intervallo 50 -0.1 µM. y = 2,4293x + 5,4835 R2 = 0,9832 0 20 40 60 80 100 120 140 0 10 20 30 40 50 60 concentrazione substrato ( uM ) area del pi cc o

Fig 4.1. Andamento dell’area del picco della GGT bovina (concentrazione iniettata 10 mU/ml) in flow injection al variare della concentrazione del substrato nell’intervallo 50 -0.1 µM.

La concentrazione di GGT bovina scelta pari a 10 mU/ml rappresenta un valore compreso nell’’intervallo fisiologico (5-50 U/l). La GGT bovina e’ stata di volta in volta diluita nel tampone impiegato per l’eluizione (tampone sodio fosfato 0.1 M, NaCl 0.2 M, EDTA 0.5 M, GlyGly 20 mM pH 7.4).

La deviazione standard riportata in Figura 4.1 per ogni concentrazione di substrato e’ stata calcolata dall’analisi di un numero di iniezioni ≥ 4.

I dati mostrano che l’area del picco dipende linearmente dalla concentrazione del substrato con coefficiente di regressione R2 = 0.9832 nel range esplorato.

4.1.2. Curve di calibrazione della GGT bovina a varie concentrazioni di γ-glutammil- 7 amido-4 metilcumarina.

Per due concentrazioni di γgluAMC (3 e 30 µM), inferiori a quella comunemente impiegata in letteratura (50 µM), sono state realizzate curve di calibrazione della GGT bovina nell’intervallo 0.5 - 30 mU/ml. Anche in questo caso la deviazione standard e’ stata calcolata su un numero di repliche ≥ 4 per ogni diversa concentrazione di GGT bovina.

La Figura 4.2 mostra per entrambe le concentrazioni di substrato impiegate l’area del picco ottenuto in flow injection in funzione della concentrazione di GGT iniettata (mU/mL).

y = 8,5749x - 8,258 R2 = 0,987 y = 1,6503x - 2,8102 R2 = 0,9673 -50 0 50 100 150 200 250 300 350 0 10 20 30 40 concentrazione GGT ar e a med ia substrato 3 uM substrato 30 uM

Fig 4.2. Curve di calibrazione della GGT bovina a due diverse concentrazione di substrato (3 e 30 μM).

In presenza di una concentrazione di substrato pari a 30 µM la sensibilita’, ovvero la pendenza della curva di calibrazione, e’ maggiore (8.5749 unita’ di fluorescenza ×min×mL×mU-1_{) rispetto ad una bassa concentrazione di substrato}

(1.6503 unita’ di fluorescenza×min×mL×mU-1_{). Tuttavia, per elevate}

concentrazioni di substrato e di GGT si osserva un aumento del coefficiente di variazione CV% = 10,12 dove CV% = SD/area del picco*100.

4.1.3. Ottimizzazione della concentrazione dell’accettore, GlicilGlicina (GlyGly).

L’ottimizzazione della concentrazione di GlyGly e’ stata realizzata nelle condizioni operative indicate in Tabella 4.2.

Tabella 4.2

Condizioni di lavoro Valore Flusso in colonna

(HPLC) 0.5 ml/min

Flusso della pompa d’iniezione post- colonna

0.5 mL/min

spira di rezione PFA, 0.75 mm id; V=2.6 ml Temperatura della

reazione

37°C Concentrazione di

substrato 30 μM

In questa fase di ottimizzazione si e’ lavorato con una fase eluente priva di GlyGly e diverse concentrazioni di accettore sono state aggiunte nella soluzione di γGluAMC in tampone Tris-Hcl, 0.25 M, pH 8.5 proveniente dalla pompa d’iniezione.

La Figura 4.3. mostra l’andamento dell’area del picco della GGT in funzione della concentrazione di GlyGly pari a 20 mM, 10 mM, 4.5 mM, 2 mM, 1 mM, dove 20 mM e’ la concentrazione comunemente impiegata in letteratura.

Rapporto Gly2 - aree 0 100 200 300 400 500 600 700 0 5 10 15 20 25 Gly2 uM Ar e a

Fig 4.3. Andamento dell’area del picco della GGT bovina iniettata in flow injection (10 mU/ml) e la concentrazione di glicilglicina.

