Performance dei test diagnostici

Come descritto ci possono essere considerevoli sovrapposizioni nei risultati dei test endocrinologici per disordini generati da risposte fisiologiche o patologiche. Come conseguenza molti dosaggi della concentrazione forniscono performance diagnostiche che possono presentare degli errori. Per esempio la risposta allo stress dell’asse ipotalamo ipofisi surrene come altre patologie presentano lo stesso risultato che ci si aspetta in cani con iperadrenocorticismo, evidenziando una scarsa specificità diagnostica per la presenza di molti falsi positivi. Similmente la risposta della tiroxina totale T4 a patologie non tiroidee rendono la diagnosi di ipotiroidismo meno

specifica nel cane252_{. Da un esame di laboratorio è possibile ottenere quattro diversi scenari:}

- Il test può essere positivo nell’animale con la malattia, vero positivo; - Il test può essere positivo nell’animale senza la malattia, falso positivo; - Il test può essere negativo nell’animale con la malattia falso negativo; - Il test può essere negativo nell’animale senza malattia, vero negativo.

I risultati che si cerca di ottenere rientrano nella prima e nell’ultima categoria ma è impossibile evitare i falsi positivi e negativi. Questa eventualità sarà ovviamente tenuta in considerazione per l’interpretazione del risultato del test247_.

Sensibilità e specificità diagnostica

Una volta che la performance analitica di un test di laboratorio viene stabilita, ed è stata determinata anche la risposta più appropriata che ci si aspetta da un test dinamico, il passo successivo è quello di determinare la performance del test per quanto riguarda la diagnosi, ovvero la capacità di un esame di distingue la presenza o l’assenza di una determinata patologia. Per valutare la performance diagnostica sono generalmente utilizzati risultati dicotomizzati, in quanto rappresentano l’approccio migliore. Il più utilizzato è pero è un sistema che vede due estremi: patologia o non patologia. Non viene consentita un’area grigia di sovrapposizione dei risultati, non tenendo in considerazione la varietà dei livelli gravità che può presentare una patologia, spesso una delle principali caratteristiche delle disendocrinie, in particolare quelle che richiedono tempo per svilupparsi247_.

La sensibilità diagnostica da non confondere con la sensibilità analitica è la proporzione dei pazienti con la patologia correttamente identificati dal test, misurala frequenza di un test positivo quando la malattia è presente nel gruppo di animali (TP/(TP+FN)). Questo valore viene ottenuto a partire da una popolazione di malati di una grandezza ragionevole, in cui i soggetti sono stati accuratamente caratterizzati come affetti dal disordine in questione. Generalmente questa valutazione è affidata a una tecnica diagnostica considerata come “gold standard” per quella determinata patologia. La sensibilità diagnostica è sinonimo di risultati veri positivi. Poiché la sensibilità è derivata all’interno della popolazione malata, più alta è la sensibilità più basso sarà il numero dei falsi negativi. Grande sicurezza può essere posta nel fatto che i risultati negativi siano veramente negativi. Pertanto test con un’alta sensibilità diagnostica sono particolarmente utili per escludere i soggetti sani. La sensibilità diagnostica derivata può essere influenzata, in una certa misura, dalla selezione del gruppo malato. Spesso il gruppo di malati contiene casi che possono

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essere facilmente categorizzati e di conseguenza possono avere una patologia grave o in uno stato avanzato. Casi lievi o precoci possono essere molto più difficili da classificare e alle volte possono essere omessi. Come conseguenza la sensibilità risulta sovrastimata negli studi che non presentano un range rappresentativo. È sempre bene assicurarsi, quando vengono presentati nuovi test diagnostici, che la popolazione presa in esame sia rappresentativa252_.

La specificità diagnostica da non confondere con quella analitica è la proporzione di pazienti senza la patologia che sono identificati correttamente dal test252_{, misura della frequenza di un test}

negativo in assenza di una particolare malattia (TN/(TN+FP))247_{. L’origine di questa proporzione}

richiede una buona caratterizzazione della popolazione sicuramente priva della patologia in questione. Idealmente, questo non dovrebbe essere semplicemente un gruppo sano, ma preferibilmente dovrebbe includere animali con un segnalamento simile, con caratteristiche o segni clinici indicativi della malattia in questione. La specificità diagnostica è sinonimo di risultati veri negativi. Dal momento che la specificità deriva da una popolazione non malata, più alta è la specificità più bassi saranno i falsi positivi252_.

