Ruolo del pathway di irisina negli effetti cardio-metabolici di un succo di mandarino somministrato a ratti alimentati con dieta "high fat"

UNIVERSITÀ DI PISA

DIPARTIMENTO DI FARMACIA

Corso di Laurea Magistrale in Farmacia

TESI DI LAUREA

Ruolo del pathway di irisina negli effetti cardio-metabolici

di un succo di mandarino somministrato a ratti alimentati

con dieta "high fat"

Relatori:

Candidata:

Prof.ssa Lara Testai Elena Braccagni

Prof. Vincenzo Calderone

Dott. Lorenzo Flori

INTRODUZIONE ... 1

1

Caratteristiche strutturali di irisina e dei suoi recettori ... 2

2

Stimoli esogeni responsabili della produzione di irisina ... 7

2.1

Attività fisica ... 7

2.2

Basse temperature ... 11

2.3

Dieta ... 13

2.4

Altri stimoli ... 14

-

Effetto di agenti farmacologici sulla secrezione di irisina ……15

-

Effetto di agenti nutraceutici sulla secrezione di irisina ...……18

3

Pathway irisina ... 22

3.1

PGC1α ... 22

3.2

FNDC5 ... 22

3.3

PPARα ... 24

3.4

Identificazione delle vie di signaling nel processo di

.

browning mediato da irisina ... 24

-

Caratteristiche del tessuto adiposo ………..…25

-

UCP1 ..………...26

4

Irisina e obesità ... 30

5

Irisina e sistema cardiovascolare ... 31

5.1

Ruolo di irisina nell’infarto del miocardio ... 31

5.2

Ruolo di irisina nell’ipertrofia cardiaca ... 34

5.3

Ruolo di irisina nell’insufficienza e disfunzione cardiaca ... 35

5.4

Ruolo di irisina nelle patologie coronariche ... 36

5.5

Ruolo di irisina nella funzione endoteliale e nell’aterosclerosi ... 37

5.6

Ruolo di irisina nella pressione sanguigna ... 39

SCOPO DELLA RICERCA ... 47

MATERIALI E METODI ... 48

1

Procedura sperimentale in vivo ... 48

1.1

Caratteristiche del succo di Citrus reticulata ... 48

1.2

Procedura sperimentale: espianto degli organi ... 50

2

Determinazione dei livelli plasmatici di irisina ... 51

2.1

Analisi dei dati ... 51

2.2

Analisi statistica ... 51

3

Analisi del tessuto adiposo ... 52

3.1

Estrazione dell’RNA ... 52

3.2

Retro-Trascrizione e Real-Time PCR quantitativa (qPCR) ... 53

RISULTATI E DISCUSSIONE ... 58

INTRODUZIONE

Irisina, scoperta per la prima volta negli animali e poi nell'uomo, è uno dei peptidi più studiati negli ultimi anni. Questa molecola viene prodotta in seguito a determinati stimoli e principalmente può essere indotta dall’esercizio fisico (Bostrom et al, 2012) e dall’esposizione a basse temperature ambientali (Orava et al, 2014).

Irisina appartiene alla classe delle adipomiochine, poiché agisce sia sul tessuto adiposo (adipochina) che su quello muscolare (miochina). Il suo ruolo principale è quello di essere una proteina termogenica che favorisce il dispendio energetico, mediante l'imbrunimento (browning) del tessuto adiposo bianco (Rodriguez et al, 2017) dissipando l’energia sotto forma di calore (Villarroya, 2012). In base alla struttura e alla funzione delle cellule adipose, si possono distinguere due tipi di tessuto adiposo: il tessuto adiposo bianco/giallo (WAT) e il tessuto adiposo marrone (BAT). Quest’ultimo è specializzato nel dispendio energetico ("brucia calorie") ed è il luogo in cui avviene la termogenesi (Lidell & Enerback, 2010).

Molti studi hanno inoltre confermato il ruolo multifunzionale di questa molecola e gli effetti benefici sul mantenimento dell’omeostasi fisiologica generale. Irisina infatti riduce l'infiammazione sistemica, favorisce la normale omeostasi glicemica, mantiene l'equilibrio tra riassorbimento e formazione ossea, modula i processi metabolici e il funzionamento del sistema nervoso, sopprime l'espressione e il rilascio di citochine pro-infiammatorie negli individui obesi e attenua l'infiammazione nel tessuto adiposo. Irisina sembra avere anche un ruolo nella cancerogenesi e, in numerosi studi, è stato dimostrato il suo impatto sulla proliferazione, migrazione e invasione delle cellule tumorali (Korta et al, 2019).

Il nome “irisina” ha origine dall'antica dea greca Iris (Bostrom et al, 2012), figlia di Thaumas ed Electra che, nella mitologia greca, era la dea messaggera di buone notizie dagli dei agli umani (Grimal P. The Dictionary of Classical Mythology, 1996). Questo nome si è rivelato molto appropriato, in quanto si riferisce alla funzione fondamentale di irisina, cioè quella di messaggero chimico, trasmettendo gli effetti benefici dell'esercizio fisico al tessuto adiposo e ad altri organi coinvolti nel metabolismo (Arhire et al, 2019).

1. CARATTERISTICHE STRUTTURALI DI IRISINA E DEI SUOI

RECETTORI

Irisina è secreta principalmente dai miociti del muscolo scheletrico, specialmente nel perimisio, nell'endomisio e nelle parti nucleari, ma anche tessuto adiposo, pancreas, ghiandole sebacee, cervello e muscolo cardiaco sono stati identificati come tessuti secretori (Aydin, 2014).

Irisina è una proteina costituita da 112 aminoacidi ed ha un peso molecolare di 12 kDa. La sua sequenza amminoacidica è identica negli esseri umani, nei topi e nei ratti. Irisina è un frammento derivante dalla scissione proteolitica della proteina di membrana chiamata FNDC5. La produzione di FNDC5 viene modulata dal coattivatore trascrizionale PGC1α (PPARγ coactivator-1α), il quale viene stimolato principalmente in seguito all’esercizio fisico. L'aumentata espressione di PGC1α nel muscolo induce l’espressione di FNDC5, con conseguente aumento della liberazione di irisina (Bostrom et al, 2012).

Bostrom et al hanno dimostrato che irisina è un frammento scisso e secreto di FNDC5. Hanno considerato la possibilità che FNDC5 possa essere sintetizzato come una proteina di membrana di tipo I, seguita da scissione proteolitica e rilascio della parte N-terminale della proteina nello spazio extracellulare. Pertanto, qualsiasi tag C- o N- terminale andrebbe perso durante l'elaborazione della proteina matura o interferirebbe con la localizzazione. Attraverso il loro studio, i dati emersi suggeriscono fortemente che FNDC5 è scisso a livello della porzione C-terminale, secreto e possibilmente ulteriormente modificato. FNDC5, quindi, viene sintetizzata come una proteina di membrana di tipo I, su cui avviene una scissione proteolitica che porta al rilascio della parte N-terminale nello spazio extracellulare (Bostrom et al, 2012).

Pérez-Sotelo et al hanno dimostrato l'espressione e la secrezione di FNDC5/irisina da parte delle cellule del tessuto adiposo, rivelando un profilo di espressione e secrezione parallelo ad altri fattori adipogenici. Allo stesso modo, la mancanza di espressione di FNDC5 negli adipociti non differenziati suggerisce un ruolo di FNDC5/irisina sull'adipogenesi. È importante evidenziare la rilevazione di una banda e di uno spot di irisina da 12 kDa, con il punto isoelettrico e il peso molecolare previsti, sia in campioni adiposi murini che umani (Pérez-Sotelo et al, 2017).

Questi dati confermano i risultati di Jedrychowski et al, che mostrano l'identificazione mediante spettrometria di massa di un peptide da 12 kDa sequenziato come irisina, in campioni di plasma umano (Jedrychowski et al, 2015).

Bostrom et al attraverso metodiche western blots hanno dimostrato che FNDC5 può trovarsi anche in forma glicosilata, una caratteristica comune delle proteine secrete. Il trattamento dei surnatanti

ottenuti da cellule che esprimono FNDC5 con la peptide N-glicosidasi F (PNGase F) ha confermato questo, infatti si osserva una significativa riduzione delle dimensioni dall'elettroforesi su gel SDS, da 32 kD a 20 kD. Bostrom et al hanno utilizzato inoltre la spettrometria di massa (MS) per determinare la sequenza del polipeptide derivato da FNDC5. Le analisi MS indicano che FNDC5 secreto viene rotto a livello dell'acido glutammico 112 (esclusa la sequenza del segnale). La porzione secreta di FNDC5, cioè irisina, ha una notevole conservazione tra le specie, con una corrispondenza del 100% tra topi e esseri umani (Bostrom et al, 2012).

La struttura di irisina contiene un dominio N-terminale, omologo ai domini FNIII, e una coda C-terminale prevalentemente disordinata. Il dominio FNIII è uno dei più comuni ed è tipicamente utilizzato come elemento costitutivo per proteine modulari. I domini FNIII condividono tipicamente solo il 15-20% di identità di sequenza; tuttavia, nonostante questa omologia limitata, le loro strutture hanno pieghe sorprendentemente simili, composte da un β-sandwich con tre foglietti β su un lato e quattro sull'altro. Irisina contiene la tipica disposizione FNIII con un foglietto β a quattro fili che si impacchetta saldamente contro un foglietto β a tre fili (Schumacher et al, 2013).

