Procedura di analisi dei campioni clinici per la ricerca di Klebsiella pneumoniae Il punto di partenza per il trattamento delle infezioni è basato sull’identificazione

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materiale biologico prelevato dal paziente. Nel caso di questo studio, i batteri presi in esame sono stati isolati da diversi campioni clinici, quali il tampone rettale, il broncoaspirato, il lavaggio bronchiale, prelievo ematico, le urine, il tampone cutaneo, il liquido ascitico.

Col termine di bronco aspirato si fa riferimento al materiale prelevato per aspirazione dai bronchi durante una broncoscopia. È rappresentato da cellule distaccatesi dalla mucosa bronchiale e giunte nel lume e dall'insieme di ristagni delle secrezioni mucose (catarro bronchiale) ed eventuali versamenti; per lavaggio bronchiale s’intende invece la soluzione introdotta attraverso un broncoscopio nella zona di indagine dell’apparato respiratorio e successivamente aspirata e sottoposta ad analisi.

Da sottolineare il fatto che per analizzare i broncoaspirati e i lavaggi bronchiali, in dipendenza dal loro grado di fluidità, prima della semina, è necessario addizionare un reagente apposito (ditiotreitolo 0.1% in soluzione salina tamponata nel laboratorio preso in esame) che consenta la disgregazione dei filamenti mucosi che spesso tengono adesi i microrganismi presenti.

Per quanto riguarda i cateteri prima di passare alla fase di semina, il campione viene arricchito con un terreno liquido o brodo, contenente composti che facilitano la crescita e la moltiplicazione delle specie microbiche e messo a incubare per 24 ore.

La procedura di analisi prevista nel laboratorio di microbiologia nell’AOUP, consiste in una prima fase di semina su quattro terreni di base:

 Agar sangue, terreno arricchito che permette la crescita di tutte le specie batteriche;  Agar sale mannite, terreno selettivo per gli stafilococchi e inibente la crescita di

tutti gli altri germi gram negativi e positivi;

 Agar Mac – Conkey, terreno selettivo per i gram negativi in quanto contiene sali biliari, che inibiscono la crescita dei gram positivi e di alcuni gram negativi esigenti, il lattosio è l’unico carboidrato presente ed il rosso neutro come indicatore di pH;

 Agar Sabouraud, che permette la crescita dei miceti per una sua alta concentrazione di carboidrati e un pH acido.

Le varie piastre così preparate vengono messe ad incubare in termostato ad una temperatura di 37° C per 24/48 ore.

Protocollo diverso, invece, viene eseguito per l’analisi dei campioni urinari e delle emocolture.

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Per i campioni urinari la semina è effettuata solo su terreno chromID® CPS, bioMerieux, terreno cromogeno che consente di eseguire contemporaneamente le due fasi essenziali dell’esame batteriologico delle urine: la conta e l’identificazione diretta. Tale terreno viene poi messo a incubare sempre per 24 ore a 37°C come nel caso degli altri campioni sopra descritti.

Per quanto riguarda invece il trattamento delle emocolture il protocollo di analisi prevede una procedura particolare. I campioni da analizzare arrivano al laboratorio in due appositi flaconi contenenti brodo di coltura e adatti alla crescita uno dei germi aerobi, l’altro di quelli anaerobi. Nei "flaconi Bactec" (nei flaconi il sangue viene diluito, per diminuire l'attività battericida del siero o di eventuali antibiotici) è presente:

 Terreno di coltura liquido arricchito (per aerobi, anaerobi, miceti o per uso pediatrico)

 Composto che lisa leucociti (potrebbero falsare la rilevazione dei batteri)  Anticoagulante (SPS, sodio polianetolsulfonato)

 Resina (ARD = Antibiotic Removal Device, lega e neutralizza antibiotici eventualmente presenti)

I flaconi Bactec contengono un substrato cromogeno (in grado di colorarsi e di emettere fluorescenza) che si attiva in presenza di anidride carbonica, principale catabolita del metabolismo batterico. I campioni raccolti dai diversi pazienti vengono incubati nel "termostato Bactec", particolare sistema chiuso in grado di controllare e agitare (è buona regola) continuamente i diversi flaconi Bactec. Se il sistema rileva luminescenza, avvisa gli operatori con un segnale acustico, segnalando anche il campione risultato positivo. Molti campioni, delle infezioni più comuni, possono positivizzarsi nel giro di diverse ore. Tuttavia alcuni batteri insoliti (vedi oltre) ed atipici hanno tempi molto più lunghi di crescita. Proprio per questo i campioni vengono mantenuti in incubazione per 7-14 giorni. E’ a questo punto che si procede con la semina sugli appositi terreni di crescita e si procede con le stesse modalità degli altri isolati provenienti dagli altri distretti corporei già descritti. Come riportato sopra, la valutazione della crescita dei microrganismi viene effettuata in due tempi, dopo 24 ore e poi a 48 ore di incubazione. La spiegazione risiede nel fatto che, trattandosi di campioni clinici e quindi di pazienti verosimilmente già sottoposti a terapie antimicrobiche, non è infrequente rilevare assenza di crescita o presenza di colonie troppo piccole per poter procedere con un’identificazione esatta dopo le prime 24 ore. Ecco allora

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la necessità di prolungare il periodo di incubazione in modo da permettere il giusto sviluppo.

Presupposto fondamentale per lo studio e l’identificazione dei microrganismi, isolati dai vari materiali sottoposti all’esame microbiologico, è quello di disporre di una coltura pura. Per coltura pura si intende l’insieme delle cellule che si ottengono dalla riproduzione di una sola cellula iniziale. Per ottenere una coltura pura è quindi necessario :

 diluire il campione iniziale per separare le cellule presenti (isolamento);

 trasferire una singola colonia in un terreno sterile in modo da ottenere una popolazione di cellule identiche (coltura pura).

Stessa procedura anche nel caso in cui la quantità di colonie sviluppate non è sufficiente per eseguire le analisi di identificazione e l’antibiogramma.

Si preleva una colonia della specie che si vuole amplificare, viene successivamente trapiantata su un altro terreno sterile (agar sangue o Mac Conkey a seconda che sia gram positivo o negativo) e incubata per 24 ore.

Passato tale intervallo di tempo, se è avvenuta crescita, si può procedere con i sistemi di identificazione e di antibiogramma effettuati utilizzando il sistema VITEK2.