L'ENOLOGO tr GIUGNO
2OI3
Roffoele
Ouzzon
Giqcomo
Widmonn
Dqnielq
Bertoldi
Tiziono
Nordin,
Roberto
lsrcher
Giorgio
Nicolini
Chimica Vitienologica & Asroalimentare, C e ntr o Tr asferimenlo T e c nolo gic o, FEM - San Michele all'Adige(ZN)Da sinistra: R. Guzzon, G. Nicolini, T. Nardin, R. Larcher, D. Bertoldi
IhAIERIAI.I
INNOUAIIUI
PER
I.A
PROTEZIONE
DEI.IE
BOIII DAllE
CO
NIAIhI
NAZIO
N
I Ii|II
C
RO
B I C
H
E
La sanificazione
chimico-fisica
delle barriques
appare
sempre
meno
sostenibile'
ll trattamento
sperimentato
sembra
poter conferire
al legno maggigre
resistenza
agli attacchi
mibrobici
senza
pregiudizio
delle,caratteristiche
utili alla maturazione
del
viÉo. I risultati
di laboratorio
sbno incoraggianti
e possono
aprire
la strada
alla verifica
della
compatibilità
con le bevande
alcolióhe
e della applicabilità
in scala
di cantina.
Premesso
Le botti sono uno strumen-to enologtco prezioso ma è noto che la porosità del legno p u ò f a v o r i r e l a c r e s c i t a d i una complessa microflora, in grado di causare alterazioni dei vini. Le botti nuove sono n o r m a l m e n t e p r i v e d i m i -crorganismi alterativi ma, già dopo pochi mesi dr utlhzzo, la concenlrazione di lieviti e batteri presenti sulla suPerfi-cie interna di questi vasi vi-n a r i p u ò s u p e r a r e le m i l l e cellule per cm2. I trattamenti
oggi disponibili per la pulizia e la sanificazione delle botti p o s s o n o c o n t e n e r e q u e s t a crescita senza, tuttavia, forni-re soluzioni "definitive" Per le quali occorrerebbe "ripen-sare" in il materiale stesso c o n c u i l e b o t t i s o n o f a t t e , cioè il legno.
Un utile contributo in que-sta direzione potrebbe venire dal trattamento del legno con composti a base di silice de-n o m i de-n a t i a l c o s s i d i . C o m e hanno dimostrano apPlica-zrorrr in campo elettronico, ottico ed edilizio, derivati
or-ganici della silice - sintetiz-z a f i m e d i a n t e u n p r o c e s s o chimico denominato solgel -sono utili per ottimizzare le proprietà superficiali di vari materiali. Nel caso de1 legno, i più comuni metodi di tratta-mento con derivati della sili-ce tuttavia implicano condi-ziont chimico/fisiche drasti-che - necessarie per favorire l e r e a z t o n i a l l a b a s e d e l l a formazione dei polimeri sili-cei - che non si adattano ad
apphcazioni che richiedono il mantenimento delle Pro-prietà superficiali native del
i
I
L'ENOLOGO tr GIUGNO 2OI3
legno stesso. In questo caso, una valida alternativa - pro-posta in settori più affini alla scienza enologica come quell o b i o quell o g i c o e m e d i c a quell e -consiste nell'utilizzo diretto d i a l c o s s i d i . c o m e i l m e t i l -trietossisilano (MTES) in fa-se gassosa.
In questo lavoro viene de-scritta I'apphcazione del me-todo generale di rivestimento di materiali organici con un polimero organo-siliceo, de-rivato da MTES in fase gas-sosa, per il trattamento della superficie interna delle barri-ques in modo da migliorarne le caratteristiche di resistenza ai microorganismi alterativi del vino. Allo stato attuale le p r o v e s o n o s t a t e r e a h z z a f e e s c l u s i v a m e n t e s u s c a l a d i laboratorio, tuttavia gli inco-r a g g i a n t i inco-r i s u l t a t i o t t e n u t i fanno ritenere utile e oppor-tuna in futuro la verifica sia della corrispondenza del trat-tamento ai requisiti di com-patibilità con le bevande al-coliche che della reale appli-cabilità in scala di cantina. Il lavoro testimonia la capacità della ricerca italiana di ope-rare nel campo dell'innova-zione tecnologi c a finahzzata a cefcare e validare soluzioni a problemi concreti della tra-sformazione enologica.