Irisina forma un dimero β-foglio continuo a otto filamenti. Schumacher et al hanno mostrato, sia attraverso studi biochimici che di cristallografia a raggi X, che irisina si presenta sotto forma di omodimeri, dove si crea una struttura a foglio β tra le unità. Questa struttura è stabilizzata non solo dai legami idrogeno, ma anche dalle interazioni tra le catene laterali di subunità adiacenti, in particolare ponti salini tra Arg-75 e Glu-79’, che a loro volta proteggono le estremità dei dimeri, e interazioni di tipo “cerniera di triptofano” tra Trp-90 e Trp-90’. La presenza delle piccole catene laterali di Ala-88/Ala-88’ sono essenziali per permettere lo stretto accatastamento delle catene laterali Trp-90/Trp-90′ in irisina. Pertanto, la struttura di irisina FNIII mostra più attributi strutturali che favoriscono la dimerizzazione. I dati strutturali di Schumacher et al forniscono evidenze che irisina sia un dimero. In effetti, la struttura cristallina contiene otto subunità, che si combinano per formare lo stesso dimero. Irisina presenta due residui di asparagina come siti di glicosilazione. La struttura mostra che questi siti di glicosilazione sono esposti in superficie e si trovano in regioni che non possono influenzare la dimerizzazione. Inoltre gli esperimenti hanno dimostrato chiaramente che entrambe le forme della proteina sono dimeri (Schumacher et al, 2013).

La massa delle proteine FNDC5 varia da 20 a 32 kDa, a seconda del numero e della struttura degli oligosaccaridi (glicani) presenti sulla molecola proteica durante il processo post-traduzionale della N-glicosilazione (Bostrom et al, 2012. Roca-Rivada et al, 2013).

La glicosilazione è una delle modificazioni post-traduzionali più comuni delle proteine che si verifica nel lume del reticolo endoplasmatico e dell'apparato di Golgi. Più della metà delle proteine

si trovano nella forma glicosilata, tra cui principalmente quelle ancorate alla membrana cellulare e quelle secrete; a questo proposito entrano in gioco centinaia di enzimi, generando quindi una grande eterogeneità di glicoproteine. Gli oligosaccaridi influenzano le proprietà fisico-chimiche delle proteine, sono necessari per ottenere l'accurata conformazione delle proteine, forniscono protezione contro la proteolisi e sono importanti per le loro funzioni biologiche in diversi processi metabolici (Korta & Pocheć, 2019).

FNDC5 è una proteina N-glicosilata e contiene oligosaccaridi attaccati al residuo di asparagina nella sequenza Asn-X-Ser / Thr (dove X è qualsiasi amminoacido tranne la prolina), tramite un residuo di N-acetilglucosamina (GlcNAc) (Nie & Liu, 2017).

La secrezione di irisina è regolata proprio dagli oligosaccaridi legati a FNDC5. Inoltre le due molecole di N-glicano costituiscono una parte significativa di irisina, poiché andranno a regolare il browning degli adipociti, che è la funzione più importante di irisina (Korta et al, 2019).

Il processo di glicosilazione di FNDC5/irisina è ancora scarsamente caratterizzato. La sequenza di FNDC5 contiene tre potenziali siti di N-glicosilazione e due di essi, Asn-36 e Asn-81, sono occupati da N-glicani. Tuttavia, la loro struttura non è stata finora determinata. L'assenza di oligosaccaridi ha un effetto significativo sulla stabilità della molecola. È stato scoperto che FNDC5 de-N-glicosilata è più sensibile all'azione degli inibitori della sintesi proteica rispetto alla molecola glicosilata. La rimozione di un sito di N-glicosilazione, mediante mutagenesi sito-diretta, ha determinato una significativa riduzione della stabilità di FNDC5, con un'emivita di circa 7 ore rispetto alle 12 ore caratteristiche della proteina completamente glicosilata. FNDC5 de-N-glicosilata non raggiunge una normale conformazione spaziale e non è incorporata nella membrana cellulare. Ciò si traduce in una significativa diminuzione della secrezione di irisina nel sangue (Nie & Liu, 2017. Tan et al, 2014). Anche irisina ha due siti di N-glicosilazione situati nelle posizioni di asparagina 7 (Asn-7) e asparagina 52 (Asn-52). La deglicosilazione di irisina riduce il suo peso molecolare a 12 kDa o 15 kDa. L'aggiunta di una o due catene di zucchero aumenta la sua massa rispettivamente a 22 kDa o 25 kDa. Zhang at al hanno osservato che i due pesi molecolari più elevati (22 e 25 kDa) di irisina secreta rispetto alla forma nativa sono relativi alla forma glicosilata. Il trattamento della r-irisina purificata con la peptide N-glicosidasi F (PNGase F) per rimuovere i glicani N-legati e la successiva analisi Western blotting, ha rivelato che la r-irisina trattata con enzimi mostra una singola banda a basso peso molecolare (15 kDa), confermando che la maggior parte della r-irisina secreta è glicosilata (Zhang et al, 2014).

Per confermare i siti glicosilati, Zhang et al hanno mutato ciascuno dei due siti di glicosilazione (Asn-7 e Asn-52), individualmente. La proteina mutante di r-irisina, ha mostrato solo due bande con peso molecolare 22 e 15 kDa. La proteina di 22 kDa probabilmente rappresenta irisina mutante che è stata

glicosilata su uno dei due siti glicosilati (N7H o N52H), poiché questa banda era ancora sensibile al trattamento con PNGase F. Questi esperimenti confermano che irisina umana ha effettivamente due siti glicosilati in Asn-7 e Asn-52. Zhang et al hanno dimostrato inoltre che entrambi gli N-glicani sono importanti per la funzione primaria di irisina, cioè il browning degli adipociti (Zhang et al, 2014).

Per caratterizzare FNDC5/irisina nel tessuto adiposo, Pérez-Sotelo et al hanno eseguito una prima analisi sulle cellule staminali mesenchimali murine C3H10T1/2 studiando l'espressione di FNDC5 da uno stato non differenziato durante l'adipogenesi. L'espressione del gene e della proteina FNDC5 è stata rilevata solo in cellule differenziate con espressione crescente dal giorno 2 al giorno 10, parallelamente all'espressione di PPARγ, GLUT4, UCP1, adiponectina e PGC1α. Inoltre, il rilevamento della proteina FNDC5 mediante immunoistochimica è stato osservato esclusivamente in cellule C3H10T1/2 differenziate. L'analisi immunoblotting delle frazioni intracellulari e secrete di C3H10T1/2, utilizzando un anticorpo monoclonale contro FNDC5 (aa 50-150), ha mostrato diverse bande corrispondenti a diversi pesi molecolari. È interessante notare che una banda compatibile con la porzione secreta descritta di FNDC5, nota come irisina, è stata rilevata a 12 KDa nei secretomi di cellule differenziate. La presenza di questa forma segue il profilo di espressione genica, essendo assente nei secretomi pre-adipocitari e crescendo dal giorno 2 di differenziazione. È stata rilevata anche una debole banda a 25 kDa nel mezzo di coltura cellulare delle cellule differenziate. A livello intracellulare, le bande a 25, 20 e 12 kDa sono state assunte come specifiche isoforme glicosilate di irisina, dimeri di irisina e/o proteina FNDC5 completa. L'immunoprecipitazione FNDC5 nei secretomi delle cellule C3H10T1/2 seguita da western blot bidimensionale (2-DE) ha confermato gli immunoblot precedenti, rilevando un punto esclusivo negli adipociti differenziati con il peso molecolare e il punto isoelettrico previsti per irisina non glicosilata secreta da 12 kDa. Il western blot 2-DE ha mostrato punti specifici a 12 kDa che scompaiono utilizzando l'anticorpo bloccato anche nei lisati cellulari (Pérez-Sotelo et al, 2017). Pérez-Sotelo et al hanno osservato che tessuti adiposi viscerali e sottocutanei umani esprimono e secernono FNDC5/irisina soprattutto in condizioni di squilibrio metabolico come l’obesità. Per valutare l'espressione e la secrezione della proteina FNDC5/irisina sono stati analizzati tessuti adiposi umani viscerali (VAT) e sottocutanei (SAT) da individui sani e obesi. Sebbene gli studi sul contenuto di proteine tissutali mediante immunoistochimica abbiano mostrato una colorazione positiva sia nei depositi VAT che SAT, non c'erano differenze apparenti tra tessuti adiposi sani e obesi. Inoltre, la quantificazione di irisina nel VAT e nel SAT umano a livello intracellulare mediante ELISA non ha confermato differenze statistiche. È interessante notare che una chiara e significativa

