Prospettive future: gli enhancer

Agonisti, antagonisti e modulatori del recettore T1R2/T1R3

Agonisti. Sono stati fatti molti progressi nella comprensione dei meccanismi

responsabili della percezione del gusto dolce, tuttavia alcuni aspetti non sono ancora stati del tutto chiariti:

- Sono stati osservati due diversi tipi di risposta per i dolcificanti intensivi da una parte e per i carboidrati e polioli dall’altra (iperbolica e lineare, rispettivamente): questo suggerisce che gli intensivi possano essere agonisti parziali, gli altri agonisti puri.

- Alcuni dolcificanti, oltre alla sensazione di dolcezza, hanno un retrogusto amaro o sono accompagnati da altri sapori (es: metallico). In qualche caso, come nella saccarina, questo è spiegato con il fatto che questa molecola attiva sia i recettori per il dolce che quelli per l’amaro.

- Quasi sempre i dolcificanti intensivi hanno un ritardo nell’indurre la sensazione di dolcezza ed un retrogusto persistente (es. acqua assume sapore dolce).

- Un certo tipo di adattamento rende più dolce il primo sorso di una soluzione contenente un dolcificante rispetto ai sorsi successivi: questo perché i recettori accoppiati a proteine G in presenza di agonisti vengono internalizzati.

Li e collaboratori hanno quindi condotto studi su recettori chimerici T1R2/T1R3 umani e di roditori per provare la questione fondamentale delle regioni di legame per i dolcificanti e, nei loro primi esperimenti, hanno verificato il legame di aspartame e neotame al dominio VFT di T1R2, e quello del ciclamato con un sito nel dominio transmembrana; altri studi sono stati condotti su proteine dolcificanti: la brazzeina si lega con il dominio ricco di cisteina su T1R3, la monellina con il dominio N-terminale su T1R2. Inoltre, la taumatina si lega al dominio ricco di cisteina su T1R3, la neoesperidina diidrocalcone al dominio transmembrana su T1R3, mentre saccarosio, fruttosio, sucralosio si legano al VFT di T1R2. Munger e collaboratori hanno condotto studi di binding dimostrando che il saccarosio è capace di legarsi al dominio VFT di T1R3 ma anche di T1R2. Da tutti gli studi condotti si desume che il recettore T1R2/T1R3 abbia almeno 6 siti di legame per gli agonisti:

- due siti nel VFT di T1R2 - un sito nel VFT di T1R3

- un sito nella regione ricca di cisteina nel T1R3 - un sito nel TMD di T1R2

- un sito nel TMD di T1R3.

Antagonisti. Negli anni ‘80 sono stati individuati alcuni inibitori del gusto

dolce, come il lactisolo (enantiomero S), capace di inibire il riconoscimento del gusto di tutti i dolcificanti. Un altro inibitore, già noto in letteratura, è l’acido gimnemico, un glicoside triterpenoide di origine naturale che si lega al dominio transmembrana di T1R3. Apparentemente molto simili, il lactisolo e l’acido gimnemico sono in realtà molto diversi: il primo è attivo solo se miscelato a molecole dotate di sapore dolce, il secondo è attivo solo se l’epitelio sensoriale della lingua è stato pretrattato con esso. Anche i sali di zinco possono inibire la dolcezza legandosi al dominio VFT di T1R2, ma non esercitano alcuna azione su quella dovuta all’assunzione di ciclamato.

Siti di legame degli antagonisti sul recettore T1R2/T2R3

Modulatori. Poiché i dolcificanti non calorici, dopo anni di ricerche, si sono

troppo spesso dimostrati incapaci di mimare completamente il profilo organolettico del saccarosio, si è provveduto a studiare i modulatori (enhancer) degli agonisti al recettore T1R2/T1R3. Non avendo potere dolcificante in sé, il loro effetto di potenziamento della dolcezza di molecole già in possesso di questa qualità permette di ottenere profili scevri da qualsiasi retrogusto sgradevole. La prima molecola scoperta che fosse dotata di attività di potenziamento dei dolcificanti è stata l’acido 2,4- diidrossibenzoico. I composti di questo tipo sono stati considerati modulatori allosterici positivi (PAM).