Valore predittivo positivo e negativo e effetti della prevalenza

La sensibilità e la specificità diagnostica forniscono informazioni utili su come un test è in grado di valutare una popolazione con uno stato patologico definito. Nella pratica clinica però uno stato clinico definito è una condizione molto rara. Spesso infatti la ragione della richiesta di un test è proprio definire più chiaramente lo stato di malattia di un paziente. Dopo il test, un risultato viene generato ed è importante sapere la probabilità che il risultato del test fornisca una corretta diagnosi252_{. Per determinare questa probabilità vengono calcolati il valore predittivo positivo, PPV,}

ovvero la probabilità di malattia D+ dato un risultato di test positivo T+, corrispondente alla probabilità post test di avere un risultato positivo in un soggetto che presenta realmente la malattia247

_,

_{e valore predittivo negativo , NPV, ovvero la probabilità di non avere la malattia D-}

dato un risultato di test negativo T-, corrispondente alla probabilità post test di non avere la malattia dato un risultato di test negativo247_{, i quali derivano dalla sensibilità, Se, e dalla}

specificità, Sp, combinate con la prevalenza. In molte situazioni la vera prevalenza delle condizioni all’interno di una popolazione di animali che vengono sottoposti al test è sconosciuta.

L

a prevalenza è la probabilità che la patologia sia presente prima dello svolgimento del test (probabilità pre-test)252_{, ovvero la probabilità che un animale abbia la malattia((TP+FN)/N)}247

_.

Questa probabilità può significare un aumento della funzionalità del test, solo su animali con una già alta probabilità di presentare la patologia, considerando razza, sesso ed età, oltre che la presenza di segni clinici, alterazioni nei test clinico patologiche di routine compatibili, esclusione di altre diagnosi differenziali. La prevalenza ha conseguenze significative sui valori predittivi in particolare quando la sensibilità diagnostica o la specificità sono basse, cosa che accade spesso nei casi di patologie endocrine:

- Test con bassa sensibilità diagnostica hanno un valore predittivo negativo(VPN) basso, in condizioni di prevalenza, tipico quadro che si riscontra quando viene eseguito un test diagnostico per una endocrinopatia;

- Test con una bassa specificità hanno un basso valore predittivo positivo(VPP) valutato in situazioni di alta prevalenza quando ci sono scarsi segni a supporto della patologia, questo

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tipo di bassa prevalenza è comune quando si eseguono test di screening su un’estesa popolazione per una patologia rara.

Di importanza rilevante per il calcolo della probabilità a priori del test sono la prevalenza della malattia nella popolazione, fattori di rischio, anamnesi clinica, rilievi clinici e sintomi… . Dopo aver eseguito l’esame è possibile aggiornare la probabilità pre test, stimando la probabilità a posteriori o post test. Questo calcolo è basato sul teorema di Bayes che mette in correlazione le informazioni ottenute dalle analisi di laboratorio con la clinica dell’animale. Il rapporto di probabilità per un test positivo è quindi il risultato della divisione della sensibilità da parte del valore di 1- specificità. Invece il rapporto d probabilità per un test negativo è determinato dalla divisione del valore 1- sensibilità da parte del valore della specificità.

Quando la prevalenza è più bassa del 5% il PPV di un test positivo per LDDS cade a un inaccettabile 15%. Di fronte a un risultato positivo, anzi a dispetto del risultato positivo è molto più probabile (85%di probabilità) che l’animale non abbia un iperadrenocorticismo (HAC). È per questo motivo che non è disponibile un test di screening per tale patologia e non viene eseguito a meno che non ci siano evidenze cliniche a supporto. Nel caso poi che nel cane si voglia misurare la concentrazione sierica di T4 totale, oltre ad avere un’alta prevalenza, è necessario accertare

un’eventuale presenza di patologie non tiroidee o di terapie in corso, che possano falsare l’esito del test. In alternativa la sicurezza diagnostica potrebbe essere ottenuta utilizzando combinazioni di test, come ad esempio alla misurazione di T4 totale sierico è possibile associare test dinamici per

valutare più approfonditamente la funzionalità tiroidea. Per la diagnosi dell’ipertiroidismo felino il dosaggio della T4 totale presenta alta specificità ma bassa sensibilità. Si tratta comunque un buon

test di screening da poter utilizzare in gatti anziani in cui un risultato positivo dà comunque un buon grado di sicurezza una diagnosi positiva, a cui però posso aggiungere, quando la prevalenza è alta, un test più specifico che va a misurare la concentrazione della T4 libera252.

