ABSTRACT
Evaluation of renal injury induced by subchronic administration of Ochratoxin A dissolved in red wine in a rats experimental model.
Background. Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin produced by several species of Aspergillus and Penicillum. OTA contaminates feed and human food, especially cereal and grain products. Recently low concentration of OTA have been identified in coffee, beer, grape juice and wine, causing a remarkable alarm in the public opinion and in Health Authorities. OTA shows nephrotoxic and cancerogenic activity in kidney. Its metabolites are genotoxic and can complex with DNA in kidney cells. Furthermore, it was demonstrated that OTA induces free radical formation with conseguent lipid peroxidation and cellular injury. OTA is probably the principal agent involved in the development of the Balchany’s Endemia Nephropathy (BEN), a chronic disease characterized by altered renal function and renal fibrosis. In a previous study, carried out in our laboratory, it has been demonstrated that acute OTA administration in rat causes tubulo-toxic injury, reduces renal function and causes oxidative tubular damage. If OTA is given in Wine matrix or in a Ethanol solution at 13.5% the toxicity was reduced.
Aim of Study: The aim of this study is to evaluate pathological renal alterations in an experimental model of OTA sub-chronic administration, and to investigate if wine, or ethanol solution at 13.5%, is able to reduced this renal damage using an “in vivo” model.
Methods: Sixty male Wistar rats (180-200gr.) have been randomized in 6 groups receiving: 1) water, 2) red wine (Barbera d’Asti 13,5%), 3) ethanol 13.5% dissolved in water, 4) OTA (Sigma Aldrich Missouri USA), 5) OTA dissolved in red wine (Barbera d’Asti alcohol 13,5%), 6) OTA dissolved in 13.5% ethanol (water solution). The OTA was administered for 3 months at a dosage (289μg/Kg/48 hrs) in order to induce a renal damage. OTA was dissolved in NaHCO3 0.1 M (pH 7.4), and then dissolved in H2O, in red wine (Barbera d’Asti alcohol 13,5%) or in a solution of 13.5% ethanol. Every rat received 0.5ml of each solution by gastric gavage. Urine have been collected before treatment starting and at days 15, 30, 60 and 90 to determine protenuria and enzymuria (N-acetyl-βglucosaminidase NAG). At day 90 rats were sacrificed, blood and kidney sample were collected to determine serum creatinine, renal content of lipohydroperoxides (LPO) and superoxide dismutases (SOD) tissutal activity. Tissue samples were included in paraffin and stained with Sirius red, to evaluate and quantify collagen deposition by a software image analyser. Kidney sections with PAS staining were also prepared. A molecular analysis technique has been used to evaluate the gene expression correlated with fibrosis process, in particular interstizial collagen (type I and III) mRNA and Transforming Growth Factor β-1 (TGF β-1) mRNA levels. Body and kidney have been weigthed, and serum was collected to evaluate IL-6 levels by Elisa Assay (Bender Med Systems).
Results: The analysis of serum creatinine shows a significant altered renal function in groups 3 and 4 (1.80±0.58 e 1.67±0.60 mg/dl respectively), versus group 1, 2 and 5 (0.90±0.27, 0.92±0.46 e 1.13±0.46 mg/dl respectively)
(p<0.05). NAG levels in group 4 increase significantly at day 15 versus all other groups (3.38±1.20 vs 1.00±0.50, 1.32±0.60, 1.38±0.65, 0.98±0.68 and 1.40±0.90 respectively) (p<0.05), then they reduced at day 30 and 60 and shows a new significant increase at day 90 (7.43±2.10 vs 2.77±1.20, 4.28±1.90, 1.22±0.80 and 1.13±0.70 respectively) (p<0.05). Also group 3 at day 90 was significantly increased respect to groups 1, 2, 5 and 6 (9.74±2.40 vs 2.77±1.20, 4.28±1.90, 1.22±0.80 and 1.13±0.70 respectively) (p<0.05). Proteinuria levels were detected following OTA administration at days 15 versus group 1 (2.39±
2.12 vs 1.21±1.10 increm.% respectively) (p<0.05), at days 30 and 60 versus groups 1 and 5 (30: 4.08±1.50 vs 1.81±1.08 and 2.64±0.84 respectively) (p<0.05) (60.: 2.97±1.50 vs 1.83±1.08 and 1.80±0.84 respectively) (p<0.05) and at day 90 versus groups 1, 5 and 6 (2.55±1.00 vs 1.68±0.98, 1.38±0.43 and 1.57±0.81 respectively) (p<0.05); protenuria increased significantly in group 3 at day 30 and 60 versus 1, 5 (30: 3.70±1.50 vs 1.81±1.08 and 2.64±0.84 respectively) (p<0.05) (60: 3.00±1.70 vs 1.83±1.08 and 1.80±0.84 respectively) (p<0.05) and at day 90 versus groups 1, 5 and 6 (3.22±2.01 vs 1.68±0.98, 1.38