S i n t e s i e p r o p r i e t à d e l p o l i m e r o o r g a n o - s i l i c e o . Per tutti gii esperimenti sono stati impiegati blocchetti di legno di rovere di 50x40x30 f f i f f i , r i c a v a t i d a d o g h e d i barriques a media tostatura nuove, che sono stati rivestiti con paraffina su cinque lati p e r s i m u l a r e l a c o n d i z i o n e delle botti dove solo una fac-cia delle doghe è a contatto con il vino. I campioni di le-gno sono stati quindi esposti i n u n a c a m e r a d i r e a z i o n e (Fig. 1) a un trattamento su-p e r f i c i a l e c o n i v a su-p o r i d e l p r e c u r s o r e s i l i c e o ( M T E S ) , che, caratterrzzato da un pun-to di ebollizione relativamen-t e b a s s o . in relativamen-t o r n o a i I 4 0 " C , era trasferito da un flusso di azoto da una seconda camera riscaldata e pressurrzzata. Al momento del contatto tra le-gno e MTES, I'umidità natu-ralmente presente sui bloc-chetti favoriva la
polimeriz-fub. | . Principoli
(orollerisliche dei rompioni di leqno dopo lrqttumenlo
(on meliltrietoisisilano (tUlIESl
in fqse gosiosa (lhedíq r SD; n = 5l
Legno non trattato Legno trattato
zazione dei monomeri silicei s u l l a s u p e r f i c i e d e l l e g n o . Sono stati testati diversi tem-pi di trattamento, tra i 5 e i 2 0 m i n u t t , a l t e r m i n e d e i quali i campioni di legno so-no stati posti per 60 minuti a 25" C per dar il tempo al po-limero di stabilizzarsi.
La caratterizzazrone chi-mico/fisica del materiale così ottenuto ha visto l'impiego di diversi approcci analitici. Le osservaziont al microsco-p i o s o n o s t a t e e s e g u i t e s i a con microscopio ottico (Ni-kon SMZ80) che con un mi-croscopio elettronico a scan-sione (SEM). Inoltre, per de-finire con precisione la strut-tura molecolare del polimero s i l i c e o è s t a t o a c q u i s t o l o spettro NMR del 2eSi utiliz-zando un NMR allo stato so-l i d o ( B r u k e r 4 0 0 V / B ) . L a determin azrone quantitativa del silicio è stata invece svol-fa rn spettrometria di massa al plasma accoppiato indutti-vamente (ICP-MS) utlhzzan-do un apparato Agilent 7500 su campioni precedentemen-te mineralizzatr.
Test biologici. Sono stati condotti anche test biologici per valutare la reale efficacia del polimero organo-siliceo nel prevenire le contamina-zioni microbiche senza alte-rare i processi fermentativi. Prove di fermentazione sono state eseguite in terreno sin-tetico in cui erano stati pre-cedentemente immersi cam-p i o n i d i l e g n o t r a t t a t i c o n MTES.
Per quanto riguarda la pro-tezione da microrganismi al-terativi, le prove di contami-nazione dei blocchetti di le-gno sono state eseguite me-diante immersione dei cam-p i o n i i n c o l t u r e d i d i v e r s e
1.8r0.8
1 . 3 + 1 . 6
2.5*.f
.I
specie di microrganismi rite-nuti alterativi nel settore eno-logico. I blocchetti di legno sono stati mantenuti in con-t a con-t con-t o c o n l a c o l con-t u r a p e r l 4 giorni a20"C dopo di che so-no stati eseguiti dei lavaggi v o l t i a s i m u l a r e i c o m u n i trattamenti di cantina e le ca-riche microbiche superficiali residue sono state determina-t e s e c o n d o l a n o r m a I S O
18593:200419.