La Figura 4.3 mostra che il segnale si mantiene costante nell’intervallo 4.5-20 mM e, pertanto, 4.5 mM è la minima concentrazione di accettore necessaria per ottenere il massimo segnale. La concentrazione dell’accettore scelta è stata pari a 4.5 mM.

4.1.4. Ottimizzazione della spira di reazione.

Alla luce dei risultati ottenuti si e’ passati ad ottimizzare la spira di reazione al fine di ottenere il miglior rapporto segnale/rumore nelle condizioni operative indicate in tabella 4.3. I parametri valutati sono stati il diametro e il materiale della spira.

Tabella 4.3

Condizioni di lavoro Valore Flusso in colonna (HPLC) 0.5 ml/min Flusso della pompa

d’iniezione post-colonna 0.5 mL/min Concentrazione di GlyGly 4.5 mM Temperatura della reazione 37°C Concentrazione di

substrato 3 μM

Sono stati impiegati due tipi di loop, entrambi con volume di 2.6 ml, uno in perfluoroalcossietilene (PFA) con diametro di 0.75 mm e in polietereterchetone (PEEK) con diametro 0.5 mm.

Il PFA essendo un materiale flessibile permette di intrecciare il loop formando una “catenella” (knitted) che migliora il mescolamento e controlla l’allargamento di banda dovuto alla diffusione.

Per entrambi i tipi di loop e’ stata realizzata una curva di calibrazione della GGT bovina (0.5, 1, 3, 5, 10 mU/ml).

Mentre nell’ottimizzazione dei precedenti parametri l’andamento dell’area del picco e del rapporto segnale/rumore era paragonabile (ovvero il rumore della linea di base non e’ influenzato significativamente dai parametri esplorati), la geometria della spira di reazione influenza significativamente il rumore della linea di base e, quindi, il rapporto segnale/rumore.

La Figura 4.4a e 4.4.b mostra le curve di calibrazione della GGT bovina ottenute con le due spire riportando in ordinata il rapporto segnale/rumore e l’area del picco, rispettivamente. Il rapporto segnale/rumore e’ stato calcolato

dal rapporto dell’altezza del picco ottenuto in flow injection e l’altezza picco- picco della linea di base.

I dati mostrano che a parita’ di area del picco il rumore e’ significativamente piu’ elevato utilizzando la spira in PEEK. Questo e’ verosimilmente attribuito ad un peggior mescolamento causato dal diametro inferiore e dalla geometria “not-knitted”.

Fig 4.4. Curve di calibrazione della GGT bovina ottenute con spira di reazione in PFA (0.75 mm id) e in PEEK (0.5 mm id). a) rapporto segnale/rumore in funzione

0 2 4 6 8 1 0 0 5 1 0 1 5 2 0 Area Pi cco A t t iv it à G G T ( m U / m l) 0 . 7 5 m m 0 . 5 m m 0 2 4 6 8 1 0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 Rapp orto Seg nale / Rumo re A t t iv it à G G T ( m U / m l) 0 . 7 5 m m 0 . 5 m m

4.1.5. Ottimizzazione della durata della reazione post-colonna

Nelle condizioni operative riportate in Tabella 4.4 e’ stato variato il flusso della pompa di iniezione post-colonna al fine di esplorare diversi tempi di reazione, fissato il flusso della pompa HPLC a 0.5 ml/min.

La concentrazione del substrato nella riserva della pompa e’ stata variata opportunamente cosi’ da realizzare nella spira di reazione sempre la medesima concentrazione.