DuBois riporta i risultati di un’importante collaborazione con Coca-Cola, iniziata nel 2002, che ha approfondito la ricerca sui modulatori allosterici, prendendo come riferimento non il saccarosio, bensì il sucralosio. Sono stati identificati pertanto un enhancer per il sucralosio (noto come SucralGEM®), ma anche uno per il saccarosio (SucroGEM®) e uno per saccarosio e fruttosio (Sweetmix®); essi si legano al dominio VFT di T1R2, e ad oggi sono aggiunti in cibi e bevande negli USA.

Sito di legame dei PAM sul recettore T1R2/T2R3

Altri autori, mediante costruzione di appositi modelli, riportano approfondimenti sull’interazione che si instaura tra il dominio VFT di T1R2 e

i PAM visti prima, utilizzando SucralGEM e un analogo degli altri due, SE-3, molecola composta dai soli anelli condensati senza le catene laterali.

Da “Protein Data Bank”, utilizzando strutture cristallizzate di mGLUR1, mGLUR3, mGLUR7 sono stati progettati quindi modelli del dominio VFT di T1R2 nelle sue forme aperta e chiusa: il lobo superiore di T1R2 ha un’ampia cavità che può spiegare l’esistenza di molte molecole dolcificanti di grandi dimensioni che interagiscono con questo dominio. Saccarosio e sucralosio interagiscono con i gruppi nitro dei residui I167 e S144 e con l’ossidrile del residuo S144, tutti molto vicini alla regione cerniera del dominio VFT. Tutti i gruppi ossidrile di saccarosio e sucralosio generano legami a idrogeno con residui idrofobici adiacenti come D142 e E302, mentre i sostituenti Cl del sucralosio instaurano legami idrofobici con i residui Y103 e P277. SucralGEM e SE-3 si legano in prossimità dei loro agonisti con possibili interazioni di Van der Waals e legami a idrogeno tra dolcificante ed

enhancer. Ad esempio, nel caso sucralosio/ SucralGEM i due cloruri in C4 e

in C6’ sono necessari per l’attività di potenziamento, ma non sono in diretto contatto con l’enhancer, instaurano bensì interazioni idrofobiche che possono orientare i due anelli del sucralosio verso una più intensa interazione con SucralGEM.

Si ipotizza che l’attivazione del dominio VFT sul recettore T1R2 segua un meccanismo a 2 step come proposto per i recettori del glutammato: attaccamento di ligandi sul lobo superiore (docking) seguito da chiusura dei lobi (locking). I due processi avvengono in scale temporali diverse: microsecondi per il docking e millisecondi per il locking. L’apertura dei lobi persiste per un lasso di tempo relativamente lungo, rendendo possibile l’instaurarsi del legame ligando/modulatore al lobo superiore. Molti dolcificanti di grandi dimensioni, come stevioside e superaspartame, interagiscono con il dominio VFT del recettore T1R2 con un’affinità molto più alta di quella del saccarosio: gli enhancer condividono con queste molecole lo stesso sito di legame. Il complesso saccarosio/enhancer si sovrappone spazialmente allo stevioside e si colloca nella stessa cavità nel lobo superiore del recettore: la singola porzione molecolare del glucosio

presente nella molecola dello stevioside occupa lo stesso spazio del saccarosio/sucralosio, mentre la restante parte del glicoside steviolico si sovrappone alla molecola dell’enhancer. La doppia porzione di glucosio dello stevioside si estende al di fuori del dominio VFT. L’effetto combinato sucralosio/enhancer oppure saccarosio/enhancer mima la modalità di binding dello stevioside.

Il modello suggerisce che D278, un cosiddetto “residuo a tenaglia”, sia necessario per stabilizzare la conformazione chiusa del dominio VFT del recettore T1R2 grazie alle interazioni elettrostatiche col residuo K65, situato sul lobo opposto. Per confermare questa ipotesi, sono stati effettuati studi di mutagenesi: il residuo mutante D278A rende non rilevabile il legame del sucralosio e del saccarosio, che viene però percepito in presenza di SucralGEM e SE-3 rispettivamente. Questi enhancer, ad alte concentrazioni, si comportano sul D278A mutante da agonisti anche in assenza del dolcificante, ma ciò non accade con il recettore nello stato nativo.