C e s s i o n e d i f e n o l i . C o n questo esperimento si è volu-to valutare se la membÍaîa o r g a n o - s i l i c e a s u p e r f i c i a l e salvaguardasse ancora, gra-zie alla sua micro porosità, la c e s s i o n e d i f e n o l i s e m p l i c i nel vino da parte del legno. Per far questo i campioni di legno trattatr con MTES so-n o s t a t i p o s t i a m a c e r a r e iso-n vino bianco per 16 giorni. Al termine, i fenoli ceduti al vi-no sovi-no stati analizzati con u n H P L C ( A l l i a n c e 2 6 9 5 ) dotato di detector coulome-t r i c o e c o l o n n a S u p e l c o Ascentis Express.
Risultqti
e
discussione
I l m a t e r i a l e e l a s u a struttura. Al termine del ri-v e s t i m e n t o d e i c a m p i o n i è stato dapprima valutato se il rivestimento siliceo induces-se modificazioni fisiche nella struttura del legno. Non sono state osservate variazioni si-gnificative nel peso e nelle d i m e n s i o n i d e i c a m p i o n i (Tab. 1) soprattutto se con-frontiamo i risultati ottenuti con i dati relativi ai tratla-menti Íradtzronali di legno con alcossisilani. Per le ap-phcazioni di interesse enolo-gico, ed in particolare per le
0.06t0.01
2.7x.I.1
0.79+0.26
L7+0.6
1.78x0.47
2.1*0.9
2.2510.41
barriques, questo risultato è di particolare rmportanza perché una delle caratteristi-che peculiari di queste botti è che sono ottenute per inca-stro delle doghe di quercia, s e î z a u s o d i g i u n t u r e . I n queste condizioni forti varia-zioni dimensionali portereb-bero a fratture nelle botti e perdita di tenuta.
L'analisi elementare dotta mediante ICP-MS con-ferma la presenza dr silicio sulla superficie del legno al termine der trattamenti con MTES in fase gassosa (Tab. 1) in quantità proporzionale al tempo di trattamento. Le osservazioni condotte con il SEM dimostrano 1'effettiva formazione di una membrana silicea uniforme sui campio-n i d i l e g campio-n o . I l p r o f i l o campio-n o campio-n omogeneo tipico della super-f i c i e n a t i v a d e l l e g n o ( F i g . 2A) è evidentemente modifi-cato dallo strato siliceo (Fig. 28) ottenendo una superficie liscia e omogenea. Questi ri-sultati trovano conferma in precedenti lavori che si sono occupati di trattamenti super-ficiali del legno con derivati d i s i l i c e p e r a u m e n t a r n e la resistenza aglt attacchi biolo-g i c i . T u t t a v i a n e l p r e s e n t e caso le modificazioni super-ficiali e la rrduzione di poro-sità sono ottenute in condi-ziom di reazione più blande e in tempi rapidi. Inoltre I'uti-l i z z o d i u n f I'uti-l u i d o g a s s o s o consentirà in futuro di tratta-re anche superfici complesse o di difficile accesso, come appunto la superficie interna delle barriques che, infatti, già oggi sono sovente sanifi-cate con vapore.
La conformazione moleco-lare della membrana silicea è stata definita mediante anali-si NMR allo stato solido. Lo
10
15
L'ENOLOGO tr GIUGNO 2OI3
tab.2. Costonti
rinetirhe dclle fermentczioni
condotle
ron Sorrhoronyccs
rerevirioe In presenzo
di
(onpioni di legno.
Campione
t*ro",v#Uor
r-,1
r.r*.Ît*ili$.
tE,t
Cellule di lievito nel mezzo al 507o della fermentazione (x107 celUml)
Krn
Legno non trattato
1 . 1 5
t 0 . 0 1
0.30
t 0.01
6 4 . 1
x . 0 . 9
1 . 9
t 0 . 1
Legno trattato (5 min)
1 . 1 6
t 0 . 0 2
0.20 r 0.02
6 3 . 1
t 0 . 5
1 . 8
+ 0 . 2
Legno trattato (10 min)
1.09
t 0.01
0 . 1 9
t 0 . 0 1
6 2 . 9
x . 0 . 9
1 . 8 t 0 . 1 Legno trattato (15 min)1.20
t 0.01
0.23 + 0.01
63.2
+ 0.6
1 . 8
t 0 . 1
spettro del 2eSi (Fig. 3) evi-denzia la presenza delle unità strutturali T3 [H3CSi(OSI)3] e T 2 [H3CSi(OSI)2OR] e la completa assenza di mono-meri residui non polimerrz-zati (TI). Questi risultati in-dicano che il polimero for-matosi sulla superficie del le-gno è stabile e non sono pres e n t i r e pres i d u i l i b e r i c h e p o -trebbero essere rilasciati nel vino durante il contatto con il legno fraftafo.