All’aumentare del tempo di incubazione post-colonna la GGT bovina viene rivelata con maggior sensibilita’, come dimostrato dall’aumento lineare dell’area del picco (R2 = 0.985; substrato 3 µM. R2 = 0.966; substrato 1 µM) . Sulla base dei risultati ottenuti e’ stato scelto un flusso della pompa d’iniezione post-colonna paria 0.1 ml/min

Tabella 4.4

Condizioni di lavoro Valore Flusso in colonna (HPLC) 0.5 ml/min Concentrazione di GlyGly 4.5 mM Temperatura della reazione 37°C Concentrazione di substrato 1 e 3 μM

spira di rezione PFA, 0.75 mm id; V=2.6 ml

La Figura 4.5. mostra l’andamento dell’area del picco (valore medio ±SD, N=5) in funzione del tempo di reazione in minuti.

y = 29,036x - 38,26 R2 = 0,985 y = 21,099x - 36,215 R2 = 0,9666 0 20 40 60 80 100 2 2,5 3 3,5 4 4,5 tempo (min) ar ea m e d ia substrato 1 uM substrato 3 uM

Fig 4.5. Andamento dell’area del picco della GGT bovina (10 mU/mL) (valore medio ±SD, N=5) in funzione del tempo di reazione in minuti.

.

4.1.6. Curva di calibrazione in flow injection della GGT bovina nelle condizioni ottimizate

La tabella 4.5 riassume le condizioni di lavoro ottimizzate e impiegate per la rivelazione delle frazioni di GGT separate cromatograficamente

Tabella 4.5

Condizioni di lavoro valore Flusso in colonna (HPLC) 0.5 ml/min Flusso della pompa

d’iniezione post-colonna

0.1 mL/min Temperatura della reazione 37°C

Concentrazione di substrato 1-30 μM

spira di rezione PFA, 0.75 mm id; V=2.6

Adottando queste condizioni e’ stata realizzata la curva di calibrazione della GGT bovina per due concentrazioni di substrato (1 e 30 μM). L’intervallo in cui è stata valutata la linearità è 0.5 – 100 U/l per il substrato 1μM e 0.5 – 150 U/l per il substrato 30 μM. Per ogni concentrazione sono state effettuate un numero di iniezioni ≥ 4. In Figura 4.6 sono riportate le curve di calibrazione della GGT ottenute in flow injection per le due concentrazioni di substrato studiate.

Substrato 1 uM y = 1,642x - 0,8186 R2 = 0,9985 0 20 40 60 80 100 120 140 0 20 40 60 80 attività di GGT (mU/ml) ar ea med ia Substrato 30 uM y = 3,7047x - 6,3686 R2 = 0,9962 -100 0 100 200 300 400 500 600 700 0 50 100 150 200 attività di GGT (mU/ml) ar ea med ia

Fig 4.6. Curva di calibrazione della GGT bovina ottenuta in flow injection con concentrazione di substrato 1 µM (A) e 30 µM (B) (valore medio ±SD, N≥ 4).

L’uso di una concentrazione di substrato nell’intervallo indicato (1 - 30 μM) permette, infatti, di modulare opportunamente la sensibilita’ del metodo a scopi analitici. Come verra’ mostrato nel seguente paragrafo, concentrazioni di substrato piu’ elevate (per es. 30 μM) permettono di ovviare ad alcune problematiche connesse con l’applicazione del metodo a matrici reali (per es. plasma).

Le figure di merito analitiche definite per i due valori di concentrazione di substrato sono riportate in Tabella 4.6. La curva di calibrazione ottenuta con concentrazione di substrato pari a 30 μM tiene conto della variabilita’ intra- giorno e tra giorni. Infatti in figura 4.6 B e’ riportato il valor medio e la deviazione standard deulle misure ottenute effettuando in tre giorni differenti tre curve di calibrazione ed effettuando per ciascun punto almeno 4 iniezioni.

Tabella 4.6.

[substra

to] Slope sensibilità*

Intercetta (unita’ fluo.

× min) R2 LOD (mU/mL)

RDL** mU/mL CV%* ** 1 μM 1.64 - 0,81 0.998 0.16 0.5-75 2.8 30 μM 3.7 - 6.37 0.996 0.16 0.5-150 9.9 (*) unita’ di fluorescenza × min × mL × mU-1

(**) RDL=range dinamico lineare ; LOD=limit of detection

(***) coefficiente di variazione calcolato per GGT=10 mU/mL [SD/valor medio]*100

E’ interessante sottolineare che nelle condizioni operative proposte, il metodo presenta un limite inferiore di determinazione (LOQ = limit of quantitation ≅ 3 LOD) pari a 0.5 mU/ml, corrispondente a un ordine di grandezza inferiore rispetto a metodologie precedenti .