Tecniche di conservazione per scopi particolari »

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La coltura in vitro in condizioni di crescita rallentata è una tecnica a basso costo impor- tante per la conservazione ex situ delle piante con semi non ortodossi e per quelle propagate vegetativamente, quali le specie da frutto. Si attua adottando diverse strategie, quali l’abbas- samento della temperatura (2-4°C) e dell’intensità luminosa, la riduzione del contenuto del- la fonte di carbonio e della concentrazione in sali minerali (macro e microelementi), la va- riazione dei livelli di regolatori di crescita (qualità e concentrazione), l’aggiunta di ritardan- ti di crescita (quali l’acido abscissico), la riduzione del livello di ossigeno, ecc. I principali vantaggi delle collezioni in vitro di germoplasma risiedono negli spazi ridotti richiesti, nella facilità di scambio dei genotipi e nella riduzione dei rischi di perdite accidentali dovute a fat- tori biotici ed abiotici.

In particolare, la coltura in vitro in crescita rallentata permette di conservare facilmente un grande numero di piante sane e rispondenti dal punto di vista genetico al materiale di partenza (true-to-type).

Una recente innovazione della coltura in

vitro si basa sul concetto di seme sintetico

o seme artificiale, consistente in un embrio- ne somatico o una gemma da vitrocoltura incapsulati artificialmente, cioè inseriti in una matrice di alginato di calcio a forma- re capsule che possono essere utilizzate per la conservazione o per la semina in vitro o

ex vitro. Nei semi sintetici, la matrice di al-

ginato di calcio può contenere un endosper- ma artificiale con funzioni trofiche e pro- tettive, pesticidi, fertilizzanti e microrgani-

ci arbuscolari e batteri promotori della crescita di piante. I semi sintetici hanno trovato, di recente, importanti applicazioni nella conservazione di espianti in azoto liquido (criocon- servazione).

Per quanto riguarda le collezioni in vitro di germoplasma, esistono, ad esempio, una colle- zione di genotipi di caffè in Costa d'Avorio e una di oltre 1400 accessioni di banana (Musa sp. pl.) presso l’INIBAP Transit Centre (ITC) della Katholieke Universiteit di Leuven (Belgio).

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– Il principale aspetto critico è la “variabilità somaclonale”, cioè la variabilità genetica o epige- netica originata durante lunghi cicli di col-

tura in vitro che produce somacloni, cioè ge- notipi portatori di diversità, stabile o tem- poranea, rispetto alla pianta madre. La va- riabilità genetica deve essere assolutamen- te evitata nel caso della propagazione clo- nale (micropropagazione) o della conserva- zione del germoplasma, ricorrendo sia a pro- cedure che ne limitano l’insorgenza (quali l’impiego di dosi basse di regolatori di cre- scita ed evitare la produzione di callo), sia a strumenti efficienti (marcatori molecola- ri, citofluorimetro) in grado di evidenziar- la.

– Un altro punto di criticità è dovuto alla mancanza di efficienti protocolli di coltu- ra e morfogenesi in vitro per molte specie vegetali.

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1. Coordinamento da parte delle istituzioni scientifiche preposte ed interessate; 2. individuazione e caratterizzazione dei genotipi da conservare;

3. messa a punto di efficienti protocolli di coltura in vitro per ciascuna specie da conservare; 4. ampliamento del numero e della consistenza delle collezioni in vitro;

5. nelle collezioni già operanti, controllo periodico della stabilità genetica e dell’eventuale in- sorgenza della variabilità somaclonale, mediante analisi genetica (marker molecolari, cito- fluorimetro);

6. sviluppo di programmi di ricerca sul seme sintetico e sul suo impiego nella conservazione in

vitro e nella crioconservazione.

Limonium avei (de Not.) Brullo et Erben (Plumbaginace- ae). Specie rara con distribuzione frammentaria, presente

in pochissime stazioni in Sicilia e Sardegna ed in una sola località in Liguria occidentale, micro propagato a partire da infiorescenze immature. (Foto Annalisa Giovannini)

4.2.2 Crioconservazione

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La crioconservazione (conservazione in azoto liquido), per quanto sia una tecnica di recen- te applicazione al settore vegetale, già oggi garantisce il mantenimento in sicurezza genetico- sanitaria di consistenti quantitativi di germo-

plasma conservato in criobanche operanti in varie parti del mondo.

