Parametri cromatografici fondamentali

Se all’estremità di una colonna è posto un rivelatore che risponde alla concentrazione di un soluto ed il suo segnale viene registrato in funzione del tempo, si ottiene un grafico caratterizzato da una serie di picchi simmetrici, come mostrato in fig.5.1 (b):

Fig.5.1 (a) Separazione di una miscela di componenti A e B mediante eluizione attraverso una colonna cromatografica. (b) Segnale del rivelatore durante le varie fasi dell’eluizione.

Questo grafico prende il nome di cromatogramma, ed è utilizzato sia per analisi qualitative che quantitative [22]. La posizione dei picchi sull’asse dei tempi¹ può essere utilizzata per identificare i componenti del campione

1 Ogni sostanza esce dalla colonna con tempi diversi, a seconda delle caratteristiche strutturali.

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(analisi qualitativa); l’area sottesa2 da tali picchi fornisce invece un metodo per la determinazione della quantità di ciascuna specie (analisi quantitativa).

Fig.5.2 Cromatogramma relativo alla separazione di due sostanze. Il piccolo picco sulla sinistra rappresenta un soluto che non è trattenuto dalla colonna e quindi raggiunge il rivelatore nel tempo necessario alla fase mobile per attraversare la colonna.

Facendo riferimento alla fig.5.2 è possibile definire le seguenti grandezze:

 Tempo morto tM: tempo necessario ad una specie non trattenuta per attraversare la colonna (tempo che gli analiti trascorrono in FM uguale per tutti);

 Tempo di ritenzione tR: tempo che intercorre tra l’iniezione del campione e la comparsa del massimo del picco (tempo somma = tempo trascorso dall’analita nelle interazioni con la FS + tempo impiegato per percorrere la colonna in FM);

 Tempo di ritenzione corretto t’R=tR-tM: tempo impiegato da ogni sostanza eluita nelle interazioni con la fase stazionaria.

 Fattore di ritenzione k'

È un parametro cromatografico che esprime la distribuzione del soluto tra le due fasi in chiave non solo termodinamica, ma anche geometrica:

2 L’area sottesa è proporzionale alla quantità di analita che ha prodotto il picco.

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k′ = K_{D V}^VS

M ^(5.2)

Dove:

- KD è la costante di ripartizione; - VS è il volume della fase stazionaria; - VM è il volume della fase mobile.

Due colonne con le stesse fasi e alla stessa temperatura di esercizio possono avere k' diversi per la stessa sostanza, se preparate con una geometria diversa. Idealmente il valore di k' deve essere compreso tra 5 e 10, e può essere calcolato tramite il cromatogramma attraverso la relazione:

k′ =^t′_t^R

M

(5.3)

 Fattore di separazione α

È un parametro esclusivamente termodinamico:

α =^K_K^DB

DA _(5.4)

Rappresenta la selettività di un sistema cromatografico, ossia la sua capacità di eluire specie chimiche diverse a velocità diverse. Affinché la separazione

si verifichi è necessario che α > 1, e dal cromatogramma si ottiene che: α =^t′_t′^B

A ^(5.5)

 Efficienza N

È un parametro esclusivamente cinetico che esprime la capacità di un sistema cromatografico di fornire picchi stretti, cioè di eluire particelle di una stessa sostanza alla stessa velocità. Quest’ultima affermazione descrive una situazione ideale, perché in realtà le molecole di uno stesso analita non si possono muovere lungo la colonna con la stessa velocità: la loro dispersione ha generalmente un profilo gaussiano. La larghezza di base (W) del picco sarà

il parametro più semplice da osservare per verificare l’efficienza del sistema. Il centro del profilo gaussiano (banda di eluizione) rappresenta la velocità media delle molecole di uno stesso analita. L’efficienza è misurata attraverso il numero dei piatti teorici N (porzione della colonna in cui si verifica l’ideale equilibrio di distribuzione del soluto fra le due fasi). Questo valore dipende dalla lunghezza della colonna (L) e dall’altezza di ogni singolo piatto (H) secondo la relazione:

N =_H^L _(5.6)

L’altezza equivalente di ogni singolo piatto è a sua volta dipendente da: A. Percorsi multipli (fig.5.3): singole molecole della fase mobile possono

seguire cammini di lunghezza differente mentre attraversano la colonna, raggiungendo il rivelatore in tempi diversi³;

Fig.5.3 Possibili cammini multipli presenti nell’impaccamento della colonna.

B. Diffusione longitudinale (fig.5.4): nel centro di una banda cromatografica la concentrazione di una specie è alta, mentre tende a zero agli estremi. Le molecole tendono quindi a migrare spontaneamente verso queste zone, parallelamente all’asse della colonna, con un conseguente allargamento della banda. E’ bene notare che la diffusione avviene sia nella direzione del flusso che in quella opposta, ed in egual modulo.

3 Una possibile causa è l’inomogeneità dell’impaccamento della colonna.

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Fig.5.4 Diffusione longitudinale delle molecole di un analita.

C. Resistenza al trasferimento di massa (fig.5.5): il processo separativo avviene grazie alla continua distribuzione delle molecole del soluto tra le due fasi, mentre vengono trascinate in avanti dalla fase mobile. Questo processo dinamico detto trasferimento di massa si basa sul fenomeno della diffusione nelle due fasi: certe particelle viaggiano velocemente perché sono casualmente presenti nella fase mobile per la maggior parte del tempo, mentre altre si attardano poiché sono intrappolate nella fase stazionaria per un tempo superiore a quello medio. Il risultato di questi processi individuali casuali porta inevitabilmente ad un allargamento della banda [5].

Fig.5.5 Rappresentazione della resistenza al trasferimento di massa delle molecole di un analita.

La relazione che lega H a questi fattori e alla velocità della fase mobile (u) è espressa dall’equazione di Van Deemter:

H = A +^B_{u + Cu} (5.7)

 Risoluzione cromatografica R

Questo è il parametro cromatografico che sintetizza tutte le caratteristiche del sistema ed è la misura quantitativa della capacità di una colonna di separare due sostanze. Tutti i parametri cromatografici influenzano la risoluzione secondo la seguente relazione:

R =^√N_{4 ∙}^{α − 1}_{α ∙k′}^k′2

2+ 1 (5.8)

Ne consegue che variando l’efficienza N, la selettività α e il fattore di ritenzione k’ è possibile migliorare la risoluzione. Questa è l’equazione più importante della cromatografia perché consente di ottimizzare le prestazioni dei sistemi sperimentali

Quando R = 1.5 la risoluzione si dice completa e il suo valore può essere derivato dal cromatogramma (fig.5.6):

R = ^tRB− tR_A

(W_A+ W_B)

2 ^(5.9)

Dove W è l’ampiezza della base del picco della relativa sostanza.

Due picchi si dicono risolti se sono sufficientemente stretti e ben distanziati.

Fig.5.6 Rappresentazione grafica di due picchi a diversi gradi di risoluzione.

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