sovra-secrezione è stata osservata nei secretomi di VAT e SAT di soggetti obesi rispetto a quelli di individui magri. Con la quantificazione diretta di irisina su secretomi da espianti di tessuto adiposo umano confermano che VAT e SAT obesi secernono più irisina rispetto ai tessuti adiposi sani. L'analisi immunoblot dei lisati e dei secretomi del tessuto adiposo mostra tre bande predominanti a 25, 15 e 12 kDa; la banda 12 kDa è la più abbondante nei secretomi. Tutte e tre le isoforme sono state trovate elevate nei secretomi di VAT e SAT obesi umani senza differenze significative tra i depositi di tessuto. In secondo luogo, Pérez-Sotelo et al hanno mostrato come fattori autocrini secreti da depositi di VAT e SAT obesi umani riducono l'espressione genica di PGC1α, FNDC5 e UCP1 su adipociti differenziati murini; questo effetto negativo sull'espressione di UCP1 è attenuato bloccando irisina nei secretomi di VAT e SAT obesi. Infine, questi autori sono stati tra i primi ad ottenere il silenziamento stabile del gene FNDC5 su pre-adipociti coltivati. Questo approccio, oltre a consentire l'identificazione dell'autentico segnale della proteina FNDC5/irisina, rivela un ruolo importante per FNDC5 nell'adipogenesi. Quindi, le cellule prive di espressione di FNDC5 mostrano una ridotta espressione di UCP1 e una maggiore adipogenesi, confermata da un accumulo di lipidi significativamente più elevato durante la differenziazione (Pérez-Sotelo et al, 2017).

Fino ad oggi, non è stato identificato alcun recettore specifico per irisina. Zhang et al hanno utilizzato metodi di legame delle cellule vive per osservare la proprietà di legame di irisina alla membrana cellulare e i dati ottenuti dal loro lavoro suggeriscono che gli adipociti possono avere sulla membrana cellulare un recettore per irisina ancora da identificare (Zhang et al, 2014). Inoltre, risultati di studi recenti hanno dimostrato che nella maggior parte dei tessuti irisina esercita la sua azione legandosi alle integrine, soprattutto ai membri della famiglia delle integrine αv (Kim et al, 2018). Le integrine sono recettori transmembrana ampiamente espressi che legano i ligandi della matrice extracellulare (interazioni cellula-matrice), le proteine di membrana delle cellule vicine (interazioni intercellulari) e riconoscono i ligandi solubili (Takada et al, 2007). Inoltre sono responsabili dell'adesione, migrazione e aggregazione delle cellule (Czyz, 2000). Kim et al hanno dimostrato il legame di irisina a diverse integrine presenti nelle cellule adipose e negli osteociti, tra cui α1β1 e, con la massima affinità, all'integrina αVβ5 (Kim et al, 2018).

2. STIMOLI ESOGENI RESPONSABILI DELLA PRODUZIONE DI

IRISINA

2.1 ATTIVITÀ FISICA

Durante o immediatamente dopo l'esercizio fisico i miociti secernono molecole chiamate miochine, principalmente chemochine e citochine. Le miochine regolano una varietà di processi metabolici in vari tessuti e organi, come fegato, ossa, cervello o tessuto adiposo, attraverso vie di segnalazione endocrine, paracrine o autocrine (Johnson et al 2014. Di Raimondo et al, 2017). Questo potrebbe essere il possibile legame tra l'esercizio e la protezione contro le malattie croniche, e la possibile relazione di queste malattie con l'inattività fisica (Pardo et al, 2014). È ben noto infatti che gli stili di vita fisicamente attivi proteggono contro il diabete mellito di tipo 2 (T2DM), le malattie cardiovascolari, il cancro, la demenza e la depressione (Moreno et al, 2015).

Nel 2012 Bostrom et al hanno scoperto che tra queste miochine si trova anche irisina. L'attività fisica nel muscolo scheletrico induce PGC1α e stimola la produzione ed il clivaggio della proteina FNDC5. PGC1α media la programmazione del metabolismo energetico nei sistemi biologici trascrizionali, controlla la biogenesi mitocondriale, l'angiogenesi, la commutazione del tipo di fibra e il metabolismo ossidativo in molti tipi di cellule; FNDC5, invece, è una proteina di membrana di tipo I glicosilata che è abbondantemente espressa nei muscoli scheletrici e che, in seguito a scissione proteolitica, rilascia in circolazione irisina (Bostrom et al, 2012). Di conseguenza il livello di irisina circolante è maggiore negli individui impegnati in attività fisica e progressivamente ridotto in quelli meno attivi e sedentari. Dati gli effetti benefici complessivi dell'esercizio su malattie cardiovascolari, obesità, diabete, funzione scheletrica, è ragionevole dunque ritenere che irisina possa svolgere un ruolo essenziale in diverse funzioni associate a queste malattie, nonché in altre funzioni ancora da scoprire (Roca-Rivada et al, 2013).

Bostrom et al hanno dimostrato che il livello di irisina aumenta nel sangue dopo l’attività fisica, infatti è stato osservato un aumento del 65% della concentrazione di irisina nei topi che corrono regolarmente per 3 settimane ed un aumento di due volte nel sangue di persone sane dopo 10 settimane di allenamento (Bostrom et al, 2012).

Uno dei primi studi sugli esseri umani è stato pubblicato da Steward et al nel 2012: essi hanno correlato le espressioni dei geni FNDC5 e PGC1α con le prestazioni aerobiche in 24 uomini adulti con insufficienza cardiaca e intolleranza all'esercizio, attribuiti ai sintomi e disturbi muscolo-scheletrici caratteristici della malattia. È stata segnalata una correlazione positiva e statisticamente significativa tra i geni PGC1α e FNDC5 e la capacità aerobica, in accordo con l'articolo pubblicato da

Bostrom et al (Lecker et al, 2012).

Moreno et al hanno potuto constatare che la concentrazione di irisina nel siero è risultata più alta nei soggetti attivi piuttosto che in quelli sedentari; il suo livello è dipeso anche dalle attività svolte nel luogo residenziale, infatti i suoi livelli sono risultati significativamente più alti negli individui provenienti da zone rurali rispetto agli abitanti urbani (Moreno et al, 2015. Jedrychowski et al, 2015). Sono state effettuate indagini che collegano irisina a diverse tipologie di esercizio fisico. Pekkala et al hanno valutato se l’mRNA di FNDC5 muscolare e irisina sierica rispondessero all'esercizio e se l’espressione di PGC1α fosse associata all’espressione di FNDC5. I soggetti maschi hanno eseguito esercizi singoli; nel muscolo scheletrico non sono stati osservati cambiamenti significativi di PGC1α, FNDC5 e irisina sierica dopo esercizi aerobici, esercizi di resistenza e esercizi combinati, tuttavia un singolo esercizio di resistenza ad alta intensità ha aumentato la PGC1α di 4 volte nei giovani e di 2 volte negli uomini più anziani, mentre l’mRNA di FNDC5 è aumentato solo nei giovani. I cambiamenti di PGC1α o di irisina sierica non sono dunque costantemente accompagnati da cambiamenti di FNDC5. In conclusione, né l'esercizio a lungo termine né a breve termine aumentano notevolmente l’espressione di FNDC5 nel muscolo scheletrico o irisina sierica, di conseguenza i loro cambiamenti in risposta all’esercizio fisico sono probabilmente casuali ma non è da escludere il collegamento tra esercizio fisico e espressione di FNDC5 e rilascio di irisina (Pekkala et al, 2013). Infatti, l'impatto dell'esercizio sulla concentrazione di irisina nel sangue non è molto chiaro. La sovraregolazione di irisina è stata notata in seguito ad esercizi ad alta intensità (Tsuchiya et al, 2014) ma non dopo esercizi di resistenza (Tsuchiya et al, 2015), dunque si sospetta che il tipo di attività fisica abbia un ruolo importante. A questo riguardo Huh et al hanno osservato un aumento di circa il 18% dei livelli plasmatici di irisina dopo 1 settimana di esercizio e nessun effetto dopo un allenamento prolungato per 8 settimane (Huh et al, 2012).

Alcuni dati non hanno confermato l'attivazione del gene FNDC5 mediante l'esercizio come quelli emersi dagli studi di Timmons et al e di Kurdiova et al (Timmons et al, 2012. Kurdiova et al, 2014); in altri invece l'esercizio regolare viene inversamente correlato ai livelli di irisina negli uomini adulti, come nello studio di Park et al (Park et al, 2013).

Nello studio presentato da Kurdiova et al, lo svolgimento di esercizi per 3 mesi ha portato a variazioni del peso corporeo, della massa corporea magra e della massa grassa. Essi hanno dimostrato che né l'allenamento di 3 mesi né l'esercizio acuto, sia in individui sedentari che in individui allenati, hanno influenzato l'espressione di FNDC5 nel muscolo scheletrico o i livelli di irisina circolante. È stato notato che lo svolgimento di un esercizio fisico acuto ha indotto l'espressione di PGC1α sia in individui sedentari che allenati e che l'mRNA di FNDC5 nel muscolo scheletrico è correlato positivamente con l'mRNA di PGC1α nel muscolo di individui sedentari e

allenati. Hanno osservato, inoltre, che irisina circolante era positivamente associata al volume del muscolo tibiale anteriore, alla forza di contrazione volontaria massima e alla velocità di sviluppo della forza, ma non alla capacità aerobica massima. L'associazione positiva con la forza muscolare è stata mantenuta dopo l'aggiustamento per età e per indice di massa corporea. Ancora più importante, irisina circolante è stata negativamente associata alla glicemia a digiuno (Kurdiova et al, 2014). Tali discrepanze possono essere giustificate considerando che i livelli di irisina aumentano solo quando è richiesta più energia e questo stato lo si può osservare nello stile di vita sedentario, dove la concentrazione muscolare di ATP è fortemente diminuita (Huh et al, 2012).