Alla temperatura dell’azoto in fase liqui- da (-196°C) le cellule vegetali, opportuna- mente predisposte a tollerare un rapido ultra- raffreddamento, entrano in uno stato di “quiescenza assoluta” e si conservano vitali per tempi teoricamente illimitati. Dopo il re- cupero dall’azoto liquido e il ritorno a tem- peratura ambiente, gli espianti (gemme da vi- trocoltura, embrioni somatici e linee embrio- geniche, semi ed assi embrionali), tal quali o incapsulati in alginato (semi sintetici), pos- sono riprendere la loro piena funzionalità ed essere riportati in condizioni standard di col- tura in vitro.

Le tecniche moderne di crioconservazio- ne, quali quelle del trattamento con solu- zione vitrificante, di incapsulazione-disi- dratazione, di incapsulazione-vitrificazio- ne e di congelamento in goccia, permetto- no l’immersione diretta degli espianti in azoto liquido e si affiancano al metodo tra- dizionale di raffreddamento controllato. Tutte le tecniche si servono di sostanze crioprotettive (quali glicerolo e DMSO) e si basano sul processo di vitrificazione de- gli espianti. La crioconservazione richiede spazi assai contenuti e permette di limita- re i costi della conservazione a quelli rela- tivi al mantenimento nei contenitori del giusto livello di azoto liquido, una sostan- za facilmente reperibile e di costo contenu- to. La tecnica garantisce inoltre l'assoluta sicurezza genetico-sanitaria del materiale conservato.

L’Unione Europea sostiene la crioconser- vazione con l’Azione COST 871 - CryoPla-

Crioconservazione di apici meristematici. Gli apici, pro- venienti da coltura in vitro, sono immersi in crioprotetti- vi all’interno di crioprovette da 2 cc (riquadro in alto) che sono poi conservate immerse in azoto liquido, a -196°C. (Foto Maurizio Lambardi)

net, Cryopreservation of Crop Species in Europe (2006-2010), sottoscritta da 18 Paesi dell’UE

tra cui l'Italia.

Le più importanti criobanche vegetali si trovano oggi in USA (presso l’USDA di Fort Col- lins), Belgio (presso la Katholieke Universiteit di Leuven), Germania, Francia e Canada. Nel nostro Paese mancano esempi di criobanche già operative. Peraltro, sono attualmente in studio presso il CNR-IVALSA progetti per la realizzazione di criobanche di antiche accessioni di Ci-

trus sp. pl., con finanziamento dell’Ente Cassa di Risparmio di Firenze, e di germoplasma del

Veneto, in collaborazione con Veneto Agricoltura.

C

In Italia la crioconservazione non è ancora uscita dal contesto dei laboratori di ricerca. In altri termini, a differenza di quanto si registra in molti altri Paesi, sia dell’UE che extra comunitari, non si hanno ancora esempi di criobanche del germoplasma, né tantomeno esi- ste una rete di crioconservazione in grado di affiancare gli altri metodi di conservazione. In tal senso, occorre sottolineare che la conservazione in azoto liquido va considerato un si- stema complementare e non alternativo ai tradizionali metodi di conservazione ex situ. In- fatti, è dalla combinazione di approcci diversi di conservazione in situ ed ex situ che si at- tua la massima tutela della biodiversità vegetale, riducendo al minimo il rischio di perdite accidentali di germoplasma. Ad esempio, nel caso delle specie a propagazione vegetativa, in un contenitore di azoto liquido di dimensioni medio-grandi (ad esempio 100 litri) è pos- sibile replicare una collezione in campo pa- ri a 2-3 ettari. Quest’ultima assolverà la funzione di rendere “prontamente disponi- bile” materiale di propagazione a chi ne fa richiesta, mentre alla crioconservazione spetterà il compito di salvaguardare la col- lezione da tutti i possibili rischi di perdite di germoplasma a seguito di imprevisti (in- sorgenza di gravi fitopatie, eventi climati- ci eccezionali, incendio, ecc.).

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1. Promuovere la tecnologia criogenica in Italia, evidenziandone le importanti potenzialità ap- plicative alla conservazione della biodiversità vegetale, anche a difesa del patrimonio vege- tale storico.

2. Creare un primo esempio di criobanca operante sul territorio che possa essere da innesco al- la creazione di una rete di crioconservazione al servizio del Paese.

3. Implementare la tecnologia su un numero sempre più ampio di specie vegetali.

Sviluppo di germogli di rosa da “semi sintetici”, capsule di alginato contenenti gemme ascellari da coltura in vi-

4.3 COLLEZIONI IN CAMPO