Protezione dai contami-nati. Visti gli scopi del lavo-ro, l'effetto protettivo della membrana organo-silicea è stato studiato focalt zzando I' attenzione sui principali microrganismi alterativi in c a m p o e n o l o g i c o ( F i g . 3 ) . I campionamenti microbiolo-gici superficiali dimostrano che nei legni ftattati con sili-ce un lavaggio blando, svolto con acqua calda, garantisce un abbattimento della
con-centr azione microbica super-ficiale di almeno due unità logaritmiche. In condizioni reali, considerando la comu-ne contaminaziocomu-ne microbica delle botti, questo risultato sarebbe sufficiente a consi-derare le botti prive di carica microbica contaminate. Nel caso del legno non trattato, u n a n a l o g o l a v a g g i o l a s c i a una carica microbica decisa-mente più elevata.
Per spiegare l'effetto pro-tettivo della membrana orga-no-siliceo occorre considerare diversi aspetti. E' noto che il polimero ottenuto da MTES abbia un carattere idrofobo, in grado di sfavorire I'adesione delle cellule alla superficie ri-ducendo le interazioni chimi-che tra le cellule e substrato tipiche dei meccanismi di
for-mazione di biofilm. Inoltre, la deposizione della membrana organo-silicea riduce la ma-cro porosità del legno, impe-dendo una profonda penetra-zione di microrganismi nel materiale al riparo dar tratta-menti di pulizia.
Compatibilità biologica. L'assenza di interfereîze rte-gative con I'attività dr Sac-charomyces cerevisiae è sfata valutata mediante
fermenta-zioni in substrati sintetici a di-retto contatto con campioni di legno tratfato e non. I dati so-no stati trattati seguendo l'ap-proccio Lineweaver & Burk per determinare le costanti ci-netiche di processo. In Tab. 2 sono riportatr i parametri utili per confrontare i processi fer-mentativi. Nessuna differenza è stata trovata úaIe V-* delle fermentazioni svolte in pre-senza di blocchetti di legno rivestiti o meno. Anche la K. e la resa della fermentazione non variavano nelle diverse prove e sono nel range tipico di Sqccharomyces cerevisíae. La misura della densità cellu-lare nel mezzo,dopo il consu-mo del 50Vo di zuccheri, dis-sipa definitivamente i dubbi circa la tossicità della mem-b r a n a o r g a n o - s i l i c e a p e r l e cellule presenti nel mezzo. I dati infatti mostrano una ele-vata concenffazione di lieviti, superiore alle 107 cell/ml, ti-pica di Saccharom))ces cere-visiae, durante la fermenta-zione alcolica.
Interazioni tra vino e le-gno. La Fig. 4 mostra il con-fronto tra i contenuti medi di f e n o l i s e m p l i c i m i s u r a t i i n vino dopo un periodo di 16 giorni di contatto tra il vino e i campioni di legno trattati o
m e n o c o n s i l i c e . N e s s u n a drfferenza statisticamente si-gnificativa dovuta al tratta-mento è stata riscontrata per i composti analizzati. L' unica e c c e z i o n e è r a p p r e s e n t a t a dall'acido omovanillico, una molecola di scarsa rrlevanza enologica e forte ossidabilità. I 1 c o m p o r t a m e n t o a m b i v a -lente della membrana silicea, in grado di permette la
mi-grazione di piccole molecole ma, allo stesso tempo, capa-ce di contrastare la mrgrazio' ne di strutture che hanno un a l t o s i g n i f i c a t o b i o l o g i c o quali cellule, anticorpi o pro-teine, è già stato descritto in precedenza.
N e l p r e s e n t e la v o r o s i è messo in evidenza come, no-nostante il film organo-siliceo copra uniformemente il le-gno, la trama che risulta dalla condensazione delle unità di MTES, [(CH3)Si](OEQ" (n = 1,2,3),crei una micro porosità che permette la piena conser-vazione degli scambi chimici, senza interferenze corr il pro-cesso di invecchiamento del vino in cui le fraziom fenoli-che rilasciate dalle botti gio-cano un ruolo fondamentale.