±0.43 and 1.57±0.81 respectively) (p<0.05); group 6 shows a significantly increased in proteinuria only at day 60 versus group 1 and 5 (2.19±1.29 vs 1.83
±1.08 and1.80±0.84 respectively) (p<0.05). Evaluation of oxidative stress parameters shows that LPO levels are significantly increased in groups 3, 4, 6 versus groups 1, 2 and 5 (3.94±1.42, 3.56±2.20 and 3.46±1.15 vs 1.58±0.92, 1.05±0.61 and 2.18±1.36 mmol/g.prot. respectively) (p<0.05), while SOD levels decrease only in group 4 versus groups 1, 2 e 5 (25.92±13.17 vs 61.69±24.38, 49.29±12.01 and 48.60±18.81 U/mg.prot. respectively) (p<0.05). Molecular
analysis of COL (type I and III) and TGFβ 1 mRNA expression not show significative variations. Kidneys weigh has a significative reduction in group 4 and 6 versus. Groups 1, 2, 3 and 5. Finally in serum IL-6 levels were significantly high in gropus 3, 4 and 6 versus groups 1, 2 and 5 (90.97±21.09, 62.95±16.82 and 57.28±14.32 vs 15.97±8.66, 28.06±6.48 and 36.89±7.35 pg/ml respectively) (p<0.05).
Discussion: When OTA is administered at the nephrotoxic dosage, as reported by literature, is observed at day 90 an increase of kidney weight, serum creatinine, enzymuria, proteinuria, renal LPO, tissutal SOD activity and serum IL-6 levels too. Enzymuria and protenuria values for OTA group have an oscillating course with peaks at day 15 and 90, probably due to alternated phases of necrosis and regeneration process. A similar trend was observed for EtOH, while in the other groups (OTA-Wine and Wine) these parameters are stable for the whole experimental period. When OTA is dissolved in wine it shows less toxic effects and there is a suspected protection; this protective effect is probably due to non-alcoholic wine components, since OTA-EtOH group evidences a minor degree of protection.
Conclusions: Our results show that OTA concentration in wine does not induces nefhrotoxic effects. OTA sub-chronic administration causes toxic effects to kidney while administration of non-alcoholic wine components is able to reduce tubular and oxidative damage.
RIASSUNTO
Titolo della tesi: Valutazione del danno renale indotto da somministrazione sub- cronica di Ocratossina A disciolta nel vino, in un modello sperimentale di ratto.
Introduzione: L’Ocratossina A (OTA) è una micotossina prodotta da molte specie di Aspergillus e Penicillium. Contamina mangimi ed alimenti, specialmente cereali e derivati del grano. Recentemente basse concentrazioni sono state rilevate in alcune bevande come nel caffè, nella birra, nel succo d’uva e nel vino, causando un allarme nell’opinione pubblica e nelle alte autorità. L’OTA ha attività nefrotossica e cancerogena nel rene. I suoi metaboliti sono genotossici e formano complessi con il DNA delle cellule renali in specie animali diverse. E’ stato dimostrato che l’OTA induce la formazione di radicali liberi dell’ossigeno con conseguente perossidazione lipidica e danno cellulare. E’ stato riscontrato che l’OTA è uno degli agenti coinvolti nello sviluppo della Nefropatia Endemica dei Balcani (BEN), una malattia cronica caratterizzata da alterata funzionalità e fibrosi renale. Uno studio precedente, svolto nel nostro laboratorio, ha dimostrato che la somministrazione acuta di OTA nei ratti provoca un danno tubulo-tossico, diminuzione della funzionalità renale oltre che al danno ossidativo a livello tubulare, mentre nella somministrazione di OTA associata al vino ed all’etanolo si ha la riduzione della funzionalità renale ma diminuisce il danno ossidativo, quindi si ha una protezione da parte di questi.
Scopo del lavoro: Sulla base dei dati ottenuti dal precedente studio, abbiamo deciso di valutare le alterazioni patologiche a livello renale dopo somministrazione sub-cronica di OTA e l’eventuale protezione da parte dei numerosi anti-ossidanti presenti nel vino. L’esperimento è stato condotto in un modello sperimentale in vivo, utilizzando ratti Wistar.
