Dipartimento di Scienze Veterinarie
Corso di Laurea Magistrale in Medicina Veterinaria
Tesi di Laurea
Trasfusioni di eritrociti nel cane: studio
della casistica del Centro Ospedaliero
Universitario Veterinario (CHUV) di
Montréal, Canada
Relatore
Candidata
Prof. George Lubas Angela D’Urso
Correlatore
Dott.ssa Alessandra Gavazza
2
Sommario
1) Riassunto ... 5 2) Abstract ... 7 Parte Generale ... 9 3) Introduzione ... 9 4) Il cane donatore ... 114.1 Caratteristiche del donatore ... 11
4.2 Fase di arruolamento ... 12
4.3 Analisi e donazioni ... 15
4.4 Criteri di esclusione permanente e temporanea della donazione ... 17
5) I differenti gruppi sanguigni ... 18
5.1 Gli antigeni ... 18
5.2 Studi di prevalenza dei gruppi sanguigni ... 22
5.3 Tipizzazione del gruppo sanguigno... 28
5.4 Prove di compatibilità crociata (CROSS-MATCH)... 32
6) La donazione di sangue ... 33
6.1 Prelievo di sangue nel cane ... 33
6.2 Il volume della donazione ... 35
6.3 La raccolta del sangue ... 35
6.4 L’etichettatura ... 35
6.5 Il trasporto i sangue e degli emocomponenti ... 38
7) I prodotti sanguigni ... 39
8) La trasfusione di sangue ... 51
8.1 Somministrazione della trasfusione ... 51
8.2 Dosaggio e modalità di somministrazione ... 51
9) Reazioni trasfusionali ... 54
9.1 Trattamento delle reazioni trasfusionali ... 61
10) Il monitoraggio della trasfusione sanguigna ... 63
11) Decidere quando trasfondere ... 66
11.1 “La trasfusione è determinata dai segni clinici e non da un Hct prestabilito”. ... 66
11.2 “La pratica ottimale delle trasfusioni non è ancora stata stabilita” ... 67
Parte sperimentale ... 70
12) Materiali e metodi ... 71
12.1 Riceventi e i prodotti trasfusi ... 71
3
12.3 Gravità dell’anemia nei soggetti riceventi ... 72
12.4 Indici corpuscolari, presentazione acuta e cronica e la rigenerazione dell’anemia .. 73
12.5 Valutazione tra ematocrito pre-trasfusione e suo incremento nel tempo in seguito alla trasfusione... 74
12.6 Confronto dell’incremento di ematocrito nelle presentazioni acute e in quelle croniche ... 75
12.7 Confronto degli incrementi dell’ematocrito in relazione alla causa dell’anemia... 75
12.8 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione al prodotto trasfuso (PRBC versus FWB) ... 75
12.9 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’ematocrito del donatore. ... 75
12.10 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’età della sacca ... 76
12.11 Monitoraggio dei parametri vitali ... 76
13) I risultati ... 78
13.1 Riceventi e i prodotti trasfusi ... 78
13.2 Le cause di anemia e di trasfusione ... 81
13.3 Gravità dell’anemia nei soggetti riceventi ... 84
13.4 Indici corpuscolari, presentazione acuta e cronica e la rigenerazione dell’anemia .. 85
13.5 Valutazione tra ematocrito pre-trasfusione e suo incremento nel tempo in seguito alla trasfusione... 89
13.6 Confronto dell’incremento di ematocrito nelle presentazioni acute e in quelle croniche ... 100
13.7 Confronto degli incrementi dell’ematocrito in relazione alla causa dell’anemia.... 102
13.8 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione al prodotto trasfuso (PRBC versus FWB) ... 104
13.9 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’ematocrito del donatore. ... 105
13.10 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’età della sacca ... 106
13.11 Monitoraggio dei parametri vitali ... 108
14) Discussioni ... 122
14.1 Riceventi e i prodotti trasfusi ... 122
14.2 Le cause di anemia e di trasfusione ... 123
14.3 Gravità dell’anemia nei soggetti riceventi ... 123
14.4 Indici corpuscolari, presentazione acuta e cronica e la rigenerazione dell’anemia 124 14.5 Valutazione tra ematocrito pre-trasfusione e suo incremento nel tempo in seguito alla trasfusione... 125
14.6 Confronto dell’incremento di ematocrito nelle presentazioni acute e in quelle croniche ... 127
4
14.7 Confronto degli incrementi dell’ematocrito in relazione alla causa dell’anemia.... 128
14.8 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione al prodotto trasfuso (PRBC versus FWB) ... 128
14.9 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’ematocrito del donatore. ... 128
14.10 Confronto dell’incremento dell’ematocrito in relazione all’età della sacca ... 129
14.11 Monitoraggio dei parametri vitali ... 129
15) Conclusioni ... 132
5
1) Riassunto
Parole chiave: Trasfusione, cane, ematocrito, acuto, cronico, PRBC, FWB.
Background: Valutare la pratica emotrasfusionale come trattamento salva vita in uno studio
retrospettivo (2013-2016) presso il Centro Ospedaliero Universitario Veterinario dell’Università di Montréal, Canada.
Obiettivi: Classificare l’anemia dei soggetti riceventi la trasfusione. Analizzare l’incremento
dell’ematocrito a seguito della trasfusione in relazione alla gravità dell’anemia, alla presentazione acuta o cronica e alle caratteristiche del prodotto trasfuso. Analizzare i parametri vitali (frequenza cardiaca e respiratoria, temperatura e pressione sanguigna)
monitorati durante la trasfusione. Determinare quando è necessario intervenire in un paziente anemico con una trasfusione di sangue e fissare, quando possibile, l’importanza di alcuni valori dell’emogramma (Hct, MVC, MCHC), per avere dati più affidabili rispetto alla valutazione clinica dell’animale.
Materiali e Metodi: Analisi delle cartelle cliniche di 86 soggetti in cui è stato possibile
estrarre i processi patologici associati alla trasfusione, il tipo di presentazione dell’anemia (acuta e cronica), il motivo della trasfusione e il tipo di prodotto impiegato. Classificare la gravità dell’anemia in base all’Hct, il MCV, il MCHC e il grado di rigenerazione.
L’ematocrito pre-trasfusione è stato confrontato con: l’ematocrito post-trasfusione nei tempi T1, T2, T3, T4 e T5, la presentazione clinica dell’anemia (acuta o cronica), la causa di anemia (emorragia o emolisi), al prodotto trasfuso (PRBC e FWB), all’ematocrito del donatore e all’età della sacca. I parametri vitali (FC, FR, T°, P, aspetto mucose, TRC) sono stati monitorati durante la trasfusione a T0, 15’, 45’, 1h15’,1h45’, 2h15’, 2h45’, 3h15’, 3h45’, 4h15’.
Risultati e conclusioni: La principale causa di anemia nei soggetti trasfusi è rappresentata
dall’emorragia. La maggior parte dei soggetti presenta un valore di ematocrito tra 13 e 19% (anemia grave) e un grado di rigenerazione moderata- marcata. L’ematocrito post-
trasfusionale incrementa il suo valore nelle cinque fasce temporali, sia nelle anemie con presentazione acuta che in quelle con presentazione cronica. L’incremento del valore dell’ematocrito nelle anemie con presentazione cronica è moderatamente inversamente proporzionale nei tempi T1 e T4, mentre è fortemente inversamente proporzionale nel tempo T5. Più bassi sono i valori degli ematocriti pre trasfusionali delle anemie con presentazione cronica, maggiore è il loro incremento nei tempi T1, T4 e T5. Nel tempo T3, le anemie con
6 presentazione acuta hanno un incremento maggiore del valore dell’ematocrito rispetto a quelle con presentazione cronica. Non ci sono differenze negli incrementi degli ematocriti delle anemie trattate con PRBC e quelli delle anemie trattate con FWB. Non ci sono differenze tra gli incrementi dei valori degli ematocriti delle presentazioni acute e croniche trattate con sacche di sangue che hanno valori di ematocriti differenti. Gli ematocriti pre-trasfusionali che hanno un incremento maggiore sono quelli associati a sacche di sangue con età minore di 10 giorni. La frequenza cardiaca presenta delle variazioni durante il monitoraggio, in linea generale, simili tra i soggetti con presentazioni acute e i soggetti con presentazioni croniche. Infatti, ci sono dei valori costanti fino a circa 1h45’, mentre tra 1h45’ e 2h45’i cambiamenti presentano dei valori intermedi rispetto a quelli iniziali e a quelli finali, per poi ritornare costanti fino al termine della trasfusione, dove rientrano nel range di normalità. Le mucose nelle presentazioni acute modificano il loro colore da metà trasfusione. Nelle presentazioni croniche è invece la temperatura a subire un incremento, superata la prima metà della trasfusione. Dall’analisi complessiva dei risultati ottenuti è difficile stabilire l’importanza di alcuni valori dell’emogramma che possano con certezza indicare il momento appropriato in cui intervenire con una trasfusione. Pertanto la trasfusione deve essere considerata un mezzo di prevenzione affinché il valore dell’ematocrito (e quindi della capacità ossigenativa) non raggiunga decrementi preoccupanti nei pazienti bisognosi.