Razza

Le caratteristiche fisiche, in particolare nel cane variano molto da una razza all’altra, quindi non sorprende il rischio di un’errata classificazione quando vengono usati degli intervalli di riferimento unici per tutte le razze. Sarebbero più appropriati intervalli di riferimento specifici per ogni razza. Questa variabilità è meno significativa nel gatto. La necessità di intervalli specifici è dipendente da studi su un largo numero di animali sani per ogni razza di interesse, ma solo un limitato numero di studi è stato completato e da questi sono stati ricavati solo un piccolo numero di range specifici. È ormai accettato che i dolicocefali, in particolare razze da punta hanno un più basso valore di riferimento per la T4 totale e in alcuni casi anche per la fT4. La concentrazione di insulin-like growth

factor (IGF-1), prodotti dal fegato sotto l’influenza dell’ormone della crescita (GH), sono misurati per sospetta acromegalia e nanismo e per determinare lo stato nutrizionale. Questo è fortemente influenzato dalla taglia dell’animale, perciò nei cani piccoli si ha fisiologicamente una minore concentrazione252_.

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Animali giovani e in crescita possono avere una concentrazione di ormoni circolanti significativamente diversa dagli adulti, per esempio nelle prime settimane di vita la concentrazione di ormoni tiroidei è tipicamente più alta e animali in crescita avranno anche una maggiore concentrazione di IGF-1 rispetto all’adulto. Nell’anziano invece viene rilevata una concentrazione di T4 totale in progressiva diminuzione comunque in generale questi cambiamenti non sono

sufficientemente significativi da comportare errori nella classificazione tra animali sani e malati anche usando un unico intervallo di riferimento252_.

Momento della giornata

Nei mammiferi possiamo avere una diversa concentrazione dei livelli ormonali a seconda del giorno o della notte, questo potrebbe rappresentare un limite o non rappresentare alcuna rilevanza, il parere dei diversi autori è discordante. È stato mostrato che il cortisolo nel cane ha una secrezione pulsatile e ciclica ma non è stato osservato uno specifico pattern diurno. Di conseguenza l’avviso di investigare il cortisolo in un particolare momento del giorno non ha fondamento e non è necessario. Il momento del giorno o più correttamente il tempo dall’ultima medicazione è molto più utile nel monitoraggio dell’efficacia terapeutica in alcune endocrinopatie, come ad esempio la somministrazione dell’ormone tiroideo nel cane ipotiroideo o il trilostano nell’iperadrenocorticismo (HAC)252_.

Farmaci

Esiste una lunga lista di farmaci comunemente usati in medicina veterinaria di cui è stata dimostrata la potenzialità di alterare i risultati dei test endocrini. La maggior parte degli studi ha identificato lievi alterazioni o effetti minimi che non portano a errori nella classificazione di animali sani e malati. Esistono però alcuni farmaci che invece possono comportare alterazioni delle capacità diagnostiche significative che includono:

- Sulfonamidi, determinano un primario ma reversibile ipotiroidismo;

- Barbiturici, sopprimono la T4 totale e, attraverso l’induzione del metabolismo epatico

possono comportare falsi positivi e LDDS;

- Glucocorticoidi, sopprimono la concentrazione degli ormoni tiroidei ed esercitano un feedback negativo sull’asse ipofisi surrene, influenzando i risultati di test di funzionalità del surrene stesso.

Idealmente le indagini endocrinologiche non dovrebbero essere effettuate quando l’animale è in terapia con questi farmaci. Nel caso non sia possibile sospendere trattamenti con barbiturici o glucocorticoidi allora dovrebbero essere prese in considerazione altre tecniche diagnostiche che subiscono una minore influenza, ad esempio il dosaggio di fT4 piuttosto che del T4 totale circolante252_.