Considerozioni
l o
f onf Iuslue
A n c h e p e r r i s p o n d e r e a i desideri dei consumatori più attenti, nell'industria
enolo-gical'attenzione dei tecnici è sempre più diretta all'otteni-mento di prodotti a basso im-patto ambientale, senza pre-giudicare la qualità e la salu-brità dei vini" In questo sen-so, i tradizionali trattamenti di sanificazione, basati su un a m p i o i m p i e g o d i p r o d o t t i chimici e/o di energia,
appa-L'ENOLOGO t] GIUGNO 2OI3
fig. | - Sehemo
dell'opporuto
per il troltonenlo del legno con metiltrie.
toisisilono
(lhTESl
in fàie gossoso
fntralaAroto
Material Chemistry.,
18(40),
4839-4848.
Carturan,
G., Campostrini,
R., Tognarra,
L., Boninsegna,
S . , D a l T o s o o
R . , & D a l
Monte, R. (2006).
Gas-Phase
Silicon Alkoxide Reactivity
vs. Na-Alginate Droplets for
Conjugation of Alginate and
Sol-Gel Technologies.
Jour-nal of Sol-Gel Science
and
Technolo
gy , 37 (I), 69-77
.
De Vetter,
L., Cnuddeo
V.,
Masschaele,
8., Jacobs,
P.J.S.,
& Van Acker J. (2006).
Detec-tion and distribuDetec-tion analysis
of organosilicon
compounds
in
wood by means
of SEM-EDX
and Micro-Ct. Material
Cha-ractenzatton,
56, 39 -48
.
D o n a t h ,
S . , M i l i t z , H . , &
Mai, C. (2010).
Wood
modi-fication with alkoxysilanes.
Wood Science
and
Techno-l o g y ,
3 8 ( 7 ) , 5 5 5 - 5 6 6 .
Guzzon,
R., Carturan,
G.o
Krieger-Weber,
S., &
Cavaz-za A. (2012).
Use of
organo-silica immobili zed bact"erra
produced
in a pilot scale plant
to induce malolactic
fermen-tation in wines that contain
lysozyme.
Annals of
Micro-biology,
62(L),
38 1 -390.
Guzzon,
R., Widmann,
G.,
M a l a c a r n e ,
M . , N a r d i n ,
T . ,
N i c o l i n i G . , & L a r c h e r R .
(20II). Survey of the yeast
population inside wine
bar-rels and the effects of certain
techniques
in preventing
mi-crobiological spoilage.
Euro-pean Food Research
Techno-logy, 233(2),285-291.
Guzzon,R.,
Nardin, T.,
Mi-cheletti,
O., Nicolini, G. &
Larcher
R. (2013).
The
anti-microbial activity of ozone.
Effectiveness
against
the main
wine spoilage
microorga-nisms and evaluation
of im,
pact on simple phenols
in
wi-ne. Aus. J. Grape
Wine Res.
(doi: 10.1
IIII ajgw
.1201
8)
Larcher,
R., Nicolini, G.,
B e r t o l d i ,
D . , & N a r d i n ,
T .
(2007). Determination
of
4-e t h y l c a t 4-e c h o l
i n w i n e b y
h i g h - p e r f o r m a n e
e l i q u i d
chromato
graphy-coulome
-tric electrochemical
array
de-tection. Analitica Chimica
Acta, 609(2),235-240.
Larcher,
R., Puecher,
C.,
R o h r e g g e r ,
S . , M a l a c a r n e ,
M. & Nicolini, G. (2012).
4-Ethylphenol and
4-ethylgua-iacol depletion in wine using
Íig. 2 - illorfologiq
del legno primo (Al e dopo
(BI..il
trqttqnentó.d.i
ricopdrturà
(operiuru
eon il
polinero orgono'siliceo
iono sempre meno sostenibili e nuovi approcci alla preven-zione della contamin azroîe microbica sono auspicabili.