7
2) Abstract
Key words: transfusion, dog, hematocrit, acute, chronic, PRBC, FWB.
Background: To evaluate blood transfusion as life-saving treatment in a retrospective study
(2013 – 2016) carried out at the University Veterinary Hospital Centre in Montrèal, Canada.
Aims: To classify anemia in transfusion recipients. To analyze the hematocrit increase after
the transfusion, related to the severity of anemia, to its acuteness or chronicity and to the characteristics of the transfused product. To analyze the vitals parameters (cardiac and
respiratory frequencies, temperature and blood pressure) monitored during the transfusion. To determine when it is necessary to intervene on anemic patients through blood transfusions and to set, when possible, the importance of some hemogram values (Hct, MCV, MCHC), as more reliable data in comparison to the evaluation of the animal's clinic signs.
Materials and methods: Analysis of medical records of 86 patients, collecting their
pathological disorders related to transfusion, the type of clinical presentation of anemia (acute or chronic), the indications for transfusion and the type of blood product used. To classify anemia according to Hct, MCV, MCHC and the regeneration degree. Pre-transfusion
hematocrit was compared to: post-transfusion hematocrit times T1, T2, T3, T4 and T5, to the type of clinical presentation of anemia (acute or chronic), to the cause of anemia (hemorrhagic and hemolytic), to the type of blood product transfused (PRBC or FWB), to the donor’s hematocrit and to the age of the blood product. Vitals parameters (FC, FR, T°, BP, mucosae appearance, TRC) were monitored during the transfusion at T0, 15’, 45’, 1h15’, 1h45’, 2h15’, 2h45’, 3h15’, 4h15’.
Results and Conclusions: The main cause of anemia in transfusion recipients was
hemorrhage. Most patients had a hematocrit value between 13 and 19% (severe anemia) and moderate-severe grade regeneration. Post-transfusion hematocrit increases its value over the five time phases, both in anemia with acute or chronic presentation. The increase in the hematocrit value of anemia with chronic presentation is moderately inversely proportional in T1 and T4 times, while it is strongly inversely proportional at T5. The lower the
pre-transfusion hematocrit values are in anemia with chronic presentation, the higher the increase is in T1, T4 and T5. In T3, anemia with acute presentation has higher increase of the
hematocrit compared to those with chronic presentation. There are no differences in the increases of hematocrits of anemia treated with PRBCs and those treated with FWB. There
8 are no differences between the increases of hematocrit values in anemia with acute or chronic presentations treated with blood products having different hematocrit values. The
pre-transfusion hematocrit values that show higher increase are those associated with less than 10-day old blood product. During monitoring the heart rate shows some modification that are similar in patients with anemia with acute or chronic presentation. Indeed, there are constant values up to about 1h45' while between 1h45' and 2h45 ' the changes have intermediate values respect to the initial and final values, and then they return to the constant values until the end of the transfusion, when they stay in the normal range. The mucous membranes in the anemia of acute presentation change their color from the middle of the transfusion. Conversely, in the anemia with chronic presentation the temperature increases, from the first half of the
transfusion. From the overall analysis of the results obtained, it is difficult to establish the value of some hemogram parameters that could indicate the appropriate time when a blood transfusion should occur. Therefore, the transfusion should be considered as a preventive treatment in order that the hematocrit value (and hence oxygenation capability) does not reach worrying decreases in needed patients.
9
Parte Generale
3) Introduzione
La trasfusione è l’infusione di sangue o suoi componenti da un soggetto donatore ad un soggetto ricevente; l’autotrasfusione è il prelievo e la successiva re-immissione in circolo nello stesso soggetto. La trasfusione di sangue è una procedura salva-vita, oggi comunemente utilizzata in medicina veterinaria, tuttavia, se il ricorso agli emoderivati ed emocomponenti è regolamentato dalla normativa sul farmaco veterinario (D.Lgs. n.193/2006), la trasfusione di sangue intero necessita di linee guida aggiornate.
In Italia la trasfusione in ambito veterinario è regolamentata dalla “Linea guida relativa all’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in ambito veterinario”, redatta dal Ministero della Salute e pubblicata sulla Gazzetta Ufficiale n.25 del 1 febbraio 2016, che ha modificato la precedente Linea Guida, risalente al 2008. La Linea Guida si applica solamente al sangue intero, definito come “il sangue prelevato, per lo scopo trasfusionale, da animale donatore idoneo, con materiale sterile e in sacche autorizzate dal Ministero della Salute contenenti una soluzione anticoagulante-conservante”1. La Linea Guida è composta da 10 articoli e 7 allegati e disciplina vari aspetti, tra i quali: il prelievo, l’idoneità alla donazione e i criteri di esclusione, gli esami obbligatori ad ogni donazione, la tracciabilità e l’etichettatura del sangue ed i requisiti delle strutture veterinarie. La linea guida differenzia la struttura veterinaria trasfusionale dalla banca veterinaria del sangue, definendo la prima come struttura che svolge attività trasfusionale in emergenza ed esclusivamente al suo interno; la banca veterinaria del sangue è, invece, una struttura dove può essere prelevato, conservato e commercializzato il sangue prelevato dal donatore idoneo1. Per emocomponente si intende il prodotto derivato dalla frammentazione del sangue, mediante soli mezzi fisici o aferesi1; gli emocomponenti più frequentemente utilizzati in medicina veterinaria sono il concentrato di eritrociti (PRBC) ed il plasma.
L’emoderivato si ottiene, invece, tramite processazione industriale a partire dall’emocomponente; ne sono esempi l’albumina, le immunoglobuline, i fattori della coagulazione.
Gli emocomponenti sono legalmente equiparati agli emoderivati e la loro preparazione è possibile soltanto in alcuni centri appositamente autorizzati dal Ministero della Salute; l’utilizzo di emocomponenti nella pratica trasfusionale veterinaria ha notevoli vantaggi, tra i quali una
10 riduzione degli effetti indesiderati e la possibilità da parte di più soggetti di usufruire di una donazione1.
La trasfusione è una pratica terapeutica non esente da rischi e deve essere condotta nel rispetto della compatibilità tra donatore e ricevente, preliminarmente accertata tramite test come la tipizzazione del gruppo sanguigno ed il cross-match.
Di seguito andrò ad affrontare più dettagliatamente le tematiche base della medicina trasfusionale, in campo veterinario; nella parte generale verrà, inizialmente, descritto tutto ciò che c’è a monte della singola trasfusione di sangue, ovvero il reclutamento dei donatori e le caratteristiche per renderli tali, accennando a quelli che sono i gruppi sanguigni canini e l’importanza dei test per tipizzarli e valutarne la reale compatibilità.
Successivamente, si descriverà la donazione, analizzando quali siano le modalità di prelievo, di raccolta e di etichettatura, per poi descrivere i diversi prodotti sanguigni che si possono ottenere dal sangue intero donato. La struttura veterinaria in seguito alla donazione sarà in possesso di prodotti sanguigni importantissimi nel trattamento di differenti malattie e/o patologie e tramite la trasfusione potranno somministrali. Saranno descritti, perciò, le modalità di somministrazione e i dosaggi.
Nonostante le misure di sicurezza adottate nella manipolazione dei prodotti sanguigni, in qualche paziente le trasfusioni possono sviluppare reazioni acute o ritardate, è per questo che un capitolo sarà dedicato alla descrizione di quest’ultime, includendo i trattamenti. Il monitoraggio della trasfusione è strettamente legato alle reazioni trasfusionali ed è, quindi, indispensabile per intervenire immediatamente sul soggetto trasfuso. La parte generale si conclude ricordando che, sia i segni clinici, sia i risultati di laboratorio, aiutano il clinico nella scelta di trasfondere o meno, ma che non esistono ancora regole fisse o valori indicativi (come l’Hct, l’MVC, l’MCHC, o la conta reticolocitaria) che permettano di scegliere non arbitrariamente per la trasfusione. È per questo che nella parte sperimentale saranno analizzate tutte le trasfusioni eritrocitarie di 86 cani avvenute nel Centro Ospedaliero Universitario Veterinario della facoltà di Medicina Veterinaria di Montréal, così da poter valutare, specificatamente al contesto da cui sono stati presi i dati, se si possano definire dei valori fissi che indichino il momento di trasfondere, una prima ed eventualmente una seconda volta.
11
4) Il cane donatore
4.1 Caratteristiche del donatore
I donatori di sangue possono essere donatori abituali o occasionali e possono essere reclutati in vari modi dalla struttura veterinaria trasfusionale o dalla banca veterinaria del sangue.