Kim et al nel 2015 hanno dimostrato che l'allenamento con esercizi di resistenza aumenta l'espressione di irisina in concomitanza con il miglioramento della funzione muscolare sia nei topi che nell'uomo. Essi hanno studiato l'effetto che può avere l'allenamento di resistenza sull'espressione di irisina con miglioramento della forza e della funzione muscolare. In uno studio preclinico, topi maschi di 19 mesi di età sono stati suddivisi in modo casuale in due gruppi, uno di controllo e uno di esercizio di resistenza, ed è stato riscontrato un aumento dai livelli di irisina nel siero e nel muscolo soleo nonché un miglioramento della forza muscolare e della qualità muscolare senza variazione della composizione corporea negli animali. Relativamente allo studio clinico, i partecipanti (di età superiore ai 65 anni) sono stati suddivisi in modo casuale in gruppo di esercizio e gruppo di controllo. La forza isocinetica delle gambe è stata migliorata nel gruppo di esercizio rispetto al gruppo di controllo, senza modifiche della composizione corporea, ed è stato aumentato il livello di irisina circolante. Una correlazione positiva con la forza della presa e la forza delle gambe è stata osservata nel gruppo sottoposto a esercizio fisico, pertanto l'allenamento di resistenza potrebbe essere un metodo di intervento efficiente per aumentare i livelli di irisina e prevenire il declino correlato all'età della funzione muscolare (Kim et al, 2015).

Altri studi mostrano associazioni divergenti tra sesso maschile e sesso femminile. Kerstholt et al hanno misurato la condizione fisica mediante prova da sforzo cardiopolmonare con cicloergometro. Lo studio ha incluso un campione di 740 persone, di età compresa tra 20 e 79 anni, comprendente donne e uomini adulti tedeschi: negli uomini è stata trovata un’associazione inversa tra la concentrazione di irisina e il picco di assorbimento di ossigeno, al contrario nelle donne l'associazione è stata diretta. Questi risultati sono probabilmente dovuti a differenze di genere sessuale, ma ulteriori approfondimenti sono necessari (Kerstholt et al, 2015).

Anche Scalzo et al hanno condotto uno studio per misurare i cambiamenti di irisina e dell'espressione del gene FNDC5, dopo nove sessioni di allenamento a intervalli ad alta intensità per un periodo di tre settimane. Questi autori hanno evidenziato delle associazioni opposte tra donne e uomini: l'allenamento ha prodotto un aumento della concentrazione plasmatica di irisina

nelle donne e una diminuzione negli uomini (Scalzo et al, 2014).

Norheim et al hanno mostrato l'assenza di effetti a lungo termine sul cambiamento del tessuto adiposo valutata attraverso l'espressione di UCP1. Nonostante ciò, hanno comunque riscontrato correlazioni positive tra l’mRNA di FNDC5 e PGC1α, accompagnate dalla diminuzione di irisina circolante dopo il completamento di esercizi di resistenza e di esercizi acuti per 12 settimane. Tuttavia, in questo stesso studio, è stato riportato un aumento della concentrazione di irisina dopo un intenso esercizio fisico con una diminuzione dopo 2 ore, senza aumento dell'mRNA di FNDC5 (Norheim et al, 2014).

L'aumento di irisina in risposta a un intenso esercizio fisico è stato documentato anche da Huh et al, che hanno riportato una diminuzione 30 minuti dopo la fine dell'esercizio, senza trovare effetti dopo un programma di allenamento di 8 settimane, attribuendo il possibile transitorio effetto di irisina al ripristino dell'omeostasi di ATP che, una volta raggiunto, diminuisce a concentrazioni basali (Huh et al, 2012).

Boss et al hanno condotto uno studio per valutare l'influenza dell'allenamento fisico regolare sull'espressione di UCP1 nel BAT. Ratti maschi sono stati posti 5 giorni a settimana su tapis roulant e, alla fine delle 4 settimane di allenamento, non è stato osservato alcun cambiamento nell'espressione di UCP1 tra i ratti sedentari e quelli sottoposti ad esercizio fisico, suggerendo che l'allenamento in esecuzione non ha avuto effetti stimolatori sull'attività termogenica nel BAT (Boss et al, 1998). Allo stesso modo Tsuboyama-Kasaoka et al hanno studiato l'espressione dell'mRNA di UCP1 nel BAT in topi maschi e femmine sottoposti a regolare allenamento di nuoto: i risultati hanno mostrato che l'allenamento regolare di nuoto ha aumentato la massa di BAT, ma non ha influenzato i livelli di mRNA di UCP1 in BAT (Tsuboyama-Kasaoka et al, 1998).

Oh et al hanno adottato un protocollo di allenamento per il nuoto simile a quello di Tsuboyama-Kasaoka et al, in particolare hanno esaminato gli effetti di un allenamento di 6 settimane sull'espressione di UCP1 in topi obesi con deficit del recettore della leptina omozigote e in topi magri. L'analisi morfometrica dei topi allenati ha rivelato riduzioni significative della massa corporea in entrambi i sessi, sia dei topi obesi che magri. Inoltre, l'addestramento al nuoto ha indotto un aumento significativo del 15,2% nell'espressione dell'mRNA di UCP1 nel BAT delle femmine obese; mentre nel gruppo magro, l'espressione dell'mRNA di UCP1 è aumentato del 40% solo nei maschi. Inoltre, l'analisi Western Blot ha rivelato un aumento del 51,4% nell'espressione della proteina UCP1 nei topi maschi obesi sottoposti ad esercizio. Si è concluso che gli aumenti osservati nell'espressione di UCP1 indotti da un regolare allenamento di nuoto possono promuovere il dispendio energetico e, quindi, impedire ai topi di entrambi i sessi di diventare obesi(Oh et al, 2007). Slocum et al hanno esaminato gli effetti di un protocollo di corsa su tapis roulant per 7 giorni (60

min/giorno a 10 m/min) sull'espressione di UCP1 in topi obesi, osservando che l'esercizio fisico ha aumentato il tasso metabolico totale e ha raddoppiato l'espressione dell’mRNA di UCP1 nel BAT, in accordo con il suo potenziale ruolo nella regolazione del peso corporeo (Slocum et al, 2013). Contrariamente, De Mateis et al hanno esaminato gli effetti di un allenamento regolare di 1 e di 6 settimane in ratti maschi (i ratti hanno corso su un tapis roulant a 18 m/min per 5 giorni a settimana) ed hanno osservato che né il protocollo di allenamento regolare di 1 settimana né quello di 6 settimane hanno influenzato l'espressione di UCP1 in BAT (De Matteis et al, 2013).

Timmons et al non ha osservato alcun effetto sul livello di mRNA di FNDC5 né dopo 6 settimane di intenso ciclismo di resistenza, né dopo un allenamento di resistenza nei soggetti più giovani. Gli stessi hanno dimostrato che l'induzione di FNDC5 nel muscolo si verificava 1,3 volte maggiore solo in soggetti anziani altamente attivi rispetto ai controlli sedentari (Timmons et al, 2012).

La produzione di irisina in seguito ad esercizio fisico non è quindi molto chiara, in quanto viene confermata da alcuni studi e negata da altri; comunque l’esercizio fisico è sicuramente un fattore che in alcuni casi può influire sulla concentrazione di tale miochina.

2.2 BASSE TEMPERATURE

La temperatura ambientale è uno dei fattori che può influire sugli effetti dell'esercizio fisico e sul metabolismo umano. L'esposizione al freddo aumenta il dispendio energetico e migliora il tasso metabolico, quindi questo suggerisce che gli ambienti freddi inducano effetti di stress simili all'esercizio fisico (Lee et al, 2014. Coker et al, 2017). Le persone che si adattano agli ambienti freddi sono presumibilmente più resistenti ai disturbi metabolici, probabilmente a causa del mantenimento di quantità maggiori di BAT (Dayaratne, 2010).

Più recentemente, sono stati dimostrati gli effetti stimolatori di un regolare allenamento di corsa sulle risposte metaboliche adattative del BAT alle basse temperature. Ratti sia maschi che femmine sono stati divisi in due gruppi, sedentari e allenati, ed ogni gruppo è stato ulteriormente suddiviso in due sottogruppi, i quali erano alloggiati uno a 22 °C e uno a 12 °C. L'analisi dell'espressione dell'mRNA di UCP1 nel BAT ha mostrato un miglioramento del metabolismo in presenza di entrambi gli stimoli, ma non in risposta ai singoli stimoli. Gli autori hanno quindi concluso che esercizio ed esposizione a basse temperature possono, insieme, indurre la termogenesi mediata da UCP1 nel BAT (Seebacher & Glanville, 2010).