In questo lavoro è stata de-scritta una soluzione alterna-tiva, basata sulla sintesi di un nuovo materiale composito ottenuto per deposizione gas-sosa di una membrana di sili-ce sul legno delle barriques. La membrana silicea si è di-mostrata in grado di garanti-re al legno il mantenimento dei fenomeni essenztali al processo di maturazione del vino, legati alle cessioni di composti fenolici semplici, r i d u c e n d o n e l c o n t e m p o l a
s e n s i b i l i t à d e l l e g n o s t e s s o agli attacchi da parte dei mi-crorganismi contaminati. I ri-sultati ottenuti in laboratorio dovranno essere validati cir-cala corrispondenza del trat-tamento ai requisiti di com-patibilità con le bevande al-c o l i al-c h e e d e v e n t u a l m e n t e "esportati" in condiziont rea-li di cantina, su botti intere, al fine di verificare l'effetti-va applicabilità delle soluzio-ni proposte all'industria eno-logica.
Ringraziamenti. Si ringra-zia per la collaborazione e il supporto analítíco la dott.ssa Emanuela Callone del Dip. I n g e g n e r i a d e í M a t e r i a l i e Tecnologie Industríali del-l' Università di Trento,
Bibliogrofiq
essenzisle
A v n i r , D . , C o r a d i n o T . , Lev O., & Livage, J . (2006) . R e c e n t b i o - a p p l i c a t i o n s o f sol-gel materials. Journal of Material Chemistry, 16(1 1),
1 0 1 3 - 1 0 3 0 .
Callone, 8., Campostrini, R . , C a r t u r a n , G . , C a v a z z a , A . , & G u z z o n , R . ( 2 0 0 8 ) . Immobilization of yeast and bacteria cells in alginate mi-crobeads coated with silica m e m b r a n e s : p r o c e d u r e s , p h y s i c o - c h e m i c a l f e a t u r e s a n d b i o a c t i v i t v . J o u r n a l o f
L'ENOLOGO tr GIUGNO
2OT3
E Legno non trattato
E 'Eo o s o o ' 6 o o G o a c g o a 1 , E + O 5 8 , E + 0 4 6,E+O4 4,E+O4 2 , E + O 4
fio. 3 . Riduzione
dellq cqritq nicrobito
qu-o
coldu
ill legni truttqfi (verdel
o non
sìlono in fqse gossosu.
superficiule
dopo lovoggio
ron or'
trlttqti (rossoi
con mòtìltrietossi'
fio. 4 . Gonfronto
trq il rontenuto
medio
di fenoli nel vino biqnco
dopo | ó
giórni di contulto
con i ronpioni di legno
(per esigenze grafiche l'altezza delle barre di 4-attitsiringo^lo e,.4-vinilguaiacolo è stata ingrandita I0 iolte, m"entie fer"acido gallico e tirosolo è stata ridoîta l0 volte)
e s t e r i f i e d
c e l l u l o s e ,
F o o d
Chemistry, 132, 2126-2130
.
O e l o f s e ,
A . , P r e t o r i u s ,
I .
s., & Du Toir, M. (2008).
si-gnificance of Brettanomyces
and Dekkera during
winema-k i n g : a s y n o p t i c r e v i e w .
S o u t h A f r i c a n J o u r n a l o f
E n o l o g y a n d V i t i c u l t u r e ,
29(2),
128-144.
S i n g l e t o n ,
V . L . ( 1 9 9 5 ) .
M a t u r a t i o n o f W i n e s a n d Spirits: Comparisons, facts, a n d h y p o t h e s e s . A m e r i c a n Journal of EnologY and Viti-colture, 46(I), 98- 1 15.M a i , C . , 8 . M i l i t z , H . (2004). Modification of wo-od with silicon compounds. inorganic silicon comPounds a n d s o l g e l s y s t e m s : a r e -view. Wood Science and
Te-chnology, 37 (5), 339 -348. Vignali, F., Predieri, G., Fe-ci, E., Palanti, S., Baratto, M. C., Basosi, R.o Callone, E., & Mùller K. (2011). InterPene-tration of wood with NH2R-functionalized silica xerogels anchoring copper(Il) for Pre-servation purposes. Journal of Sol-Gel Science and Techno-logy,60(3), 445-456.
B Legno non trattato (n=10) s Legno trattato (n=L5) u o c o o o o 6 2 o o F e E 1