La “Linea guida relativa all’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario” disciplina le caratteristiche che deve possedere un donatore di sangue per essere considerato “idoneo”; la donazione di sangue non deve provocare, nel donatore, stress, sofferenze o danni duraturi. Occorre, inoltre, valutare le condizioni generali di salute dell’animale mediante anamnesi e visita clinica completa, con particolare attenzione agli stati di debilitazione, iponutrizione, edemi, anemia, ittero, cianosi, dispnea e lesioni cutanee1. Il proprietario dell’animale, o il detentore dello stesso, che ne abbia facoltà giuridica deve sottoscrivere un modulo in cui dichiara lo stato di salute dell’animale per accettarne l’idoneità alla donazione1; tale modulo è presente nell’allegato 7 della Linea guida.
La creazione di un gruppo di donatori abituali è consigliata, in quanto consente di: • monitorare la salute ed il benessere del donatore;
• attuare la donazione periodicamente;
• effettuare gli accertamenti clinici pre-donazione2.
Il donatore di sangue deve essere un cane di proprietà, di indole docile, in buona salute e sottoposto a periodici controlli veterinari. Inoltre deve soddisfare le seguenti condizioni1, 3, 16, 23, 24:
• età: 2-8anni. • Peso ≥25 kg.
• Stato vaccinale o copertura immunitaria noti (Cimurro, Leptospirosi canicolae icteroemorragica, Epatite infettiva CAV1, Parvovirosi, Rabbia).
• Nelle regioni in cui il regolamento di Polizia Veterinaria prevede la vaccinazione contro la Rabbia, il soggetto donatore deve essere immunizzato anche contro questa malattia. • Essere sottoposto alla profilassi per la Filariosi cardio-polmonare23.
• Regolari trattamenti e/o profilassi nei confronti di endo ed ecto-parassiti ed utilizzo di presidi repellenti contro artropodi vettori di agenti infettivi (pulci, zecche, flebotomi, zanzare)1.
• Screening delle malattie infettive (eseguiti una volta l’anno): esame sierologico per
Dirofilaria immitis, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocituphilum, (Rickettisia conorii) Leihsmania infantum, PCR per Babesia spp e Leshsmania infantum16.
12 • Contrariamente a ciò che è spesso stato riportato nella letteratura veterinaria, la gravidanza non sensibilizza le cagne agli antigeni eritrocitari (Blais et al. JVIM 2007)2; un altro studio ha accertato che le cagne, addirittura dopo la gravidanza, non sviluppano alloanticorpi contro gli antigeni dei RBC (red blood cells) durante la gestazione, così possono essere usate come donatrici33.
• I donatori non dovrebbero essere mai stati trasfusi per il rischio di formazione di anticorpi che possono determinare reazioni di incompatibilità di tipo “minor”3.
• Dal donatore deve essere possibile prelevare 15-20% del volume ematico corporeo ogni 3 mesi, non superando i 18 ml/kg.
• Vena giugulare accessibile.
• Secondo la definizione più restrittiva il cane donatore universale dovrebbe essere DEA 1.1, 1.2, DEA 3, DEA 5, DEA 7 negativo e DEA 4 positivo (è difficile trovare soggetti DEA 4 negativi dato che rappresentano solo il 2% della popolazione canina), tuttavia, un cane DEA 1 positivo può donare ad un ricevente DEA 1 positivo16,24.
4.2 Fase di arruolamento
In fase di arruolamento iniziale del donatore è indispensabile:
• condurre un’accurata indagine clinica (completa delle informazioni anamnestiche e ambientali);
• predisporre una cartella clinica che riporti tutte le indagini cliniche e di laboratorio eseguite;
13
Indagini Analisi
Gruppo sanguigno DEA 1
Profili emocromocitometrico RBC, Hgb, Hct, MVC, MCH, MCHC,
RDW, WBC, formula leucocitaria, PLT. Lettura dello striscio da parte di un
veterinario esperto, anche per individuare la presenza di emoparassiti.
Profilo biochimico Profilo epato-renale, proteico con
elettroforesi, sideremico, elettrolitico e almeno una proteina della fase acuta (ad esempio proteina C reattiva).
Profilo coagulativo PT, a PTT, fibrinogeno
Profilo urinario Chimico fisico e sedimento
Malattie infettive Leishmania infantum(sierologica
quantitativa)*
Ehrilichia canis (sierologia quantitativa)** Babesia spp. (PCR)*
Anaplasma spp. (sierologia quantitativa)*
Parassitologico Coprologico per flottazione
Ricerca antigeni Dirofilaria immitis e microfilarie nel sangue periferico per arricchimento
Tabella 1: analisi consigliate in fase di arruolamento dei donatori e con cadenza annuale1
*dimostrata nel cane la trasmissione tramite trasfusione di sangue **trasmissione dimostrata nel cane solo in condizioni sperimentali
Le indagini di laboratorio consigliate in tabella 1 si devono intendere come indagini minime, che andrebbero integrate in base all’anamnesi ambientale e di razza.
Le indagini eseguite al momento dell’arruolamento devono essere ripetute almeno una volta all’anno, salvo il manifestarsi di condizioni cliniche che rendano consigliabili ulteriori indagini diagnostiche.
In condizioni di endemia per malattie trasmesse da vettori risulta inapplicabile nella pratica uno standard che preveda la negatività sierologica dei candidati donatori, considerando che la maggior parte dei cani sieropositivi, clinicamente sani, non presenta patogeni circolanti. Le indicazioni riportate in tabella 2 sono il risultato del consenso degli esperti di un gruppo di studio, allo stato attuale delle conoscenze1.
14
Agente infettivo Screening
Sierologia/PCR Giudizio donatore
Leishmania infantum IFAT<1:160, o titolo ELISA corrispondente
IFAT ≥1:160, o titolo ELISA corrispondente
Negativo
ESCLUSIONE temporanea
Riferirsi alle linee guida esistenti per un corretto inquadramento di questi soggetti
ESCLUSIONE permanente
IDONEO
Babesia Canis Positivo Negativo
ESCLUSIONE permanente IDONEO
Ehrlichia canis IFAT≤1:80, o titolo ELISA
corrispondente
IFAT >1:80, o titolo ELISA corrispondente Negativo ESCLUSIONE temporanea Rivalutazione e indagini di approfondimento (sieroconversione e PCR) ESCLUSIONE permanente IDONEO Anaplasma spp Positivo Negativo IDONEO Se negativo alla PCR IDONEO
Tabella 2: Indicazioni suggerite per la gestione dei donatori, in funzione dell’agente patogeno e
dell’esito analitico53.
La malattia di Lyme (B.burgdorferi) e la dirofilariosi non sono trasmesse con la trasfusione sanguigna, ma si consiglia di fare almeno dei test rapidi. Se il donatore è un riproduttore attivo dovrebbe essere testato per la brucellosi. Infine, i levrieri dovrebbero essere testati per Babesia
canis e i Pitt bull per Babesia gibsoni data la forte prevalenza di queste malattie infettive in
15
4.3 Analisi e donazioni
Nell’allegato 2 della Linea guida, sono indicati gli esami di laboratorio da eseguire ad ogni donazione di sangue; il pannello degli esami richiesti è differente in relazione all’utilizzo della sacca di sangue.
È obbligatorio conservare alla temperatura di -8/-10°C un’aliquota di 1ml di siero/plasma ed un’aliquota di sangue intero in EDTA per ciascuna unità di sangue prodotta, al fine di ripetere le analisi in caso di sospetta trasmissione di malattie infettive al soggetto ricevente1, 25.
Nel caso di sangue intero di pronto impiego o d’emergenza (preparato all’interno della struttura veterinaria e utilizzato all’interno della stessa, non cedibile ad altre strutture), il pannello degli esami da seguire è il seguente1:
Gruppo sanguigno DEA 1.1 (solo alla prima donazione)
Emocromo n° RBC e morfologia, Hct, MCV, MCH, RDW
n° WBC e morfologia, formula leucocitaria n° PLT e morfologia
Proteine plasmatiche totali
Ricerca microscopica per Babesia spp, nel buffy coat (in alternativa o unitamente all’indagine IFAT o PCR per
Babesia canis)
Sierologico Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Babesia canis,
Anaplasma phagocytophilum, Dirofilaria immitis
Tabella 3 – Esami richiesti per il cane donatore in caso di sangue intero di pronto impiego o
d’emergenza. Tabella tratta da “Linea guida all’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario”.
16 Nel caso di sangue intero reperibile in commercio, gli esami da eseguire nel cane sono i seguenti:
Gruppo sanguigno DEA 1.1 (da eseguire solo alla prima
donazione)
Emocromo n° RBC e morfologia, Hgb, Hct, MCV,
MCH, MCHC, RDW
n° WBC e morfologia, formula leucocitaria n° PLT e morfologia
Proteine plasmatiche totali ricerca microscopica per emoparassiti nel buffy coat (in alternativa o unitamente all’indagine IFAT o PCR per Babesia
canis)
Biochimico Proteine plasmatiche totali, albumina, urea,
creatinina, ALT, ALP
Profilo coagulativo PT, aPTT, Fibrinogeno
Sierologico Leishmania infantum, Ehrlichia canis,
Babesia canis, Anaplasma phagocytophilum, Dirofilaria immitis
Urine Esame chimico, fisico e del sedimento
Malattie parassitarie Esame coprologico, ricerca microfilaria nel
sangue periferico
Tabella 4 – Esami richiesti per il cane donatore in caso di sangue intero reperibile in commercio. Tabella
tratta da “Linea guida all’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario”52.