Patologie non endocrine

Le patologie non endocrine pongono la più grande sfida e rischio di errori di classificazione. Influenzano in particolare due dei più comuni sistemi endocrinologici indagati negli animali da compagnia: tiroidi e surreni. Infatti è possibile evidenziare che:

- Ogni patologia non tiroidea significativa, sia acuta che cronica, ha la potenzialità di sopprimere la concentrazione della T4 totale circolante al di sotto dell’intervallo di

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riferimento. Per questo motivo i test tiroidei andrebbero posticipati in cani con patologie non tiroidee, fino a che l’animale non si sia stabilizzato con il trattamento. In alternativa dato che gli effetti delle patologie non tiroidee non influenzano marcatamente i livelli di fT4

misurare questo parametro potrebbe incrementare la correttezza di una diagnosi di ipotiroidismo;

- Ogni patologia che può essere definita metabolicamente stressante ha potenzialmente la capacità di generare un falso positivo per il test dell’iperadrenocorticismo. È possibile spiegare questo fenomeno in quanto in situazioni di stress si ha un fisiologico aumento della produzione di glucocorticoidi e questo può portare a un errore di classificazione utilizzando i test dinamici252_.

Endocrinopatie concomitanti

Spesso i sistemi endocrini come ad esempio tiroide e surreni, sono considerati come due entità separate, ma è apprezzabile enfatizzare che in molte circostanze sono strettamente interconnessi. La preesistenza di una endocrinopatia può infatti influenzare la capacità di confermare o escludere in modo affidabile la presenza di una patologia piuttosto che un’altra. Per esempio le anormalità che ci aspettiamo in indagini clinico patologiche di routine in un cane diabetico sono simili a quelle che troviamo in un cane con iperadrenocorticismo (HAC). In questo quadro il significato di un innalzamento di enzimi epatici e colesterolo in supporto della diagnosi di HAC risulta meno significativo. Similmente un cane con HAC ha di solito una bassa circolazione di T4 totale perfino

quando è eutiroideo, è necessario quindi tenere presente queste interazioni, per evitare errori diagnostici252_.

Terapie endocrine

Anche se una misurazione di un test ormonale di tipo immunologico dovrebbe essere più specifica possibile, per l’ormone preso in esame, in alcuni casi gli anticorpi possono cross-reagire con composti simili. Di conseguenza se un trattamento palliativo o sintomatico viene intrapreso senza una conferma delle reali condizioni patologiche dell’animale, diventa impossibile formulare una diagnosi accurata. Ad esempio se con il trattamento si normalizza la concentrazione del calcio circolante, l’interpretazione del PTH nel paziente risulta compromessa. Similmente il trattamento di un sospetto ipoadrenocorticismo prima della conferma del test endocrino può compromettere l’indagine se sono somministrati glucocorticoidi, in quanto il prednisolone può causare falsi aumenti di cortisolo, mentre il desametasone invece no, per cui in caso di dubbio in attesa della conferma diagnostica è consigliabile utilizzare quest’ultimo. In caso di iperadrenocorticismo invece, i precursori degli steroidi si accumulano durante la terapia con trilostano che contribuisce a un marcato aumento di 17-idrossiprogesterone. In queste circostanze la misurazione dell’aldosterone potrebbe essere di maggiore aiuto. Glucocorticoidi esogeni, inclusi quelli con applicazione topica a livello di occhio, orecchie, e cute possono essere presenti in caso di soppressione nei test di risposta all’ACTH, ma questo non va interpretato come una ipofunzionalità surrenale252_.

Errori preanalitici

La lipemia (o iperlipidemia o ipelipidemia) è l’evenienza per cui il campione di sangue prelevato, si presenta con una torbidità più o meno marcata, più evidente nel relativo campione di plasma. In genere si ha una maggiore concentrazione di trigliceridi, sotto forma di chilomicroni (assorbiti dal

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piccolo intestino), che raffreddandosi risalirà la provetta andando a formare un anello di colore biancastro al di sopra del plasma trasparente (lipemia esogena). Oppure può essere dovuto a cause endogene come un’eccessiva presenza di lipoproteine a bassa densità (VLDL), lipoproteine sintetizzate dal fegato. Il raffreddamento è un buon metodo per discriminare i due tipi di lipemia247_{. Quando un campione si presenta lipemico la presenza di grassi ha la capacità di}