Ozbay et al nel 2020 hanno condotto uno studio prendendo in esame 32 individui maschi sani. Questo studio ha esaminato gli effetti acuti e cronici dell'allenamento aerobico a lungo termine eseguito a diverse temperature ambientali sui livelli sierici di irisina. Gli individui erano suddivisi

in due gruppi: il gruppo “outdoor”, che eseguiva l'allenamento all'aperto ad una temperatura tra -5 e 5 °C, e il gruppo “indoor”, che eseguiva l'allenamento al chiuso a 21 – 25 °C. È stato osservato che nel gruppo “indoor” la concentrazione sierica di irisina è aumentata molto dopo il primo allenamento per poi diminuire in modo significativo durante il successivo periodo di esercizi. Nel gruppo “outdoor” invece, la concentrazione di irisina è aumentata in modo significativo dopo il primo allenamento ed è rimasta stabile durante tutto il periodo. Questo studio fornisce la prova che l'esercizio aerobico induce un aumento acuto delle concentrazioni di irisina, specialmente a basse temperature. (Ozbay et al, 2020).

In effetti, l'effetto stimolante dell'esposizione al freddo sull'attività del BAT (termogenesi indotta dal freddo o senza brividi) è stato ben documentato in studi su animali e sull'uomo. In una revisione completa condotta da Flouris et al, è stato sottolineato che l'esercizio fisico regolare non era un fattore determinante per aumentare l'espressione di UCP1, ma questo effetto potrebbe aumentare se il freddo e l'esercizio fossero combinati (Flouris et al, 2017).

Allo stesso modo Seebacher e Glanville hanno osservato che l'aumento dei livelli di mRNA di UCP1 in risposta all'allenamento combinato con l'esposizione al freddo rafforza l'importanza della bassa temperatura come stimolo positivo nell'espressione di UCP1 nel BAT, in particolare se combinato con l'esercizio, promuovendo un profilo di salute metabolica più favorevole (Seebacher & Glanville, 2010).

Coker et al hanno misurato le concentrazioni sieriche di irisina di otto adulti sani durante l'evento Yukon Arctic Ultra (430 miglia; la temperatura durante l'evento variava da -45 a -8 °C), che è il più lungo e il più freddo evento di resistenza nel mondo, osservando che l’esposizione a queste condizioni promuove un aumento significativo del livello di irisina sierica (Coker et al, 2017), supportando i risultati di molti studi che hanno dimostrato che le concentrazioni di irisina sono aumentate dopo l'esercizio aerobico, oltre a suggerire che questo effetto potrebbe essere aumentato quando l'esercizio aerobico è combinato con il freddo (Ozbay et al 2020).

Figura 1. I principali stimoli esogeni responsabili della produzione di irisina.

2.3 DIETA

Oltre ad attività fisica ed esposizione a basse temperature anche la dieta può influenzare il rilascio di irisina. De Queiroz et al hanno riportato effetti negativi di un regolare esercizio fisico combinato con una dieta ricca di zuccheri sull'espressione di UCP1 e sull'omeostasi energetica. In particolare, i ratti Wistar maschi sono stati suddivisi in quattro gruppi ("sedentario con dieta standard", "allenato con dieta standard", "sedentario con dieta ricca di zuccheri" ed "allenato con dieta ricca di zuccheri"). Un aumento di 12 e 5 volte nell'espressione dell'mRNA di UCP1 è stato rilevato rispettivamente nei gruppi "sedentario con dieta ricca di zuccheri" ed "allenato con dieta standard", rispetto al gruppo "sedentario con dieta standard". Allo stesso modo, l'esercizio e la dieta ad alto contenuto di zucchero da soli hanno aumentato i livelli di UCP1, mentre una combinazione di questi interventi ha ridotto i livelli di UCP1, concludendo che un regolare esercizio fisico e una dieta ricca di zuccheri possono esercitare effetti contrapposti sull'espressione di UCP1 (De Queiroz et al, 2012).

Varela-Rodríguez et al hanno studiato le alterazioni nell'espressione genica di FNDC5 e i livelli di irisina circolante in ratti allevati con diete diverse osservando che, sia gli animali soggetti a restrizione calorica (CR) che quelli alimentati con una dieta ad alto contenuto di grassi (HF), mostravano livelli di irisina sierica ridotti, se confrontati con gli animali alimentati con dieta standard, ma le differenze non erano statisticamente significative. Inoltre, non sono stati osservati cambiamenti nell'espressione dell'mRNA di FNDC5 ipotalamico (FNDC5 è stato valutato anche nell’ipotalamo per osservare se le sue espressioni, centrale e periferica, risultavano diverse). I profili

di espressione di FNDC5 nel muscolo e nel WAT sottocutaneo inguinale si sono rivelati simili ai livelli circolanti di irisina, con valori più bassi in entrambi i tessuti in caso di CR e solo nel WAT sottocutaneo in caso di dieta HF. I livelli di espressione genica di FNDC5 e UCP1 nel BAT sono aumentati in proporzione alla percentuale di massa grassa e l'espressione genica di FNDC5 è stata migliorata con CR nel WAT viscerale ed epididimale (Varela-Rodríguez et al, 2016).

Varela-Rodríguez et al hanno condotto anche esperimenti per valutare le alterazioni nell'espressione genica di FNDC5 e i livelli di irisina circolante in ratti a digiuno. Con questo esperimento hanno osservato che un digiuno di 48 ore ha portato ad una diminuzione dei livelli sierici di irisina e ha ridotto i livelli di mRNA di FNDC5 nel muscolo, nel BAT e nel WAT viscerale ed epididimale, ma non nel WAT sottocutaneo. I livelli di espressione di UCP1 in BAT sono diminuiti significativamente con il digiuno, proprio come i valori di FNDC5. Nell'ipotalamo, invece, l'effetto del digiuno è stato contrario sebbene la differenza non fosse statisticamente significativa. Questi risultati suggeriscono che il digiuno ha effetti diversi sull'espressione genica di FNDC5 centrale e periferica (Varela-Rodríguez et al, 2016).

Abulmeaty et al hanno condotto un esperimento in cui dimostrano che la carenza di vitamina D può influenzare il peso e il dispendio energetico totale (TEE) tramite irisina. Hanno utilizzato sedici ratti albini maschi svezzati e li hanno suddivisi casualmente in due gruppi: uno alimentato con una normale dieta di crescita equilibrata (gruppo A) ed uno alimentato con una dieta normocalcemica carente di vitamina D con esposizione alla luce ultravioletta (UV) limitata (gruppo B). È stato dimostrato che i primi cambiamenti nell'omeostasi energetica e nei livelli di irisina durante gli stati di ipovitaminosi D sono influenzati dal consumo a lungo termine di una dieta carente di vitamina D con limitata esposizione ai raggi UV. Essi hanno confrontato la concentrazione di irisina nei ratti del gruppo A (vitamina D sufficiente) e del gruppo B (vitamina D carente) ed è stato osservato che i livelli di irisina sono stati significativamente più alti nel gruppo A rispetto al gruppo B (Abulmeaty et al, 2020).

2.4 ALTRI STIMOLI

Oltre ad esercizio fisico, esposizione a basse temperature e alimentazione, possono essere presenti anche altri fattori capaci di provocare una variazione nella concentrazione di irisina, come ad esempio agenti farmacologici o nutraceutici.

 Effetti di agenti farmacologici sulla secrezione di irisina

EFFETTO DI INSULINA E FARMACI IPOGLICEMIZZANTI

Metformina è una biguanide ed è il farmaco di prima scelta per il trattamento del diabete di tipo 2, in particolare nelle persone in sovrappeso e obese (Scheen & Paquot, 2013).

Metformina sembra essere coinvolta nella modulazione dell'irisina, probabilmente attraverso la via di segnalazione AMPK / Sirt1 / PGC1α (Li et al, 2019 A).

Metformina aumenta l'espressione intramuscolare di FNDC5 e promuove il rilascio di irisina dal muscolo scheletrico nel sangue in modello murino. Li et al hanno dimostrato che la somministrazione di metformina in topi db/db obesi e diabetici ha promosso l'espressione genica di FNDC5 e i livelli sierici di irisina. Inoltre, questo studio ha valutato il coinvolgimento di AMPK nella via metabolica dell'irisina utilizzando un bloccante selettivo. I risultati hanno mostrato una ridotta espressione dell'mRNA di FNDC5 nel muscolo scheletrico e concentrazioni sieriche inferiori di irisina nei topi db/db rispetto ai topi wild type. La metformina ha quindi promosso l'espressione genica di FNDC5 e la produzione di irisina; inoltre, la riduzione della glicemia e del peso corporeo nei topi db/db trattati con metformina è stata positivamente associata alle concentrazioni di irisina nel sangue. Anche il trattamento di miotubi C2C12 con metformina ha aumentato l’espressione di FNDC5 e il rilascio di irisina. La metformina ha attivato la via AMPK nelle cellule muscolari scheletriche, ma l'inibizione della via di segnalazione AMPK non ha abolito l'effetto della metformina sul rilascio di irisina (Li et al, 2015).