Tutte le informazioni sullo stato di salute dell’animale, compresi i risultati degli esami di laboratorio, devono essere riportate nella cartella clinica dell’animale, che deve essere conservata fin quando lo stesso viene impiegato come donatore. Le indagini sierologiche volte a identificare gli agenti infettivi trasmissibili per via ematica possono essere sostituite o affiancate da indagini di biologia molecolare (PCR: Polymeras Chain Reaction)1. Per quanto riguarda la ricerca di Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Anaplasma phagocytophilum e
Dirofilaria immitis è possibile impiegare test rapidi di tipo ambulatoriale, in alternativa
17 L’esame per la ricerca di Dirofilaria immitis può non essere eseguito se l’animale è sotto regolare trattamento profilattico (dichiarato dal proprietario/detentore dell’animale in autocertificazione)1.
4.4 Criteri di esclusione permanente e temporanea della donazione
1. Animale affetto o precedentemente affetto da: malattie autoimmuni o immunomediate, malattie cardiovascolari, malattie del sistema nervoso centrale e periferico, neoplasie maligne, crisi convulsive, tendenza anomala all’emorragia, endocrinopatie, epilessia, glomerulonefrite cronica e pielonefrite, policitemia vera→ ESCLUSIONE PERMANENTE1;
2. Per Leishmania infantum, Ehrlichia canis, Babesia canis→ animale con titoli anticorpali >1:80 e/o indagini PCR positive e/o presenza di sintomatologia clinica→ ESCLUSIONE
PERMANENTE (G.U. n.25,2016);
3. Se l’animale è affetto o è stato affetto in modo grave/ cronico da malattia gastrointestinale, renale, ematologica o respiratoria→ il medico veterinario può avvalersi di una visita specialistica prima di esprimere l’eventuale inidoneità temporanea o permanente1;
4. Anaplasmosi, borreliosi, brucellosi → ESCLUSIONE TEMPORANEA fino a guarigione clinica in presenza di titoli sierologici negativi e PCR negativa1;
5. Gravidanza in atto → ESCLUSIONE TEMPORANEA;
6. Altri motivi (ai fini della protezione della salute del donatore) → ESCLUSIONE
TEMPORANEA (la durata del periodo di rinvio è stabilita dal medico veterinario)1;
7. Trasfusione di sangue o trattamento con farmaci emoderivati, allergia ai farmaci →
ESCLUSIONE TEMPORANEA (rinvio di 6 mesi)1;
8. Somministrazione di sieri di origine animale → ESCLUSIONE TEMPORANEA (rinvio
di 3 mesi)1;
9. Somministrazione di vaccini costituiti da virus o batteri vivi attenuati → ESCLUSIONE
TEMPORANEA (rinvio di 3 settimane) 1;
10. Somministrazione di vaccini costituiti da virus o batteri uccisi o inattivati o da tossoidi; assunzione di farmaci → ESCLUSIONE TEMPORANEA (rinvio per 48 ore)1;
11. Altri motivi (ai fini della protezione della salute del ricevente) → ESCLUSIONE
18
5) I differenti gruppi sanguigni
I gruppi sanguigni sono definiti da antigeni ereditari presenti sulla superficie degli eritrociti. Essi sono importanti nella medicina trasfusionale a causa del rischio di reazioni emolitiche. Tali reazioni avvengono quando è presente un anticorpo diretto contro un antigene di gruppo sanguigno. La gravità della reazione emolitica dipende da vari fattori. Vi sono due punti chiave: in primo luogo, per un dato tipo di anticorpo, generalmente la reazione è più grave quando il titolo è più elevato; in secondo luogo, le reazioni mediate da IgM tendono ad essere più gravi delle reazioni mediate da IgG, a causa della maggiore fissazione del complemento da parte delle IgM. Una reazione trasfusionale emolitica può avvenire sotto forma di crisi intravascolare acuta, in relazione all’attivazione del complemento da parte delle IgM o da titoli elevati di IgG, oppure come evento emolitico extravascolare ritardato in funzione del legame delle IgG sugli eritrociti3.
I gruppi sanguigni del cane sono stati riconosciuti e sono stati identificati con la terminologia Dog Erythrocyte Antigen (DEA). Il sistema DEA comprende 7 gruppi di sangue ben conosciuti (DEA 1, 3, 4, 6, 7 e 8) con più di 20 specifici antigeni4,27.
Sono stati riportati altri antigeni non standardizzati all’interno del DEA come il gruppo Dal4, 28,
il più recente descritto Kai 1 e 2.
5.1 Gli antigeni
Per ogni gruppo sanguigno, un cane può essere positivo o negativo. Per esempio, un cane può essere DEA 4 positivo o DEA 4 negativo. Fino a poco tempo fa, il DEA 1 sembrava fare eccezione a questa regola con i sottotipi DEA 1.1 e DEA 1.2 (vedere anche DEA 1.3). Ma utilizzando tecniche d’immunocromatografia e di citometria di flusso, Acierno et al. (JVIM
2014) hanno, recentemente, dedotto che si tratta piuttosto di un continuo dell’espressione
dell’antigene DEA 1, visto che i “sottotipi” erano riconosciuti dagli stessi anticorpi monoclonali. In altre parole, i cani detti DEA 1.2 esprimerebbero meno l’antigene DEA 12. Non esistono alloanticorpi naturali contro DEA 1.1 pertanto questo antigene non determinerà una reazione acuta nel ricevente nel corso della prima trasfusione. Comunque, se un cane DEA 1.1 negativo riceve una trasfusione da un cane DEA 1.1 positivo, la formazione di anticorpi anti-DEA 1.1 (sensibilizzazione) causerà un’emolisi ritardata entro 1-2 settimane. Gli alloanticorpi appariranno entro 4-14 giorni29, 30 in seguito alla prima trasfusione;
La sensibilizzazione del destinatario e la produzione di alloanticorpi può dare luogo ad una reazione emolitica trasfusionale acuta e alla morte se una seconda sacca di RBC (red blood cell)
19 DEA 1 positivo viene somministrata allo stesso paziente31, 32 e la comparsa di una reazione emolitica trasfusionale acuta comporterà anche la distruzione di tutti gli eritrociti trasfusi entro 12 ore.
Un cane negativo sia per DEA 1.1, sensibilizzato contro RBC (red blood cell) di tipo DEA 1.1 positivo, può presentare una reazione emolitica ritardata quando vengono trasfusi RBC di tipo 1.1 positivo3. Questa è la ragione per cui si raccomanda sempre di effettuare le prove crociate quando il ricevente sia stato precedentemente trasfuso (vedi in seguito prove di compatibilità)3. Il rischio di produzione di alloanticorpi e reazioni trasfusionali contro gli antigeni diversi da DEA 1 non è ancora ben definita34 e, inoltre, non è documentata una reazione emolitica
clinicamente evidente causata da DEA 1.2, 3, 5 e 7 in trasfusioni mal gestite18.
Il gruppo DEA 1 nei cani è stato studiato principalmente per scopi trasfusionali. Le reazioni trasfusionali di solito non avvengono dopo la prima trasfusione poiché la presenza di anticorpi naturali contro DEA 1 è difficilmente riscontrabile nei cani (0.3% in una popolazione di 2,500 cani esaminati da Hale e Werfelmann)35, a meno che siano stati sensibilizzati prima da una
trasfusione incompatibile.
Gli anticorpi naturali che si formano contro l’antigene DEA 1 sugli eritrociti del cane non sono mai stati realmente identificati29. D’altra parte gli anticorpi naturali contro DEA 3, 5 e 7 sono stati documentati rispettivamente con una prevalenza del 6%, 23% e 45%26
Tuttavia, la prevalenza di alloanticorpi contro gli antigeni del gruppo sanguigno nei cani è piuttosto rara e gli unici alloanticorpi costantemente riscontrati sono contro l’antigene DEA 7 (circa 10% in 2,500 cani testati), inoltre l’evidenza di reazioni trasfusionali o isoeritrolisi neonatale non è ancora stata documentata32, 33, 35.
Comunque, anche se gli antigeni di ogni gruppo sanguigno possono stimolare la formazione di alloanticorpi, il DEA 1 sembra essere il più immunogenico ed è considerato clinicamente importante.
Non è nota l’incidenza di tali reazioni trasfusionali, ma probabilmente è abbastanza ridotta. Poiché molti cani sono positivi al DEA 4 e gli anticorpi anti-DEA 4 non provocano emolisi, questo gruppo sanguigno riveste un’importanza minima nelle trasfusioni3, 24.
Dunque, il cosiddetto donatore universale è generalmente accettato come negativo per i gruppi DEA 1, 3, 5 e 7 ma positivo solo a DEA 424.