Materiali e Metodi: Sessanta ratti Wistar maschi (180-200gr.) sono stati suddivisi in 6 gruppi: 1) Gruppo controllo a cui è stata somministrata acqua, 2) Gruppo Vino a cui è stato somministrato vino rosso (Barbera d’Asti con gradazione alcolica pari al 13.5%), 3) Gruppo Et-OH in cui i ratti hanno ricevuto etanolo al 13,5% in acqua 4) Gruppo OTA in cui i ratti hanno ricevuto una dose di OTA (Sigma Aldrich Missouri USA) pari a 289μg/Kg/48 ore, 5) Gruppo OTA-vino in cui ratti hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289μg/Kg/48 ore disciolta nel vino con una gradazione alcolica pari al 13.5%, 6) Gruppo OTA-EtOH in cui i ratti hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289μg/Kg/48 ore disciolta in etanolo al 13.5% (soluzione acquosa). Il trattamento è stato condotto per 3 mesi. Gli animali hanno ricevuto una dose di OTA pari a 289μg/Kg/48 ore per indurre un sicuro effetto lesivo a livello renale.L’OTA è stata disciolta in NaHCO3 0.1 M (pH 7.4), quindi diluita ulteriormente in H2O, vino rosso (Barbera d’Asti con gradazione alcolica pari al 13.5%) ed etanolo al 13.5%. I ratti hanno ricevuto 0.5ml delle rispettive soluzioni mediante sonda gastrica e le urine sono state raccolte al 15°, 30°, 60° e 90° giorno di trattamento. Al 90° giorno gli animali sono stati sacrificati e sono stati raccolti campioni di sangue e di tessuto renale al fine di determinare la creatinina sierica, l’enzimuria (considerando l’N-acetil-βglucosaminidasi NAG), la proteinuria, il contenuto di lipoperossidi nel tessuto renale (LPO) ed i livelli della superossido
dismutasi tissutale (SOD). Per l’analisi morfologica i preparati renali inclusi in paraffina, sono stati colorati con Rosso Sirius, un colorante istologico specifico per il collagene; la quantificazione del collagene presente è stata effettuata mediante analisi dell’immagine utilizzando un software adatto. E’ stata eseguita una analisi molecolare per valutare l’espressione di geni correlati con il processo di fibrosi; in particolare sono stati valutati i livelli di mRNA del collagene interstiziale (tipo I e III) ed i livelli di mRNA del Transforming Growth Factor β-1 (TGF β-1). Sono stati inoltre considerati i pesi corporei e dei reni, oltre alla cellularità glomerulare dopo aver colorato fette di reni mediante colorazione PAS. Mediante dosaggio ELISA sono stati valutati i valori di IL-6 sierica dei vari gruppi trattati. (Bender Med Systems).
Risultati: Analizzando la creatinina sierica si osserva una alterata funzionalità renale nei gruppi 3 e 4 (1.80±0.58 e 1.67±0.60 vs 1, 2 e 5, p< 0.05). Analizzando l’enzimuria (NAG) si osserva un andamento particolare nel gruppo 4: al 15° giorno si ha un significativo aumento rispetto agli altri gruppi (3.38±1.20 p< 0.05 valore incrementale), per poi ridursi al 30° e 60° giorno e aumentare significativamente al 90°, come anche nel gruppo 3 (7.43±2.10; 9.74±2.40 vs 1, 2, 5, 6. p<0.05). Per quanto riguarda la proteinuria, viene evidenziato un effetto nefrotossico dell’OTA a tutti i tempi considerati, (2.39±0.43 vs 1, 4.08±0.67; 2.97±0.47 vs 1 e 5, 2.55±0.32 vs 1, 5 e 6 p< 0.05); si osserva inoltre un aumento significativo a partire dal 30° giorno fino al 90° del gruppo 3 (3.70±0.37; 3±0.30, vs 1, 5; 3.22±0.32 vs 1, 5 e 6 p< 0.05); al 60° giorno si evidenzia un significativo aumento della proteinuria nel gruppo 6 (2.19±0.41 vs 1 e 5; p< 0.05). I livelli di LPO sono significativamente aumentati nei gruppi 3, 4, 6 (3.56±2.20; 3.94±1.42; 3.46±1.15 µmol/g prot. vs 1, 2
e 5. p< 0.05), mentre i livelli di SOD diminuiscono significativamente solamente nel gruppo 4 (25.92±13.17 U/mg prot. Vs 1, 2 e 5.). L’analisi molecolare dell’espressione dei livelli di mRNA del COL (tipo I e III) ed i livelli di mRNA del TGFβ 1 non ha evidenziato significative variazioni. Al momento del sacrificio si notava una differenza significativa nel peso dei reni dei gruppi 1 e 3 vs 4, 6 e 5 (1.06±0.10; 1.06±0.10 p<0.05). I gruppi 3, 4 e 6 evidenziano livelli significativamente più alti di IL-6 sierica rispetto ai gruppi 1, 2 e 5 (76.94±19.98; 110.21±26.36; 83.19±34.23. p< 0.05).