In conclusione, i risultati degli studi di molecular modeling e mutagenesi indicano che gli enhancer del gusto dolce seguono un meccanismo simile a quello degli esaltatori del gusto umami IMP e GMP. I dolcificanti si legano vicino alla regione nascosta e inducono la chiusura iniziale del dominio VFT, mentre gli enhancer si legano vicino all’apertura della tasca e stabilizzano ulteriormente la conformazione chiusa rinforzando le interazioni idrofobiche tra i due lobi. Questo gruppo di modulatori allosterici positivi per il recettore TR1 rispecchia quindi un meccanismo unico della modulazione dei GPCR di classe C. (Zhang et. al. 2010)

Nella collaborazione tra DuBois e Coca-Cola è stata oggetto di approfondimenti anche la monatina, un dolcificante intensivo indolico, e si è osservato che l’acido indolacetico, non dotato di potere edulcorante, mostrava la particolarità di conferire all’acqua un retrogusto dolciastro. Un effetto simile è stato osservato nella 6-t-butilsaccarina ed altri derivati. Il fenomeno del retrogusto dolce dell’acqua non è nuovo: è possibile osservarlo infatti nel carciofo, ed in questo caso è probabilmente dovuto alla presenza nel vegetale di acido clorogenico. Si potrebbe affermare che tutte le molecole capaci di

evocare questo effetto siano inibitori della dolcezza, senza neanche testarle: il meccanismo che sta alla base di questo effetto non è chiaro, ma si possono avanzare alcune ipotesi. In assenza di agonisti/antagonisti, i recettori di trovano in stadi conformazionali multipli; nel 1965 è stato proposto un modello in cui il recettore è in equilibrio tra uno stato inattivo e stabilizzato da un inibitore, ed un altro stato attivato e stabilizzato da un agonista. Alcuni recettori si definiscono “costitutivamente attivi” e gli inibitori che agiscono stabilizzando il recettore nella forma attiva sono agonisti inversi. Sulla base di questo si ritiene che il recettore per il gusto dolce sia costitutivamente attivo e gli inibitori come il lactisolo siano agonisti inversi. Se esposto ad un inibitore per il gusto dolce, il recettore si sposta completamente verso lo stato inattivo e il dolcificante non può convertire T1R2/T1R3 nello stato attivo. Se però interviene l’acqua, la sua azione detergente spiazza l’inibitore dal recettore e questo può tornare nel suo stato di equilibrio: ne consegue una normalizzazione dei livelli di Ca2+ in qualità di secondo messaggero, evento che genera un picco di segnalazione della cellula che è percepito come un retrogusto dolce nell’acqua.

I dolcificanti intensivi hanno funzioni C/R di tipo iperbolico; il saccarosio e analoghi hanno funzioni C/R lineari, ed hanno pertanto riposte massimali più intense dei precedenti. E questo, probabilmente, non solo perché i dolcificanti intensivi sono agonisti parziali e il saccarosio e analoghi sono agonisti puri, ma perché questi ultimi possono attivare pathways multipli.

L’ambiente extracellulare di T1R2/T1R3 differisce molto da quello proprio degli altri GCPR, essendo esposto a oscillazioni di pH da 2 a 8, concentrazioni di soluti da 0 a 500 mOsM e da un’ampia gamma di specie ioniche. Considerando T1R2/T1R3 costitutivamente attivo in vivo, è plausibile ritenere che tutte le componenti extracellulari stabilizzino il recettore nella sua forma attiva.

Conclusioni

In questa tesi ho focalizzato l’attenzione sul recettore del gusto dolce e sulle molecole che interagiscono con esso, partendo dal saccarosio e dai suoi effetti legati ad un consumo eccessivo, fino ad arrivare a menzionare i più recenti approcci sui modulatori allosterici positivi. Ho cercato di evidenziare l’importanza di ciò che sta dietro alla percezione gustativa della dolcezza, della sua imprescindibilità per l’organismo umano e la conseguente ricerca scientifica atta a proporre alternative al saccarosio per un industria alimentare sempre più attenta alle esigenze dei consumatori.

Concludendo questa tesi quindi ho potuto comprendere che una possibile soluzione al problema dell’eccessivo consumo di zuccheri è da ricercarsi non tanto in ambito chimico, ma su un terreno culturale che educhi le persone ad assumere stili alimentari più sani; a mio modo di vedere dovremmo imparare a trattare il cibo come trattiamo un farmaco, a dargli cioè un connotato più terapeutico e consapevole.

BIBLIOGRAFIA

Aeran H, Seth J, Saxena S, Sharma G. Taste perception - a matter of sensation. International Journal of Oral Health Dentistry, April-June, 2015;1(2):88-93.