Un nuovo gruppo sanguigno nominato Dal è stato riconosciuto nei cani in seguito alla sensibilizzazione di un paziente Dalmata anemico (Blais et al., JVIM 2007)4, 28. In questo studio
iniziale, la prevalenza del gruppo sanguigno Dal era del 100% (55/55) in cani non Dalmata e 81% nei dalmata (20/26). L’alta prevalenza del gruppo sanguigno Dal genera certi problemi:
20 - I cani Dal-negativi saranno sensibilizzati al momento di una prima trasfusione
sanguigna con RBC Dal positivi e produrranno degli anticorpi anti-Dal.
- Se delle trasfusioni sanguigne saranno necessarie in questi pazienti, del sangue compatibile Dal-negativo potrebbe essere difficili da trovare2-5.
Recentemente, due casi d’incompatibilità sanguigna al Dal sono stati osservati nel Dobermann. Secondo dei dati preliminari, 37.4% (116/310) dei Dobermann testati all’Università di Montréal e all’Università di Guelph sono risultati Dal-negativi. Per contro, nessun donatore di sangue
Dal-negativo è stato identificato, ad eccezione di cinque Dobermann (Goulet S et al., abstract ACVIM (American College of Veterinary Internal Medicine2014)2.
Ultimamente, è stata messo in evidenza la presenza di nuovi antigeni eritrocitari, chiamati Kai 1 e Kai 2, tipizzati mediante eritrosedimentazione su colonna di gel, con anticorpo monoclonale. Molti cani risultano essere Kai 1 positivi e soltanto pochi Kai 2 positivi; il profilo antigenico più frequente risulta Kai 1+ e Kai 2- 5.
Riassumendo, è noto che il gruppo DEA 1 è il più antigenico, dunque conseguentemente il più significativo clinicamente, perché, come precedentemente detto, i cani non posseggono degli alloanticorpi preformati di importanza clinica2.
Ma di contro, se il cane riceve una trasfusione con dei globuli rossi positivi per un determinato gruppo sanguigno che esso non possiede, quest’ultimo sarà sensibilizzato. Questa sensibilizzazione porterà ad una produzione di alloanticorpi diretti contro questo gruppo sanguigno particolare. Questi alloanticorpi possono essere responsabili di reazioni trasfusionali emolitiche2, 36.
La tabella 3 riassume, per ogni gruppo sanguigno, la presenza di anticorpi naturali e le principali reazioni trasfusionali che si possono presentare in animali negativi per quel gruppo (precedentemente sensibilizzati con l’antigene), trasfusi con sangue contenente l’antigene eritrocitario.
21
Gruppo sanguigno Anticorpi naturali Reazioni trasfusionali (in
animali precedentemente
sensibilizzati con l’antigene)
DEA 1 Non segnalati Reazione dei globuli rossi
entro 12-24 ore
DEA 3 Segnalati Perdita dei globuli rossi
trasfusi entro 5 giorni (un caso)
DEA 4 Non segnalati C’è produzione di anticorpi,
ma non si verifica emolisi. È stata riportata una reazione emolitica dopo ripetute trasfusioni di sangue DEA 4 positivo in cane DEA 4 negativo
DEA 5 Segnalati Sequestro dei globuli rossi
trasfusi (un caso)
DEA 6 Non documentati Rapida rimozione dei globuli
rossi trasfusi (un caso)
DEA 7 Segnalati Sequestro e perdita dei
globuli rossi entro 72 ore.
Dal Non documentati Reazione emolitica dei
globuli rossi, dopo la seconda trasfusione54
Kai Non segnalati L’importanza clinica nella
trasfusione canina deve essere ancora determianta54
Tabella 5 – Gruppo sanguigno, presenza di anticorpi naturali e principali reazioni trasfusionali (Carli,
22
5.2 Studi di prevalenza dei gruppi sanguigni
La conoscenza delle differenze di razza per la prevalenza di DEA 1 è molto importante per il reclutamento di donatori di sangue. Per quanto riguarda la diffusione dei gruppi sanguigni nel cane, può essere così sintetizzata:
DEA Prevalenza
1 40%
3 Frequente nelle razze orientali
4 98%
5 25%
7 50%
Tabella 6 – Prevalenza dei gruppi sanguigni DEA nel cane (GRUPPI SANGUIGNI NEL CANE PISA
2015. AIMVET-medicina trasfusionale veterinaria).
Tuttavia, gli studi di prevalenza sono, a volte, contrastanti in quanto sono influenzati, oltre che dall’area geografica, dalla linea di sangue presa in considerazione. Come è dimostrato nello studio del 2016 di più di 7000 cani “Prevalence of Dog Erythrocyte Antigen 1 in 7,414 dogs in Italy” che ha riscontrato una prevalenza di DEA 1 del 61.2%37.
La prevalenza dell’antigene DEA 1.1 della popolazione di cani Galgos (Spanish Greyhounds) è risultata essere del 51,7%, quella delle altre razze 55,7%6.
Un altro studio del 2015 ha verificato la prevalenza degli antigeni eritrocitari DEA 1, 4 e 7 in 205 cani Galgos. Il risultato è stato che il 54,6% dei cani era DEA 1 positivo; dei 150 campioni testati, il 100% era DEA 4 positivo e il 7% era anche DEA 7 positivo7.
-Uno studio, condotto in Svizzera nel 2011, ha testato 304 cani per l’antigene DEA 1.1 tramite tecnica dell’agglutinazione su colonna di gel (ID-Gel Test Canine DEA 1.1, DiaMed): il 53% dei cani totali risultava DEA1.1 positivo; tra i cani meticci il 49% è risultato DEA1.1 positivo8. -É stato evidenziato che la frequenza dell’antigene eritrocitario DEA 1.1 nei Greyhound (Levieri) era del 13,1%, significativamente più bassa rispetto a quella dei cani non-Greyhound (60,6%)9.
-In uno studio del 2002 in Sud Africa (Ondersteeport, Pretoria) sulla prevalenza del DEA 1.1 sulle razze canine è emerso che la prevalenza totale dell’antigene DEA 1.1 era del 47%; la prevalenza del DEA 1.1 sui cani di razza Boxer e Pastore Tedesco era <20%, mentre sui cani di razza Rottweiler, Alano, San Bernardo e Dalmata era >75%10.
-In uno studio del 2011 su 274 cani Portoghesi, il 56,9% di questi è risultato DEA 1.1 positivo; tra questi cani, tutti i Boxer, i Pastori Tedeschi e i Doberman sono risultati DEA1.1 negativi; tutti i San Bernardo DEA 1.1 positivi, l’88,9% dei Golden Retriever, l’88,2% dei Rottweiler, il
23 61,4% dei cani meticci sono risultati DEA 1,1 positivi, mentre 68.8% nel Cocker Spaniel Inglese Dea 1.1 negativo 11.
-Nel 2016 è stato effettuato uno dei più estesi studi, fatto fino ad ora, sulla prevalenza del gruppo sanguigno DEA 1 in Italia37:
Sono stati testati un totale di 7,414 cani (di razza 4,798 – meticci 2,616) che sono stati scelti da professionisti privati, i quali hanno poi registrato i dati sul database del DbD (Dog Blood Donors) website in Italia.
In questo studio è riportata un’alta prevalenza del gruppo DEA 1 positivo in razze come il Rottweiler (89.5%), Golden Retriever (75.2%) e Bassotto (74.2%)37.
Questi risultati sono compatibili con altri studi precedenti; 78-100% in Rottweiler 77-95% in Golden retriever e 71-100% nel Bassotto10,11,14, 38,39.
Un’alta prevalenza per le razze come l’Ariegeois (95.7%), il Setter inglese (81%) e il Pinscher (80%) è stato confermato secondo lo studio precedente eseguito in Italia14.
In questo studio, il Labrador Retriever ha mostrato un’alta prevalenza del DEA 1 positivo (65.3%) come riportato in studi eseguiti in Svizzera, Africa meridionale e Italia10,14,39.
Nello studio pubblicato in Portogallo, Labrador Retriever hanno mostrato un’alta prevalenza per DEA 1 negativo (55%), anche se questi risultati potrebbero essere riferiti ad un numero esiguo di cani (n. 29)11 rispetto a questo studio (n.478)37.
La prevalenza di DEA 1 positivo nel Cocker Spaniel Inglese è 65.2%, nel Barboncino (68.8%) e nello Yorkshire Terrier 63%. Questi valori sono diversi da quelli trovati in altri paesi come la Svizzera che ha riportato un’alta prevalenza di DEA 1 negativo (67%) nel Barboncino e il Portogallo che ha riportato il 68.8% di Dea 1 negativo nel Cocker Spaniel Inglese11,39.