Yang et al hanno ipotizzato che PGC1α possa essere un regolatore nel processo di rilascio di irisina stimolato dalla metformina ed hanno perciò eseguito esperimenti in vivo e in vitro per indagare l'ipotesi. È stata somministrata metformina a topi wild-type (WT) e a topi obesi (ob/ob) per 4 settimane: nei topi obesi, ma non nei WT, la metformina ha ridotto significativamente il peso corporeo e la glicemia, aumentando notevolmente i livelli di irisina plasmatica. Essi inoltre sostengono che metformina aumenta l'espressione muscolare di PGC1α e FNDC5 nei topi; il livello dell’mRNA di PGC1α e della proteina nei topi WT trattati con metformina infatti era 4,3 volte maggiore e nei topi ob/ob 3,0 volte maggiore rispetto ai livelli di controllo. Questo studio conferma che metformina stimola la secrezione di irisina dal muscolo scheletrico nella circolazione sistemica dei topi obesi e che PGC1α è un regolatore critico in questo effetto (Yang et al, 2015).

Anche Varela-Rodríguez et al hanno condotto esperimenti con metformina, osservando gli effetti di quest’ultima e dell'insulina sull'espressione del gene FNDC5 e sui livelli di irisina circolante. Come previsto, le iniezioni di insulina e metformina hanno diminuito i livelli di glucosio ed hanno inoltre contenuto l’incremento del peso corporeo. Con metformina, l'indice somatico dell'epididimo è

diminuito rispetto ai controlli e ai ratti trattati con insulina. I livelli di espressione dell'mRNA di FNDC5 ipotalamico sono inoltre aumentati con entrambi i trattamenti (Varela-Rodríguez et al, 2016). Studi condotti nel 2019 hanno esaminato i livelli di irisina circolanti e gli effetti della metformina su questo parametro metabolico nelle donne con sindrome dell'ovaio policistico (di età compresa tra 18 e 40 anni). I risultati hanno mostrato che la metformina riduce i livelli di irisina circolante e che tali livelli sono direttamente associati al grado di insulino-resistenza. Inoltre, i risultati ottenuti da Masaeli et al hanno mostrato che i livelli di irisina circolante erano strettamente correlati con i livelli di 17-idrossiprogesterone, testosterone e insulina (Masaeli et al, 2019). Ulteriori indagini sono state condotte da Oliveira et al nel 2020 ma le valutazioni dell'attività del BAT e dei livelli plasmatici di irisina non hanno mostrato cambiamenti significativi tra il gruppo trattato con metformina e il placebo (Oliveira et al, 2020).

Liu et al hanno valutato l'interazione di sitagliptin con irisina e la sua via metabolica. Sitagliptin è un farmaco antidiabetico ipoglicemico orale appartenente alla classe degli inibitori della dipeptidil-peptidasi 4. Ratti nutriti con dieta HF e trattati con streptozotocina, al fine di riprodurre una condizione di T2DM, sono stati trattati con due diversi dosaggi di sitagliptin (5 mg/kg e 10 mg/kg) una volta al giorno per 8 settimane. I risultati hanno mostrato che le espressioni di PGC1α, AMPK e irisina erano significativamente aumentate in entrambi i trattamenti con sitagliptin e che erano significativamente più elevate nel gruppo di trattamento ad alto dosaggio. Allo stesso modo, l'mRNA di PGC1α e FNDC5 erano significativamente più alti in entrambi i gruppi di trattamento e in particolare nel gruppo trattato con 10 mg/kg di sitagliptin (Liu et al, 2020).

EFFETTO DELLA LEPTINA

È stato constatato che il trattamento con la leptina è associato ad un aumento dei livelli di espressione ipotalamica di FNDC5, ma anche ad una diminuzione dei livelli sierici di irisina e ad una diminuzione dell’espressione del gene di FNDC5 nel muscolo, nel BAT e nel WAT viscerale, sottocutaneo e nell'epididimo. Questi risultati, ottenuti dallo studio di Varela-Rodríguez et al, suggeriscono che la leptina ha effetti diversi sull’espressione del gene FNDC5 a livello centrale e periferico. Non sono state invece osservate modifiche nei livelli di espressione dell'mRNA di UCP1 nel BAT dopo il trattamento con leptina (Varela-Rodríguez et al, 2016).

Per corroborare i risultati precedenti gli stessi autori hanno ripetuto l’esperimento su ratti nutriti e ratti a digiuno: nel complesso c'è stato un effetto significativo del trattamento con leptina sui livelli plasmatici di irisina su ratti a digiuno (Varela-Rodríguez et al, 2016).

In accordo con i risultati precedenti, i livelli di espressione dell'mRNA di FNDC5 sono diminuiti nel tessuto muscolare degli animali trattati con leptina, effetto che però scompare con il digiuno.

Risultati simili sono stati ottenuti per l'ipotalamo, dove però i livelli di espressione di FNDC5 aumentano; questo effetto non è stato tuttavia osservato negli animali a digiuno (Varela-Rodríguez et al, 2016).

EFFETTO DI FARMACI IPOCOLESTEROLEMIZZANTI E IPOLIPIDEMIZZANTI

Gouni-Berthold et al hanno condotto uno studio randomizzato su tre gruppi composti da 24 soggetti, i quali hanno ricevuto un trattamento di 14 giorni con anti-dislipidemici comunemente utilizzati per ridurre l'accumulo di lipidi, come simvastatina, ezetimibe o la loro combinazione. I risultati hanno mostrato che l'irisina circolante è aumentata in modo significativo nei soggetti trattati con simvastatina, ma non in quelli trattati con ezetimibe. Tali variazioni sono risultate indipendenti dai cambiamenti nei livelli di colesterolo LDL e non correlate ai cambiamenti nei livelli di creatina chinasi. In un modello di cellule muscolari scheletriche umane primarie (HSKMC), la simvastatina ha aumentato significativamente la secrezione di irisina e l'espressione di FNDC5 (Gouni-Berthold et al, 2013).

Diversi studi hanno valutato la capacità del fenofibrato di agire sulla termogenesi e su vari marker correlati all'irisina (Dias et al, 2018). Il fenofibrato, un agonista del recettore α attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARα), è in grado di ridurre i livelli di trigliceridi e colesterolo nel sangue e ridurre la massa corporea (Rachid et al, 2015 A). Questo farmaco aumenta anche il numero di piccoli adipociti nei topi obesi indotti dalla dieta e resistenti all'insulina e aumenta il dispendio energetico nei topi obesi indotti dalla dieta, attraverso la sua capacità di sovraregolare l'espressione dei geni legati alla termogenesi, come UCP1, contenente il dominio PR 16 (PRDM16) e PGC1α (Rachid et al, 2015 A; Rachid et al, 2015 B). Inoltre, aumentando l'espressione di PGC1α, il fenofibrato aumenta i livelli di irisina e quindi l'espressione di UCP1. È interessante notare che, con lo stesso meccanismo, il fenofibrato può indurre l'imbrunimento degli adipociti di WAT (Rachid et al, 2015 B).

Nel lavoro pubblicato da Feng et al, un gruppo di pazienti con diabete di tipo 2 e ipertrigliceridemia è stato trattato con fenofibrato per 8 settimane. L'irisina sierica era significativamente più alta nel gruppo di pazienti con diabete e ipertrigliceridemia rispetto al gruppo di controllo, mentre i soggetti diabetici trattati per 8 settimane con fenofibrato hanno mostrato livelli di irisina sierica significativamente ridotti rispetto al basale. In conclusione, il fenofibrato ha ridotto l'irisina sierica nei pazienti con diabete di tipo 2 e ipertrigliceridemia, indicando che gli agonisti PPARα possono proteggere dai disturbi metabolici migliorando la resistenza all'irisina (Feng et al, 2015).

EFFETTO DELL’ACIDO RETINOICO ALL-TRANS

L'acido retinoico all-trans (ATRA o Tretinoina) deriva dalla vitamina A sostituendo il gruppo alcolico terminale con un gruppo carbossilico. ATRA, come altri retinoidi, è utilizzato da decenni nella prevenzione e nella cura del cancro ed è noto anche per i suoi effetti benefici contro l'obesità e la sindrome metabolica. Amengual et al nel 2018 hanno valutato l'interazione di ATRA con il metabolismo dei muscoli scheletrici e l'attività secretoria di importanti miochine e fattori coinvolti nel meccanismo di ossidazione degli acidi grassi (FAO). I risultati hanno mostrato gli effetti diretti di ATRA nella stimolazione della FAO, nella produzione di irisina nelle cellule del muscolo scheletrico (miociti C2C12), nell'aumento dei livelli sierici di irisina e nella trascrizione di FNDC5 in un modello animale (topi maschi NMRI). L'analisi immunoistochimica di FNDC5 ha suggerito che il trattamento con ATRA ha migliorato il rilascio di FNDC5 / irisina dal muscolo scheletrico e il suo accumulo nel BAT interscapolare e nel WAT inguinale (Amengual et al, 2018).