Astray G, García-Río L, Mejuto J, Pastrana L. (2007). Chemistry in food: Flavours. Electronic Journal of Environmental, Agricultural and Food Chemistry. 6. 1742-1763.

Bachmanov AA, Bosak NP, Lin C, Matsumoto I, Ohmoto M, Reed DR, Nelson TM. Genetics of taste receptors. Curr. Pharm. Des. 2014;20(16):2669- 83.

Barretto RP, Gillis-Smith S, Chandrashekar J, Yarmolinsky DA, Schnitzer MJ, Ryba NJ, Zuker CS. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 2015 Jan 15;517(7534):373-6.

Bassoli A, Drew MGR, Hattotuwagama CK, Merlini L, Morini G, Wilden GRH. Quantitative Structure‐Activity Relationships of Sweet Isovanillyl Derivatives. 2001. Quant. Struct. Act. Relat.; 20: 3-16.

Berry C, Brusick D, Cohen SM, Hardisty JF, Grotz VL, Williams GM.

Sucralose Non-Carcinogenicity: A Review of the Scientific and Regulatory

Rationale. Nutr. Cancer. 2016 Nov-Dec;68(8):1247-1261.

Besnard P, Passilly-Degrace P, Khan NA. Taste of Fat: A Sixth Taste Modality? Physiol. Rev. 2016 Jan;96(1):151-76.

Birch GG, Karim R, Lopez A. Novel aspects of structure-activity relationships in sweet taste chemoreception. Food Quality and Preference 5 (1994) 87-93.

Briand L, Salles C. Taste perception and integration. In: Flavor: From Food to Behaviors, Wellbeing and Health (Woodhead Publishing Series in Food Science, Technology and Nutrition), 2016. Etiévant P, Guichard E, Salles C, Voilley A. Elsevier Ltd.

Brown RJ, de Banate MA, Rother KI. Artificial sweeteners: a systematic review of metabolic effects in youth. Int. J. Pediatr. Obes. 2010 Aug;5(4):305-12.

Calvo SS, Egan JM. The endocrinology of taste receptors. Nat. Rev. Endocrinol. 2015 Apr;11(4):213-27.

Canon F, Neiers F, Guichard E. Saliva and Flavor Perception: Perspectives. J. Agric. Food Chem. 2018;66(30):7873-7879.

Carniel Beltrami M, Döring T, De Dea Lindner. Sweeteners and sweet taste enhancers in the food industry. Food Science and Technology. 2018; 38.

Carocho M, Morales P, Ferreira ICFR. Sweeteners as food additives in the XXI century: A review of what is known, and what is to come. Food Chem. Toxicol. 2017 Sep;107(Pt A):302-317.

Carocho M, Morales P, Ferreira ICFR. Sweeteners as food additives in the XXI century: A review of what is known, and what is to come. Food Chem. Toxicol. 2017 Sep;107(Pt A):302-317

Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJ, Zuker CS. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 2006 Nov 16;444(7117):288-94.

Chandrashekar J, Hoon MA, Ryba NJ, Zuker CS. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 2006 Nov 16;444(7117):288-94.

Chattopadhyay S, Raychaudhuri U, Chakraborty R. Artificial sweeteners - a review. J. Food Sci. Technol. 2014 Apr;51(4):611-21.

Devillier P, Naline E, Grassin-Delyle S. The pharmacology of bitter taste receptors and their role in human airways. Pharmacol. Ther. 2015 Nov;155:11-21.

Dhartiben BK, Aparnathi KD. Chemistry and Use of Artificial Intense Sweeteners. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci. 2017; 6(6): 1283-1296.

Di Pizio A, Shoshan-Galeczki YB, Hayes JE, Niv MY. Bitter and sweet tasting molecules: it’s complicated. Neuroscience Letters 700 (2019) 56-63

Di Pizio A, Shy N, Behrens M, Meyerhof W, Niv MY. Molecular Features Underlying Selectivity in Chicken Bitter Taste Receptors. Front. Mol. Biosci. 2018 Jan 31;5:6.

Fulton James T. Processes in Biological Hearing. 2005. Available on the Internet: URL:http://www.hearingresearch.net

Gilbertson TA, Damak S, Margolskee RF. The molecular physiology of taste transduction. Curr. Opin. Neurobiol. 2000 Aug;10(4):519-27.

Grembecka M. Natural sweeteners in a human diet. Rocz. Panstw. Zakl. Hig. 2015;66(3):195-202.