Un’alta prevalenza del DEA 1 positivo è stato osservato in razze come l’Epagneul Breton (77.1%), il Carlino (77%), Springer Spaniel inglese (74.1%) e il Chihuahua (61%). Questi risultati, però, non possono essere comparati per l’assenza di studi precedenti (tabella 7). Sempre in questo studio, le razze con prevalenza più alta del DEA 1 negativo erano il Pastore Tedesco (81.1%), il Boxer (83.0%), il Bulldog francese (77.9%) e il West Highland White Terrier (63%) (tabella 7).
Un’elevata prevalenza del DEA 1 negativo nel Pastore tedesco era simile a quella riscontrata in precedenza in altri paesi come il Sud Africa (84%)10, il Portogallo (100%)18, Brasile e Italia
(entrambi 90%)14,38.
Pressoché la stessa situazione fu osservata nel Boxer e anche nel Sud Africa (88%)10, Portogallo
24 È noto che, la frequenza del DEA 1 negativo nel Bulldog francese (77.9%) e nel West Highland White Terrier (63%) non è mai stata riportata prima.
Un’alta prevalenza di DEA 1 negativo lo si potrebbe aspettare dall’accoppiamento tra maschio e femmina che abbiano la stessa linea di sangue, ma non si sa se questi cani esaminati fossero il risultato di consanguineità o di linee incrociate.
Un recente studio ha dimostrato che l’accoppiamento tra cani DEA 1 negativo ha portato ad una progenie DEA 1 negativa, mentre accoppiandosi con cani DEA 1 positivi ha dato luogo primariamente ad una progenie DEA 1 positiva, mentre accoppiandosi con cani DEA 1 positivi ha dato luogo principalmente ad una progenie DEA 1 positiva40. In questo studio37, molte razze
come il Jack Russel Terrier, il Beagle, il Border Collie e il Maltese mostravano una prevalenza quasi uguale di soggetti DEA 1 negativi e positivi. D’altra parte, sempre in questo studio, il Cane Corso mostra esattamente il 50% per entrambi i soggetti DEA 1 negativi e positivi e questi risultati sono completamente diversi da quegli ottenuti in un altro studio eseguito in Italia (72% per DEA negativo)14. La prevalenza del DEA 1 negativo riportata in Sud Africa per lo
Staffordshire Terrier era del 75%10 quale differisce dalla prevalenza trovata nello studio corrente37.
Un’altra razza, la cui prevalenza differisce da quella trovata in questo studio, è il Maltese che ha riportato il 33% di DEA 1 positivi in uno studio che ha seguito solamente 9 cani Maltese in Giappone41.La prevalenza trovata nel Cavalier King Charles Spaniel (48.5% DEA 1 positivo e 51.5% DEA 1 negativo) non può essere comparata con alcun studio precedente (tabella 7).
25
Razze Cani analizzati DEA 1 neg DEA 1 pos
N° N° (%) N° (%)
Meticci 2,616 924 (35.3) 1,692 (64.7)
Labrador Retriever 478 166 (34.7) 312 (65.3)
Pastore Tedesco 312 253 (81.1) 59 (18.9)
Golden Retriever 214 53 (24.8) 161 (75.2)
Jack Russell Terrier 213 100 (46.9) 113 (53.1)
Pinscher 194 62 (32.0) 132 (68.0) Chihuahua 164 100 (61.0) 100 (61.0) Cocker Spaniel inglese 158 55 (34.8) 103 (65.2) American Staffordshire Terrier 153 72 (53.1) 81 (46.9) Bassotto 149 35 (25.8) 114 (74.2) Barboncino 144 45 (31.3) 99 (68.8) Maltese 130 59 (45.4) 71 (54.6) Setter inglese 126 24 (19.0) 102 (81.0) Border Collie 124 66 (53.2) 58 (46.8) Beagle 123 61 (49.6) 62 (50.4) Yorkshire Terrier 108 40 (37.0) 68 (63.0) Boxer 106 88 (83.0) 18 (17.0) Cavalier King Charles Spaniel 103 53 (51.5) 50 (48.5) Ariegeois 92 4 (4.3) 88 (95.7) Bulldog francese 86 67 (77.9) 19 (22.1) Epagneul Breton 83 19 (22.9) 64 (77.1) Shih Tzu 79 22 (27.8) 57 (72.2) Cane Corso 76 38 (50.0) 38 (50.0) Carlino 61 14 (23.0) 47 (77.0) Rottweiler 57 6 (10.5) 51 (89.5) Springer Spaniel inglese 54 14 (25.9) 40 (74.1) West Highland White Terrier 54 34 (63.0) 20 (37.0) Altri* 1,159 440 (38.0) 719 (62.0) Totale 7,414 2,878 (38.8) 4,536 (61.2)
Tabella 7a: Prevalence of DEA 1 negative and positive in the breeds37. *Razze rappresentate da meno di 50 cani.
Non c’era una differenza evidente nella prevalenza di DEA 1 negativi e DEA 1 positivi fra maschi e femmine in questo studio, ad eccezione per le femmine di Boxer (13/18 Dea 1 positivi erano femmine), che rappresentavano il 72.2%.
Per il Cavalier King Charles Spaniel (35/50 DEA 1 positivi erano maschi) e per il West Highland hite Terrier (14/20 DEA 1 positivi erano maschi), entrambi rappresentavano il 70%. Gli Ariegeois femmine avevano una più alta prevalenza di DEA 1 negativi (100%) ma solo 4
26 femmine erano state testate (tabella 8). Potrebbe essere interessante conoscere se le cagne Ariegeois negative avevano ricevuto trasfusioni di sangue, così da essere state sensibilizzate37.
Razze
DEA 1 neg DEA 1 pos
Cani analizzati
Femmine Maschi Femmine Maschi
N° N° (%) N° (%) N° (%) N° (%) Meticci 2,616 475 (51.4) 449 (48.6) 895 (52.9) 797 (47.1) Labrador Retriever 478 80 (48.2) 86 (51.8)) 160 (51.3) 152 (48.7) Pastore tedesco 312 120 (47.4) 133 (52.6) 25 (42.4) 34 (57.6) Golden Retriever 214 33 (62.3)) 20 (37.7) 85 (52.8) 76 (47.2) Jack Russell Terrier 213 48 (41.0) 59 (59.0) 54 (47.8) 59 (52.2) Pinscher 194 28 (45.2) 34 (54.8) 66 (50.0) 66 (50.0) Chihuahua 164 32 (50.0) 32 (50.0) 46 (46.0) 54 (54.0) Cocker Spaniel inglese 158 28 (50.9) 27 (49.1)) 52 (50.5) 51 (49.5) American Staffordshire Terrier 153 37 (51.4) 35 (48.6) 37 (45.7) 44 (54.3) Bassotto 149 21 (60.0) 14 (40.0) 58 (50.9) 56 (49.1) Barboncino 144 22(48.9) 23 (51.1) 40 (40.4) 59 (59.6) Maltese 130 33 (55.9) 26 (44.1) 39 (54.9) 32 (45.1) Setter inglese 126 12 (50.0) 12 (50.0) 38 (37.3) 64 (62.7) Border Collie 124 37 (56.1) 29 (43.9) 32 (55.2) 26 (44.8) Beagle 123 30 (49.2) 31 (50.8) 25 (40.3) 37 (59.7) Yorkshire Terrier 108 20 (50.0) 20 (50.0) 36 (52.9) 32 (47.1) Boxer 106 40 (45.5) 48 (54.5) 13 (72.2) 5 (27.8) Cavalier King Charles 103 20 (37.7) 33 (62.3) 15 (30.0) 35 (70.0) Ariegeois 92 4 (100.0) 0 (0.0) 42 (47.7) 46 (52.3) Bulldog francese 86 29 (43.3) 38 (56.7) 8 (42.1) 11 (57.9) Epagneul Breton 83 13 (68.4) 6 (31.6) 26 (41.9) 38 (61.3) Shih Tzu 79 8 (36.4) 14 (63.6) 22 (38.6) 35 (61.4) Cane Corso 76 15 (39.5) 23 (60.5 22 (57.9) 16 (42.1) Carlino 61 6 (42.9) 8 (57.1) 19 (40.4) 28 (59.6) Rottweiler 57 3 (50.0) 3 (50.0) 28 (54.9) 23 (45.1) Springer Spaniel inglese 54 7 (50.0) 7 (50.0) 17 (42.5) 23 (57.5) West Highland White Terrier 54 16 (47.1) 18 (52.9) 6 (30.0) 14 (70.0) Altri* 1,159 219 (49.8) 221 (50.2) 353 (49.1) 366 (50.9) Totale 7,414 1,429 (19.3) 1,449 (19.5) 2,259 (30.5) 2,277 (30.7)
27 È importante sapere la frequenza del gruppo DEA 1 positivo nel Rottweiler e nel Golden Retriever, perché potrebbero essere arruolati come donatori di sangue, dato che il loro peso è nel range stabilito per le donazioni e sono generalmente cani docili37. Nella tabella 9 è possibile osservare la percentuale totale dei potenziali donatori di sangue nelle diverse razze e i numeri percentuale di chi tra questi è DEA negativo e chi DEA positivo.