Al contrario, Abedi-Taleb et al nel 2019 hanno osservato che il trattamento dei miotubi C2C12 con ATRA non ha modificato l'espressione genica di FNDC5. È anche interessante notare che la combinazione di ATRA e resveratrolo è stata in grado di regolare l'espressione genica di FNDC5 che è risultata significativamente aumentata (Abedi-Taleb et al, 2019).

EFFETTO DELLA FOLLISTATINA

La follistatina, nota anche come proteina legante l'attivina, è una glicoproteina autocrina espressa in quasi tutti i tessuti degli animali superiori e la sua funzione primaria è il legame e la bioneutralizzazione dei membri della superfamiglia TGF-β. Li et al hanno osservato che la somministrazione di follistatina in topi obesi alimentati con dieta HF aumenta il dispendio energetico stimolando il processo di browning del tessuto adiposo sottocutaneo. La follistatina ha anche promosso la secrezione di irisina, attraverso la via di segnalazione AMPK / PGC1α, responsabile dell'attivazione dei meccanismi di imbrunimento e dell'aumentata sensibilità all'insulina (Li et al, 2019 D).

 Effetto di agenti nutraceutici sulla secrezione di irisina

EFFETTO DEI POLIFENOLI

Molte ricerche si sono concentrate sulla valutazione della possibile interazione tra sostanze naturali e secrezione di irisina, evidenziandone le possibili implicazioni nutraceutiche e fitoterapiche. Sulla base di un contesto farmacologico o nutrizionale, Silvester et al nel 2019 hanno valutato l'ampia letteratura scientifica, descrivendo il ruolo di alcune classi di polifenoli nel trattamento dell'obesità

mediante induzione del processo di browning ed il coinvolgimento della via PGC1α / UCP1. I composti analizzati sono stati: Flavan-3-ols, Resveratrolo, Capsaicina, Curcumina, Timolo, Crisina, Magnololo, Honokiol, Quercetina. I risultati ottenuti da studi preclinici e clinici hanno mostrato che alcuni di questi composti fitochimici alimentari potrebbero essere positivamente correlati con un meccanismo termogenico legato alla via dell'irisina (Silvester et al, 2019).

Studi recenti suggeriscono che parte degli effetti dell'icariina possono derivare da una stretta correlazione con l'irisina. L'icariina è un flavonoide contenuto in grandi quantità nelle piante del genere Epimedium, diffuso in Asia. Chen et al hanno trattato cellule muscolari scheletriche murine (miociti C2C12) con icariina. L'analisi dei risultati ha mostrato che l'icariina sovraregolava l'espressione genica di FNDC5 e PGC1α e che causava la fosforilazione di AMPK in modo dose-dipendente. Questi risultati sono stati confermati in vivo, dove accanto all'aumentata espressione di PGC1α e FNDC5 e alla fosforilazione di AMPK, sono stati osservati un imbrunimento del tessuto adiposo inguinale e una sovraespressione di UCP1 (Chen et al, 2019 A).

Si suggerisce che alcuni polifenoli, inclusi gli isoflavoni, come la genisteina, aumentino l'espressione dei marker di browning. È stato dimostrato che il consumo di genisteina riduce l'aumento di peso corporeo e migliora la tolleranza al glucosio e i livelli di lipidi nel sangue. Palacios-Gonz´alez et al hanno studiato i potenziali meccanismi di stimolazione mediante i quali la genisteina attiva il processo di browning del WAT. I risultati hanno indicato che la genisteina potrebbe stimolare il processo di imbrunimento promuovendo PGC1α / FNDC5 nel muscolo scheletrico e portando quindi ad un aumento di irisina. Allo stesso modo, l'incubazione dei preadipociti con genisteina ha attivato il processo di imbrunimento aumentando l'espressione di UCP1 e di alcuni biomarcatori di imbrunimento in modo dipendente dalla concentrazione, probabilmente mediante fosforilazione di AMPK (Palacios-Gonz´alez et al, 2019).

Analoghi risultati sono stati ottenuti da Shen et al, che hanno studiato gli effetti della genisteina su WAT, BAT e in generale sulla lipogenesi, in ratti alimentati con una dieta ricca di grassi. I risultati hanno mostrato che i livelli di irisina sono aumentati, insieme alla quantità di BAT e alla produzione di proteine, come UCP1, PGC1α e Cidea (Shen et al, 2019).

Altre evidenze scientifiche mostrano la capacità del resveratrolo (composto polifenolico prodotto naturalmente dalle bucce dell'uva) di interagire con l'espressione genica di FNDC5 e UCP1 / UCP2. Di conseguenza, bevande contenenti resveratrolo, come vino rosso e succo d'uva, potrebbero essere in grado di aumentare l'espressione di UCP1 e FNDC5, e quindi di irisina, aumentando il dispendio energetico anche se somministrate in una dieta ricca di grassi (Gonz´alez-Castejon & Rodriguez-Casado, 2011).

e sul processo di imbrunimento degli adipociti, riducendo l'accumulo di grasso e aumentando l'espressione dei marker di termogenesi, come UCP1 e proteina morfogenetica ossea 7 (BMP7). Questo studio ha mostrato che FNDC5 è stato ridotto in seguito ad una dieta HF e che la successiva integrazione di resveratrolo ha promosso la sua espressione, indicando quindi che questo composto ha un ruolo importante sull'espressione di FNDC5. Questo studio ha dimostrato che il resveratrolo può attivare FNDC5 e quindi irisina e geni associati al processo di termogenesi, contribuendo ad aumentare il dispendio energetico di tutto il corpo (Andrade et al, 2014).

I risultati sono stati confermati anche da Heredia-Lugo et al, nel cui studio hanno osservato che il resveratrolo è stato in grado di aumentare l'espressione di FNDC5 nel muscolo scheletrico dei topi (Heredia-Lugo et al, 2017).

De Souza Rochaa et al hanno mostrato un aumento dell'espressione di FNDC5 sia nei muscoli di ratti Wistar trattati con resveratrolo che in quelli trattati con succo d'uva, suggerendo che, oltre al resveratrolo, anche il succo d'uva potrebbe essere efficace nel modulare il sistema FNDC5 / UCP2 aumentando l'espressione di questi geni (Souza Rocha et al, 2016).

Al contrario, in uno studio condotto da Abedi-Taleb et al, il trattamento dei miotubi C2C12 con resveratrolo non ha mostrato la capacità di regolare l'espressione genica di FNDC5. È interessante notare che, nello stesso studio, la combinazione di resveratrolo e ATRA è stata in grado di regolare l'espressione di FNDC5, determinandone un aumento significativo rispetto al veicolo (Abedi-Taleb et al, 2019).

EFFETTO DI RUBUS OCCIDENTALIS

Prove scientifiche hanno dimostrato che il lampone nero (Rubus occidentalis L., una specie di Rubus originaria del Nord America orientale e ricca di polifenoli), è implicato nella perdita di peso e nella produzione di irisina. Il lampone nero era già noto per le sue proprietà antietà e per i suoi effetti su cataratta, alopecia e sbiancamento della pelle. Le colture di cellule umane trattate con quattro diversi estratti di bacche hanno aumentato l'espressione dell'irisina; in particolare le cellule del muscolo scheletrico e gli adipociti sono stati incubati per un'ora con estratti di lampone nero, mirtillo e lampone, osservando che tutti gli estratti stimolavano in modo significativo la secrezione di irisina. Tra questi, l'estratto di lampone nero, contenente molta delfinidina, ha mostrato l'effetto maggiore (Dan et al, 2018).

EFFETTO DEI FLAVONOIDI DEL GENERE CITRUS

I flavonoidi degli agrumi, tra cui naringenina e nobiletina, sono stati associati ad effetti preventivi nello sviluppo di disordini metabolici (Alam et al, 2014; Burke et al, 2018).

Chou et al hanno osservato che la somministrazione orale dell'estratto all’1% di Citrus reticulata nei topi per 11 settimane, ha ridotto significativamente il peso corporeo, il grasso dell'epididimo, il glucosio a digiuno, i trigliceridi e i livelli di colesterolo totale. I principali componenti fitochimici di

Citrus reticulata erano sinefrina, narirutina, esperidina, nobiletina e tangeretina. Questi effetti sono

stati attribuiti a una maggiore espressione di UCP1 e dei geni implicati nella termogenesi (Chou et al, 2018). Un altro flavanone degli agrumi, l'esperidina, è stato recentemente identificato come regolatore del metabolismo dei lipidi e del glucosio attraverso l'attivazione della via AMPK / PPAR (Xiong et al, 2019).