Discussione: I nostri dati mettono in evidenza che le concentrazioni di OTA contenute nel vino non esplicano effetti tossici a livello renale. Quando l’OTA viene somministrata in dosaggi elevati si osserva un aumento dei livelli sierici di IL-6 al 90°giorno ed alterazione dei parametri renali quali l’aumento del peso dei reni, della creatinina sierica, dell’enzimuria, della proteinuria, del contenuto renale di lipoperossidi e dell’attività della SOD tissutale.Per quanto riguarda i dati sull’enzimuria e sulla proteinuria nel gruppo OTA, è da sottolineare l’andamento oscillante con “picchi” ai giorni 15 e 90 dovuto probabilmente all’alternarsi di fasi di necrosi e rigenerazione cellulare. Questi andamenti, come anche analoghi incrementi dei parametri in studio, si osservano nel gruppo trattato con etanolo, mentre il gruppo trattato con vino non presenta queste alterazioni. Quando l’OTA viene disciolta nel vino non si evidenziano effetti tossici, anzi si ha una protezione; tale protezione è probabilmente a carico della componente non-alcolica del vino, dato che il gruppo OTA-EtOH mostra un minor grado di protezione.
In conclusione: la somministrazione sub-cronica di OTA determina effetti tossici a livello renale mentre le caratteristiche farmacologiche delle componenti non alcoliche del vino sembrano ridurre sia il danno tubulare che quello ossidativo .
Indice
Capitolo 1: Le Micotossine 1
Capitolo 2: L’Ocratossina A 3
2.1 Azione Nefrotossica del’Ocratossina A 10 2.1.1 La Nefopatia Endemica dei Balcani 12 2.2 Ocratossina A, Cancerogenesi e Citotossicità 14 2.3 Immunotossicità e Apoptosi Indotte dall’Ocratossina A 16
Capitolo 3: Lo Stress Ossidativo 19
3.1 I Radicali Liberi 21
3.2 Lipoperossidazione 24
3.3 Sistemi Antiossidanti 25
3.3.1 Gli Antiossidanti Endogeni 25
3.3.2 Gli Antiossidanti Esogeni: i Polifenoli 26 Capitolo 4: Somministrazione Acuta di Ocratossina A 30
Capitolo 5: Scopo del Lavoro 32
Capitolo 6: Materiali e Metodi 34
6.1 Modello Sperimentale 34
6.2 Sezione A: pesi corporei e renali 38
6.3 Sezione B: Valutazione degli Indici di Funzionalità Renale 38
6.4 Sezione C: Analisi Morfologica 40
6.5 Sezione D: Indagine Molecolare 46
6.6 Sezione E: Valutazione degli Indici di Flogosi e
di Stress Ossidativi 50
7.1 Pesi Renali e Corporei 54
7.2 Funzionalità Renale 58
7.3 Fibrosi Interstiziale ed
Indagine Molecolare dell’Espressione degli mRNA 63 7.4 Analisi Morfologica e Cellularità’ Glomerulare 66
7.5 Indici di Stress Ossidativo 73
7.6 Indice di Flogosi 75
Capitolo 8: Discussione 76
Capitolo 9: Conclusioni 82
Abbreviazioni
BEN = Nefropatia Endemica dei Balcani CIN = Nefropatia Cronica Interstiziale COL = Collagene
COX = Ciclossigenasi CYP = Citocromo
IARC = Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro IL-6 = Interleuchina 6
LPO = Lipoperossidi LPS = Lipoporisaccaridi MDA = Malondialdeide
MIPAF = Ministero Italiano delle Politiche Agricole e Forestali NAG = N-acetil-βglucosamidasi
NIH = Istituto Nazionale per la Salute OTA = Ocratossina A
ROS = Specie Reattive dell’Ossigeno SOD = Superossido Dismutasi
TGF β1 = Transforming Growth Factor β-1 WHO = World Health Organization