Razze DEA 1 neg DEA 1 pos *PBD DEA neg DEA pos
N° N° (%) N° (%) N° (%) N° (%) N° (%) Labrador Retriever 478 166 (34.7) 312 (65.3) 264 105 (39.8) 159 (60.2) Pastore tedesco 312 253 (81.1) 59 (18.9) 171 145 (84.8) 26 (15.2) Golden Retriever 214 53 (24.8) 161 (75.2) 133 38 (28.6) 95 (71.4) American Staffordshire Terrier 153 72 (53.1) 81 (46.9) 58 24 (41.4) 34 (58.6) Boxer 106 88 (83.0) 18 (17.0) 66 56 (84.8) 10 (15.2) Ariegeois 92 4 (4.3) 88 (95.7) 5 1 (20.0) 4 (80.0) Cane Corso 76 38 (50.0) 38 (50.0) 27 17 (63.0) 10 (37.0) Rottweiler 57 6 (10.5) 51 (89.5) 32 3 (9.4) 29 (90.6) Bovaro del Bernese 44 8 (18.2) 36 (81.8) 33 7 (21.2) 26 (78.8) Dobermann 32 25 (78.1) 7 (21.9) 19 14 (73.7) 5 (26.3) Cane da ferma tedesco 30 7 (23.3) 23 (76.7) 4 2 (50.0) 2 (50.0) Australian Shepherd 29 9 (31.0) 20 (69.0) 3 0 (0.0) 3 (100.0) Husky siberiano 29 12 (41.4) 17 58.6) 4 2 (50.0) 2 (50.0) Cane da pastore maremmano 24 12 (50.0) 12 (50.0) 15 7 (46.7) 8 (53.3) Weimaraner 24 14 (58.3) 10 (41.7) 13 7 (53.8) 6 (46.2) Weimaraner Belgian Shepherd 23 12 (52.2) 11 (47.8) 3 2 (66.7) 1 (33.3) Pointer inglese 22 8 (36.4) 14 (63.6) 2 1 (50.0) 1 (50.0) Totale 1745 787 (45.1) 958 (54.9) 852 431 (50.6) 421 (49.4)
Tabella 9a: Numero dei potenziali donatori37.
28
5.3 Tipizzazione del gruppo sanguigno
In caso di trasfusione è indispensabile determinare il gruppo sanguigno, sia del donatore sia del ricevente, evitando così di sensibilizzare soggetti DEA 1 negativi.
Nel cane, di routine, si determina solamente se è DEA 1 positivo o DEA 1 negativo, perché è il gruppo con più elevato potere immunogeno e perché sono presenti kit commerciali.
I kit rapidi che consentono di determinare il gruppo sanguigno DEA 1 utilizzano metodi basati su emoagglutinazione o di immunocromatografia. Questi test hanno il vantaggio di essere facili da utilizzare e di non richiedere attrezzature specifiche. In entrambi i test la reazione può dimostrare diversi gradi di intensità. Talvolta, le reazioni di emoagglutinazione possono dare adito a dubbi interpretativi (Seth et al., 2012). In questi casi è utile confermare il risultato utilizzando un metodo alternativo o rivolgendosi ad un laboratorio esterno53, 36.
Una corretta tipizzazione del sangue rappresenta il primo passo fondamentale per evitare di pregiudicare il buon esito di una terapia trasfusionale e limitare l’insorgenza di reazioni avverse. Definire il gruppo sanguigno del paziente prima di una trasfusione e realizzare una trasfusione tra soggetti di gruppo sanguigno compatibile consente di evitare l’insorgenza di una reazione emolitica data dalla presenza di anticorpi verso quel determinato antigene di gruppo sanguigno. I test di comune impiego ambulatoriale testano solo la positività o meno all’antigene DEA1 e utilizzano anticorpi monoclonali di origine murina per l’identificazione di questo gruppo. La tipizzazione dei gruppi DEA3, 4, 5, 7 e Dal risulta attualmente ipotetica e la sua esecuzione è limitata a pochi centri di ricerca a causa della limitata disponibilità degli antisieri e della difficoltà legate alla realizzazione e talvolta interpretazione delle metodiche disponibili. Idealmente il cane donatore di sangue ideale dovrebbe essere negativo per DEA 1, 3, 5, 7. Esistono diverse metodiche per la determinazione del gruppo sanguigno nel cane che si basano su una reazione di emoagglutinazione che avviene in seguito a incubazione e contatto dei globuli rossi con anticorpi monoclonali o policlonali. Utilizzando questi anticorpi, l’agglutinazione rileva la presenza degli antigeni eritrocitari testati e il cane viene così considerato positivo per quell’antigene. La mancanza di emoagglutinazione indica che il cane è negativo per l’antigene testato. Le varie metodiche in uso differiscono tra loro per l’accuratezza, il costo e il tempo di esecuzione; inoltre alcune di esse rappresentano tecniche realizzabili solo in laboratori specializzati. Talvolta delle alterazioni patologiche dei globuli rossi possono interferire con i test per la determinazione dei gruppi sanguigni e renderne difficile l’interpretazione.
29
Autoagglutinazione: talvolta i pazienti che devono essere trasfusi possono presentare
fenomeni di autoagglutinazione dei globuli rossi. Poiché i metodi di tipizzazione si basano su reazioni di agglutinazione, l’autoagglutinazione degli eritrociti canini del campione da testare interferisce con il risultato del test. In questo caso, prima di procedere al test i globuli rossi devono essere lavati con soluzione salina e se l’autoagglutinazione persiste nonostante il lavaggio degli eritrociti, la tipizzazione può essere ripetuta.
Anemia: la tipizzazione di pazienti affetti da grave anemia può essere complicata dalla
concentrazione relativamente bassa di antigeni eritrocitari che rischiano di non essere rilevati dal test. In questo caso si può provare a concentrare gli eritrociti tramite centrifugazione del campione e risospensione in una quota minore di plasma e ripetere il test.
Recente trasfusione: potrebbe essere difficoltoso determinare il gruppo sanguigno di un cane
sottoposto recentemente a trasfusione. Infatti il test potrebbe individuare gli antigeni eritrocitari del donatore, impedendo la corretta tipizzazione del gruppo sanguigno del ricevente. Quando non è possibile determinare il gruppo sanguigno di un paziente prima di una trasfusione di emergenza, è necessario almeno prelevare un campione di sangue intero per permetterne successivamente la tipizzazione corretta. Di seguito vengono descritti i test rapidi ad uso ambulatoriale attualmente disponibili per la determinazione del gruppo DEA1 e le altre metodiche destinate ai centri specializzati in grado di determinare anche i gruppi DEA4 e DEA721.
TEST DI AGGLUTINAZIONE SU CARTINA (RapidVet-H, Agrolabo, Italia) È stato il
primo test disponibile per la determinazione rapida del gruppo sanguigno DEA1.1 nel cane, in commercio dal 1995. Si basa sulla reazione di poche gocce di sangue da testare con anticorpi monoclonali liofilizzati sulla cartina. La comparsa di agglutinazione tra antigene e anticorpo identifica un campione di gruppo DEA1.1 positivo. Questa metodica si è dimostrata sensibile nell’identificazione del gruppo DEA1.1, ed è di facile e veloce realizzazione. I limiti sono una certa soggettività nell’interpretazione dei risultati e la necessità del lavaggio degli eritrociti nei campioni caratterizzati da autoagglutinazione per eliminare i risultati falsi positivi. Questa metodica ha mostrato talvolta risultati discordanti con altre tecniche21, 36.
METODO IMMUNOCROMATOGRAFICO RAPIDO (Lab/Quick Test DEA 1, Alvedia)
Si tratta di un test rapido per la determinazione del gruppo sanguigno DEA1 disponibile in commercio dal 2010. Esiste una versione denominata “QuickTest” adatta per uso ambulatoriale, nella quale viene fornito tutto il materiale necessario per svolgere il test e una versione denominata “LabTest”, più utilizzata in laboratori, nella quale vengono forniti solo strisce
30 reattive e reagenti, ma non il materiale d’uso quale piastra microtiter o provette dove mettere i reagenti e pipette per raccogliere il campione di sangue necessario per l’esecuzione del test. I risultati sono leggibili in un lasso di tempo da 2 a 5 minuti. Esiste una linea di controllo che deve sempre comparire per avere la conferma che il test è stato eseguito correttamente e i globuli rossi sono migrati lungo la striscia reattiva e una linea per la determinazione del gruppo sanguigno a livello della quale ci sono anticorpi monoclonali anti-DEA 1. Questa metodica si è dimostrata sensibile e specifica nella determinazione del gruppo DEA1 del cane, di facile esecuzione e interpretazione e in grado di dare risultati in tempi rapidi. Sono ancora limitati i dati sulle sue performances in campioni problematici come quelli di cani affetti da anemia emolitica immunomediata (IMHA), nei quali talvolta ha dato risultati discordanti rispetto alla tecnica di agglutinazione su gel15.