EFFETTO DELL’ESTRATTO DI VINACCIA

I possibili effetti di un estratto di vinaccia (ricco di flavonoidi) sull'irisina e sui meccanismi di imbrunimento sono stati studiati da Lanzi et al. In questo studio i ratti sono stati nutriti con dieta HF e trattati con estratto di vinaccia (300 mg/kg di peso corporeo) per sei settimane. L'estratto di vinaccia d'uva ha attivato la via FNDC5 / irisina e ha promosso la fosforilazione di AMPK nel muscolo scheletrico, aumentando quindi i livelli plasmatici di irisina. Questo trattamento ha attivato anche le proteine coinvolte nel meccanismo di browning, come PGC1α, PPARγ, PRDM16 e UCP1. Inoltre, questo studio si è concentrato anche sugli effetti dell'epicatechina, un flavonoide presente nell'estratto di vinaccia, che è stato in grado di limitare la down-regulation mediata dal palmitato sull'espressione della proteina FNDC5 e di conseguenza sulla produzione di irisina nei miotubi. Questo meccanismo è stato parzialmente mediato dall'attivazione di PGC1α (Lanzi et al, 2020).

EFFETTO DI ZATARIA MULTIFLORA

L'effetto dell'assunzione di Zataria multiflora Boiss. su irisina è stato esaminato e confrontato con l’effetto dell'esercizio fisico nelle donne in post-menopausa. I principali composti dell'olio essenziale di Zataria multiflora sono timolo e carvacrolo, che rappresentano rispettivamente il 26,8% e il 22,9%. Inoltre, ci sono molti altri costituenti in percentuali inferiori, come p-cimene, γ-terpinene, α-pinene e β-cariofillene. I risultati ottenuti dopo 8 settimane di trattamento (500 mg/die di estratto di foglie di Zataria multiflora) hanno mostrato che l'esercizio, l'integrazione di Zataria multiflora o la loro combinazione, hanno portato ad un aumento di irisina (Ghanbari-Niaki et al, 2018).

3. PATHWAY IRISINA

3.1 PGC1α

PGC1α è un coattivatore trascrizionale che media molti processi biologici legati al metabolismo energetico. Si tratta di un coattivatore di PPARγ che modula l'espressione della proteina disaccoppiante 1 (UCP1) e la termogenesi nel BAT, ma è anche un modulatore della biogenesi mitocondriale e del metabolismo ossidativo in molti tipi di cellule. PGC1α è indotto a livello della muscolatura scheletrica dall'esercizio fisico e stimola molti dei più noti effetti benefici dell'esercizio, tra cui biogenesi mitocondriale, angiogenesi, resistenza alla distrofia e all'atrofia muscolare. Inoltre i benefici salutari di un'elevata espressione di PGC1α possono andare anche oltre il tessuto muscolare, infatti è stato dimostrato che questa molecola stimola la secrezione di fattori dal muscolo scheletrico che influenzano la funzione di altri tessuti, come FNDC5 (Bostrom et al, 2012).

PGC1α infatti induce le cellule muscolari a secernere molecole che possono indurre l’attivazione di un processo termogenico nelle cellule. Bostrom et al nel 2012 hanno identificato i geni di cinque proteine come possibili bersagli di PGC1α nel muscolo: IL-15, FNDC5, VEGFβ, LRG1 e TIMP4. L'espressione di questi geni è risultata ridotta nei topi con delezione muscolo-specifica di PGC1α, mentre hanno mostrato che le concentrazioni di queste proteine sono aumentate nel muscolo di topi allenati (Bostrom et al, 2012). Analoghi risultati sono stati osservati nell’uomo da Vind et al attraverso le analisi delle biopsie di muscolo scheletrico (Vind et al, 2011), ma anche Nielsen & Pedersen hanno esaminato che con l'esercizio gli mRNA di FNDC5, VEGFβ, TIMP4 e IL-15 sono significativamente indotti (Nielsen & Pedersen, 2007).

D’altra parte il trattamento degli adipociti in coltura con IL-15 e VEGFβ ha rilevato effetti minimi sull'espressione di UCP1 e di altri geni del grasso bruno. FNDC5, invece, ha promosso un'induzione 7 volte maggiore dell'mRNA di UCP1. Sorprendentemente, UCP1 e altri 3 geni noti del grasso bruno, ELOVL3, COX7A e OTOP1, erano tra gli 8 geni maggiormente sovraregolati. Al contrario, i geni caratteristici dello sviluppo del grasso bianco erano sottoregolati, inclusa la leptina. Questi dati suggeriscono che l'attivazione dei geni che promuovono il browning e di quelli termogenici è una parte importante dell'azione di FNDC5 (Bostrom et al, 2012). Inoltre l’espressione di UCP1 è aumentata notevolmente sotto lo stimolo di FNDC5; al contrario BMP-7, un potente induttore del browning (Tseng et al, 2008), ha avuto un effetto molto minore (Bostrom et al, 2012).

3.2 FNDC5

La proteina FNDC5 (nota anche come FRCP2 e PeP) è composta da 209 residui di amminoacidi (aa). Contiene una sequenza di segnale N-terminale composta da 29 aa, un dominio di fibronectina di

tipo III con 94 aa, una regione non identificata composta da 28 aa, un dominio transmembrana con 19 aa e una parte C-terminale con 39 aa. Il frammento C-terminale di FNDC5 si trova nel citoplasma, mentre la porzione N-terminale sporge nello spazio extracellulare. Quest’ultima viene scissa proteoliticamente per produrre irisina che viene infine rilasciata in circolo (Panati et al, 2018. Mahgoub et al, 2018.).

L'espressione di FNDC5 nelle cellule muscolari indifferenziate è 20 volte inferiore a quella nei miotubi differenziati; inoltre l’espressione di FNDC5 nel tessuto adiposo sottocutaneo è circa 100 volte inferiore rispetto al tessuto muscolare (Kurdiova at al, 2014).

Bostrom et al hanno osservato un forte aumento degli adipociti positivi per UCP1 nelle cellule trattate con FNDC5. L'analisi al microscopio elettronico delle cellule trattate ha evidenziato inoltre una maggiore densità di mitocondri rispetto alle cellule di controllo, coerente con un fenotipo simile al grasso bruno e con un'elevata espressione genica mitocondriale. Le dimensioni dei mitocondri, tuttavia, erano simili tra i gruppi. Infine, le misurazioni del consumo di ossigeno hanno fornito prove funzionali di un aumentato dispendio energetico in seguito all'esposizione a FNDC5. Il consumo totale di ossigeno è stato notevolmente aumentato con FNDC5 e la maggior parte di questa respirazione è risultata disaccoppiata. Pertanto, FNDC5 induce fortemente la termogenesi e attiva il browning in adipociti in coltura. In netto contrasto, FNDC5 ha mostrato effetti scarsi o nulli sulle cellule adipose brune classiche isolate dal deposito interscapolare.

Bostrom et al hanno cercato di definire anche l'intervallo di tempo durante il processo di differenziazione in cui FNDC5 era efficace. Il trattamento durante i giorni 3–4 e 5–6 è stato efficace nell'indurre l'mRNA di UCP1, anche se non quanto l’esposizione a FNDC5 durante l’intero processo di differenziazione. Inoltre, il trattamento durante i primi due giorni non ha avuto alcun effetto sui livelli di UCP1, suggerendo che FNDC5 agisca principalmente durante il processo di differenziazione (Bostrom et al, 2012). Anche AMP ciclico (cAMP) è un'importante via di segnalazione nella termogenesi, che promuove il browning a valle della stimolazione β-adrenergica. È interessante notare che Bostrom et al hanno evidenziato che le cellule esposte a FNDC5 aumentano l'espressione di UCP1 in modo additivo quando esposte alla forskolina, un attivatore dell'adenil ciclasi (Bostrom et al, 2012).

Nell'uomo il gene FNDC5 ha tre varianti e le espressioni di esse variano a seconda del tipo di linee cellulari normali e cancerose. Kim et al hanno eseguito una PCR quantitativa in tempo reale ed hanno osservato diversi livelli di espressione dell’mRNA di FNDC5 in diversi tessuti e linee cellulari: la più alta espressione è stata trovata nel cuore, ma un’elevata espressione è stata evidenziata anche nel cervello, nel fegato, nei muscoli scheletrici e nelle ovaie (Kim et al, 2017).

Figura 2. Struttura di FNDC5 ed organizzazione monomerica e dimerica di irisina.

3.3 PPARα

FNDC5 è in grado di stimolare un processo termogenico grazie al reclutamento di PPARα. È stato dimostrato che questo recettore nucleare guida l'espressione di UCP1 e di molti altri geni coinvolti nel browning delle cellule adipose (Komatsu et al, 2010).

L’mRNA di PPARα è aumentato di 3 volte in seguito al trattamento con FNDC5. È importante sottolineare che l'aumento di UCP1 mediato da FNDC5 è stato significativamente ridotto quando le cellule sono state trattate con l’antagonista selettivo di PPARα, GW6471. L'antagonista di PPARα ha inoltre riportato a livelli standard l’espressione dei geni per leptina e adiponectina, ridotti invece dal trattamento con FNDC5, suggerendo che FNDC5 agisce per indurre l'espressione genica di UCP1, almeno in parte, tramite PPARα (Bostrom et al, 2012).

3.4 Identificazione delle vie di signaling nel processo di browning mediato da irisina

Una delle funzioni più importanti di irisina è la capacità di indurre profonde modificazioni nel tessuto adiposo sottocutaneo, stimolando l'espressione di UCP1 e promuovendo il browning delle cellule (Bostrom et al, 2012).