interferire con i risultati di alcuni esami di laboratorio andando a complicare la valutazione della concentrazione degli analiti. Il grado di questi effetti per ogni analita generalmente è conosciuto. Quando ci sono interferenze, il motivo è spesso ascrivibile al fatto che i grassi presenti, alterano la capacità dello strumento di misurare la luce e i cambiamenti di colore del campione, fondamentali per le tecniche di spettrofotometria o che si basano sulle reazioni enzimatiche. Più raramente possiamo avere interazioni con anticorpi e analiti e la separazione del legame tra anticorpo e ormone. In generale test di radioimmunologia sono privi di effetti di interferenza, perché i cambiamenti di luce o colore non sono importanti ai fini della riuscita del test. Inoltre, un aumento della concentrazione di acidi grassi liberi nel campione comporta un aumento di fT4, in quanto si

ha uno spiazzamento delle proteine di legame che determina un falso aumento della frazione libera dell’ormone tiroideo252_{. Alcune razze sono particolarmente predisposte all’ipelipidemia e}

nel caso in cui sia necessario eseguire un esame di laboratorio è necessario sottoporre l’animale a un digiuno per un tempo maggiore. Oppure è possibile somministrare una dose di eparina endovena (100-200 U.I./Kg pv)che determina un idrolisi di chilomicroni e VLDL247_.

Per quanto rigurda l’emolisi, si tratta della liberazione di emoglobina dagli eritrociti in relazione ad un danno alla membrana cellulare. Generalmente si verifica durante o dopo il prelievo ematico per danni di tipo meccanico, ma alcuni paziente possono presentare questo tipo di processo all’interno dell’organismo in caso di anemia emolitica immunomediata. È un effetto indesiderato in quanto l’accuratezza di molte anlisi di laboratorio si riduce. Il grado di emolisi è inversamente proporzionale alle dimensioni e alla costituzione della membrana eritrocitaria ed in ultima analisi alla Resistenza Osmotica Eritrocitaria (ROE), ovvero la capacità di resistere alla rottura in una soluzione salina, NaCl, a concentrazioni sempre più basse. La concentrazione che dà inizio al processo emolitico è la ROE minima, mentre quando il processo di emolisi è totale si parla di ROE massima. Questo test di fragilità osmotica si basa sul fatto l’eritrocita in una soluzione ipotonica permette l’ingresso dell’acqua all’interno della cellula mediante un processo osmotico, che porta al rigonfiamento dell’emazia che raggiunge prima una forma sferica, poi raggiunto il limite si ha la rottura della membrana e la liberazione di emoglobina. La quantità di emoglobina misurata è poi confrontata con quella di un campione di uguale volume in cui si ha lisi completa. Si può avere per: - Origine traumatica e meccanica diretta sugli RBC, al momento del prelievo per la presenza

di un ago troppo piccolo che comporta pressioni elevate o per un’eccessiva agitazione; - Lipemia, determina un cambiamento della composizione della membrana e un’aumentata

fragilità;

- Contatto con soluzioni ipotoniche/chimiche come alcol etere e disinfettanti vari; - Ritardo dell’inoltro del campione al laboratorio.

L’emolisi può andare ad alterare la misurazione di alcune componenti presenti del sangue. Prima di tutto la liberazione da parte della cellula di componenti chimici come ad esempio Na e K ne comporta un falso aumento se la concentrazione nelle emazie è maggiore di quella nel sangue. Al contrario, per quei composti che presentano una concentrazione minore è possibile che si verifichi

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un “effetto diluizione”. Inoltre si può verificare una interferenza colorimetrica, alterando così il valore dei parametri ottenuti con metodo spettrofotometrico, con una lunghezza d’onda tra i 300 e 500 nm. Determina anche un aumento della torbidità del campione. HCT ed il numero degli RBC sono diminuiti mentre il valore dell’Hgb rimane inalterato247_.

Paura e eccitazione

La paura e l’eccitazione determinano un innalzamento di adrenalina, in particolare nelle specie nevrili come il gatto. può comportare alterazioni di alcuni parametri a carattere transitorio. Ad esempio è possibile riscontrare un aumento di ematocrito, emoglobina e numero di eritrociti, secondario alla spremitura della milza, insieme a un aumento delle piastrine, oppure anche una leucocitosi neutrofilica senza deviazione a sinistra. Nel gatto giovane è invece possibile assistere a fenomeni di linfocitosi. Si osserva spesso nel cane anche se molto di più nel gatto un innalzamento della glicemia (fino anche a 300-400mg/dL), accompagnata talvolta da glicosuria247_.

Nel documento Indagine retrospettiva per l'interpretazione clinica dei valori del TT4 nel paziente ipertiroideo felino (pagine 57-63)