RIASSUNTO
Le nanoparticelle (NP) sono definite come materiali con almeno una delle tre dimensioni minore di 100 nm e, rispetto alle loro controparti macromolecolari, si distinguono per via delle loro peculiari caratteristiche chimico-fisiche che possono renderle più resistenti, migliorarne le attività catalitiche e le proprietà ottiche.
In conseguenza di tali proprietà, negli anni recenti lo sviluppo dell’industria nanotecnologica è aumentato notevolmente e, di conseguenza, anche l’esposizione umana e ambientale a tali materiali nanostrutturati. I nanomateriali, infatti, sono già utilizzati in molteplici applicazioni quali cosmetici, creme solari, protesi dentali, impianti ortopedici, ed il loro impiego è destinato ad aumentare sia in ambito industriale che biomedico. Studiare quali siano i rischi associati all’esposizione alle NP, come interagiscono con i sistemi biologici e quali siano gli effetti sull’uomo e sull’ambiente è di fondamentale importanza.
Questo lavoro di tesi si pone l’obiettivo di indagare, in colture cellulari umane, le relazioni esistenti tra nanoparticelle di biossido di titanio (TiO2 NP), sia non rivestite che
differentemente rivestite con ossido di silicio o citrato, ed un materiale di riferimento (P25 Aeroxide), e la loro potenziale citotossicità e genotossicità, enfatizzando il ruolo svolto dalla diversa chimica di superficie. Nell’ambito del progetto di ricerca europeo Sanowork sono stati condotti esperimenti in vitro utilizzando cellule epiteliali polmonari di tipo-II (linea cellulare A549), riconosciute come modello per lo studio dell’esposizione inalatoria ai nanomateriali. Lo studio è stato condotto attraverso i seguenti saggi:
• Colony forming efficiency assay (CFE)
• Citokinesis-block micronucleus cytome assay (CBMN Cyt) • Fluorescence in situ hybridization (FISH)
• Comet assay (con e senza l’utilizzo di enzimi di restrizione EndoIII e Fpg)
Il saggio di efficienza di formazione di colonie (CFE) ci ha permesso di valutare la vitalità cellulare attraverso la capacità clonogenica cellulare.
Il test del micronucleo, nella sua versione con blocco della citodieresi (CBMN Cyt), ha consentito l’analisi del danno cromosomico indotto a carico di cellule binucleate che, grazie all’azione della Citocalasina-B, non possono completare il processo di divisione cellulare. I biomarcatori di danno cromosomico analizzati sono: micronuclei, piccoli nuclei accessori persi durante la divisione cellulare, ponti nucleoplasmatici come indicatori della
formazione di cromosomi dicentrici e/o fusioni telomeriche, ed evaginazioni nucleari generate dall’eliminazione di DNA amplificato o di complessi di riparazione. Tramite il CBMN Cyt, inoltre, è stato possibile valutare anche la citostasi e la citotossicità indotta dalle TiO2 NP mediante l’analisi della proliferazione cellulare, dell’apoptosi e della
necrosi.
La genotossicità indotta è stata risolta ulteriormente differenziando meccanismi clastogeni ed aneuploidogeni attraverso l’ibridazione fluorescente in situ (FISH) con l’uso di sonde pancentromeriche.
Con il test della cometa (comet assay) è stata verificata la presenza di rotture del DNA a singolo o doppio filamento e, attraverso l’utilizzo di enzimi di restrizione quali EndoIII e Fpg, è stato possibile discriminare i danni ossidativi a carico delle basi pirimidiniche e puriniche.
I risultati ottenuti evidenziano come la chimica di superficie influenzi le diverse proprietà chimico-fisiche delle TiO2 NP, ed in particolare la loro dimensione, determinando
differenti risposte citogenetiche nelle cellule A549.