Hartley IE, Liem DG, Keast R. Umami as an 'Alimentary' Taste. A New Perspective on Taste Classification. Nutrients. 2019 Jan 16;11(1). pii: E182.

Kier, L. B. (1972). A molecular theory of sweet taste.J. Pharm. Sci., 61, 1394-7.

Kinnamon SC. Taste receptor signalling - from tongues to lungs. Acta Physiol (Oxf). 2012 Feb;204(2):158-68.

Kurihara K. Umami the Fifth Basic Taste: History of Studies on Receptor Mechanisms and Role as a Food Flavor. Biomed. Res. Int. 2015;2015:189402.

Lemon CH. Modulation of taste processing by temperature. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2017 Oct 1;313(4):R305-R321.

Li F. Taste perception: from the tongue to the testis. Mol Hum Reprod. 2013 Jun;19(6):349-60.

Lindemann B. Receptors and transduction in taste. Nature. 2001 Sep 13;413(6852):219-25.

Loper HB, La Sala M, Dotson C, Steinle N. Taste perception, associated hormonal modulation, and nutrient intake. Nutr. Rev. 2015 Feb;73(2):83-91.

Melis M, Tomassini Barbarossa I. Taste Perception of Sweet, Sour, Salty, Bitter, and Umami and Changes Due to l-Arginine Supplementation, as a Function of Genetic Ability to Taste 6-n-Propylthiouracil. Nutrients. 2017 May 25;9(6). pii: E541.

Mooradian AD, Smith M, Tokuda M. The role of artificial and natural sweeteners in reducing the consumption of table sugar: A narrative review. Clin. Nutr. ESPEN. 2017 Apr;18:1-8.

Nuemket N, Yasui N, Kusakabe Y, Nomura Y, Atsumi N, Akiyama S, Nango E, Kato Y, Kaneko MK, Takagi J, Hosotani M, Yamashita A. Structural basis for perception of diverse chemical substances by T1r taste receptors. Nat. Commun. 2017 May 23;8:15530.

Rojas C, Todeschini R, Ballabio D, Mauri A, Consonni V, Tripaldi P, Grisoni F. A QSTR-Based Expert System to Predict Sweetness of Molecules. Front. Chem. 2017 Jul 25;5:53.

Roper SD, Chaudhari N. Taste buds: cells, signals and synapses. Nat. Rev. Neurosci. 2017 Aug;18(8):485-497.

Shankar P, Ahuja S, Sriram K. Non-nutritive sweeteners: review and update. Nutrition. 2013 Nov-Dec;29(11-12):1293-9.

Scott K. Taste recognition: food for thought. Neuron. 2005 Nov 3;48(3):455- 64.

Spencer M, Gupta A, Dam LV, Shannon C, Menees S, Chey WD. Artificial Sweeteners: A Systematic Review and Primer for Gastroenterologists. J Neurogastroenterol. Motil. 2016 Apr 30;22(2):168-80.

Suez J, Korem T, Zeevi D, Zilberman-Schapira G, Thaiss CA, Maza O, Israeli D, Zmora N, Gilad S, Weinberger A, Kuperman Y, Harmelin A, Kolodkin-Gal I, Shapiro H, Halpern Z, Segal E, Elinav E. Artificial sweeteners induce glucose intolerance by altering the gut microbiota. Nature. 2014 Oct 9;514(7521):181-6.

Tey SL, Salleh NB, Henry CJ, Forde CG. Effects of non-nutritive (artificial vs natural) sweeteners on 24-h glucose profiles. Eur J Clin Nutr. 2017 Sep;71(9):1129-1132.

van der Heijden A, van der Wel H, Peer HG. Structure-activity relationships in sweeteners. I. Nitroanilines,sulphamates, oximes, isocoumarins and dipeptides. Chemical Senses Vol.10 no. 1 pp.57-72, 1985a.

van der Heijden A, van der Wel H, Peer HG. Structure-activity relationships in sweeteners. II. Saccharins, acesulfames, chlorosugars, tryptophans and ureas. Chemical Senses Vol.10 no. 1 pp.73-88, 1985b.

Feng Zhang, Boris Klebanskyb , Richard M. Fineb, Haitian Liua, Hong Xua, Guy Servanta, Mark Zollera, Catherine Tachdjiana, and Xiaodong Lia. Molecular mechanism of the sweet taste enhancers, Edited* by Solomon Snyder, Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, (2010)