TEST DI AGGLUTINAZIONE SU DISPOSITIVO CON LETTURA
AUTOMATIZZATA (QUICKVET/RAPIDVET, DEA 1.1 BLOOD TYPE CARTRIDGE,
SCANDINAVIAN MICRO BIODEVICES) Dal 2011 è disponibile un test completamente automatizzato per la lettura dell’agglutinazione che si verifica tra un anticorpo monoclonale antiDEA1 e l’antigene presente sui globuli rossi DEA1 positivi. Il principio di questo test si basa sul differente assorbimento della luce del plasma contenente più o meno eritrociti. In particolare quando si verifica agglutinazione tra gli eritrociti e l’anticorpo antiDEA1, il plasma contiene meno eritrociti liberi e quindi si presenta più chiaro rispetto a un campione nel quale non si sia verificata agglutinazione e quindi i globuli rossi sono più omogeneamente dispersi in esso. La lettura dell’agglutinazione avviene in un analizzatore e i risultati sono disponibili in 10 minuti. Questa metodica ha il vantaggio di non richiedere alcuna interpretazione da parte dell’utilizzatore poiché i risultati vengono completamente elaborati da un software. È comunque necessario osservare scrupolosamente alcune operazioni preanalitiche perché i risultati siano attendibili (corretta risospensione del sangue intero in un buffer fornito in base al suo ematocrito). Questo metodo è stato valutato in un solo studio in cui è risultato idoneo per la tipizzazione rapida del gruppo DEA1 nel cane, fornendo però talvolta risultati non conclusivi che rendono necessaria l’applicazione di altre metodiche15.
TEST DI AGGLUTINAZIONE IN PROVETTA È un test che viene realizzato in laboratori
specializzati che dispongono di antisieri specifici per la determinazione dei gruppi sanguigni DEA1, DEA4, DEA7, e personale esperto. Si esegue facendo reagire i globuli rossi lavati e risospesi a una concentrazione del 3-5% con antisieri specifici in una provetta di vetro. La comparsa di una reazione di agglutinazione tra globuli rossi e antisieri identifica una reazione
31 positiva e quindi la presenza dell’antigene caratteristico. Sebbene sia considerato storicamente il test “gold standard” per la determinazione dei gruppi sanguigni nel cane, alcuni studi hanno messo in dubbio la sua validità, a causa dell’impossibile standardizzazione della metodica che utilizza antisieri policlonali prodotti tramite sensibilizzazione di cani e della soggettività nella lettura dei risultati caratterizzati da debole agglutinazione15.
TEST DI AGGLUTINAZIONE SU COLONNA DI GEL (DIAMED ID GEL-TEST
MICRO TYPING SYSTEM) Analogamente alla precedente, questa metodica utilizzata per la determinazione del gruppo DEA1, è riservata ai centri di ricerca specializzati in quanto necessita di attrezzature particolari e personale esperto. La tecnica si basa sul processo di agglutinazione ed eritrosedimentazione su colonna di gel e prevede l’utilizzo di schedine munite di microprovette in plastica contenenti un gel nel quale è incorporato l’antisiero per il rilevamento di gruppi DEA1. Si tratta di una metodica affidabile, di semplice e rapida esecuzione (30 minuti) che fornisce risultati oggettivi, ovviando al grosso problema dell’interpretazione soggettiva delle reazioni. Da qualche anno questo test per la determinazione del gruppo DEA1 nel cane, non è più disponibile in commercio. È disponibile un sistema simile di colonne di gel neutro (ID-card NaCl, enzyme test and cold agglutinins, BioRad) da utilizzare con diversi antisieri, che è stato utilizzato con successo per la determinazione dei gruppi sanguigni per i quali sono disponibili antisieri specifici (attualmente DEA 4, 7 e Dal)15.
CITOFLUOROMETRIA
La citofluorometria con l’utilizzo di antisieri anti DEA1 si è dimostrata un metodo accurato per la determinazione del gruppo sanguigno DEA 1 nel cane e ha anche permesso di evidenziare come le piastrine di cane non posseggano questo antigene di superficie e quindi non siano responsabili di reazione trasfusionali di incompatibilità di gruppo sanguigno. La limitazione nell’utilizzo di questa metodica risiede nei costi dell’attrezzatura, nella particolare specializzazione per la lettura e interpretazione dei risultati e nella limitata disponibilità degli antisieri DEA115.
32
5.4 Prove di compatibilità crociata (CROSS-MATCH)
La ancora oggi diffusa credenza che nel cane, durante la prima trasfusione ematica la compatibilità sanguigna rappresenti un problema trascurabile è smentita dalle recenti evidenze scientifiche. Infatti è stato segnalato che l’incompatibilità con il gruppo sanguigno DEA1 si verifica fino al 24% dei casi nei cani non tipizzati.
Studi effettuati in cani non precedentemente trasfusi hanno rilevato un’incidenza di alloanticorpi anti DEA pari all’8%.
Questi risultati suggeriscono che la trasfusione di sangue non tipizzato e non sottoposto a test di compatibilità crociata, comporta un rischio fino al 32% di avere reazioni trasfusionali immunologiche nel paziente. Appare quindi evidente che anche nel cane già alla prima trasfusione è fondamentale valutare la compatibilità sanguigna15.
Con la determinazione del gruppo sanguigno si individuano gli antigeni presenti sulla superficie dei globuli rossi, mentre con il crossmatching si testa la compatibilità sierologica tra ricevente e donatore. Con questo test si individua la presenza di anticorpi naturali o indotti da una precedente trasfusione, che possono provocare di emoagglutinazione o emolisi. Il test si può eseguire in tubi o colonne di gel oppure secondo una metodica che prevede la valutazione della presenza di agglutinazione al microscopio.
Il test consta fondamentalmente di 2 prove:
• Prova Major in cui si testa l’effetto degli anticorpi del ricevente sui globuli rossi del donatore.
• Prova Minor in cui si testa l’effetto di anticorpi naturali del donatore sui globuli rossi del ricevente.
Di seguito si riporta una metodica che può essere utilizzata anche nella pratica ambulatoriale. I campioni di partenza sono sangue intero il K3EDTA del donatore e del ricevente.
1. Centrifugare i campioni di sangue intero a 1000 rpm per 10 minuti. 2. Da ciascuna provetta separare plasma e globuli rossi.
3. Preparare una sospensione al 2% di globuli rossi (0.1 ml di globuli rossi in 5 ml di
soluzione salina allo 0,9%). Miscelare.
4. Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti.
5. Aspirare il surnatante e risospendere i globuli rossi in altri 5 ml di soluzione fisiologica. 6. Ripetere i lavaggi per tre volte il tutto.
7. Miscelare 2 gocce di plasma di donatore e due gocce di globuli rossi del ricevente (prova
33 (prova major). Preparare anche un controllo miscelando plasma e sospensione di globuli rossi provenienti dallo stesso soggetto.
8. Per le prove minor e major realizzare 3 provette per ciascuna da incubare per 30 minuti
a temperatura ambiente, 4°C e 37°C.
9. Centrifugare a 3000 rpm per 10 minuti.
10. Valutare le provette per la presenza di agglutinazione macroscopica ed emolisi ed infine
osservare una goccia con un obiettivo 40X per eventuali agglutinazioni.
La presenza di emolisi (es: anemia emolitica immunomediata, IMHA) e soprattutto di autoagglutinazione precludono la possibilità di eseguire il test (autocontrollo positivo). Se la prova major è positiva, significa che, dopo trasfusione, gli anticorpi presenti nel plasma del ricevente distruggeranno i globuli rossi del donatore16.
Dato che l’interpretazione delle reazioni di agglutinazione richiede una certa esperienza, dei kits per crossmatch commerciali basati su una reazione su gel (RapidVetH- Crossmatch) o sull’immunocromatografia (Alvedia Canine Crossmatch test) sono ora disponibili e più facili da interpretare2.
6) La donazione di sangue
6.1 Prelievo di sangue nel cane
Il sito di prelievo (la vena giugulare) deve essere rasata e preparata asetticamente. Il cane donatore ideale non deve necessitare di una sedazione. Il soggetto viene posizionato su un tavolo (decubito laterale o sternale) al fine di facilitare il riempimento del sistema per gravità (un sistema di aspirazione può essere ugualmente utilizzato).
Il sangue è tipicamente raccolto da un animale donatore direttamente in una sacca per la raccolta del sangue costituita da policloruro di vinile (PVC) ftalato plasticizzato che contiene citrato come anticoagulante di base.
L’aggiunta del fosfato all’anticoagulante riduce la perdita di fosfato dagli eritrociti e consente una produzione continua di adenosina trifosfato (ATP) da parte degli eritrociti durante la conservazione42.
Le soluzioni additive provvedono a fornire nutrienti per i globuli rossi per consentire un immagazzinamento più lungo e mantenere la loro vitalità, in particolare se il prodotto di sangue non deve essere utilizzato entro le 24 ore successive36, 42. Le soluzioni additive anticoagulanti più comunemente usate nelle banche di sangue per cani e gatti includono l’acido
