UNIVERSITÁ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutiche
Tesi di Laurea:
STUDIO COMPUTAZIONALE DI VIRTUAL SCREENING PER LO
SVILUPPO DI NUOVI INBITORI DELLA CHINASI BTK
Relatori: Dr. Tiziano Tuccinardi
Dr. Giulio Poli
Candidato: Piccinno Maria Eleonora
Settore Scientifico Disciplinare: CHIM-08
RIASSUNTO
La BTK (Bruton’s Tyrosine Kinase) è un membro della famiglia delle tirosine chinasi TEC. La BTK è espressa in molte cellule ematopoietiche come linfociti B, nei mastociti, e nei macrofagi, ma non è espressa a livello dei linfociti T, nelle cellule natural killer (NK) e nelle cellule del plasma. Una mutazione del gene umano che codifica per la BTK causa un’alterazione di essa, ciò provoca la mancanza di linfociti B periferici e livelli bassi di immunoglobuline che porta alla malattia ereditaria XLA (X-linked agammaglobulinemia). Nella XLA il deficit immunitario primario è specifico dei linfociti B e, data l’importanza di essi nella riposta immunitaria cellulo-mediata, è avanzato l’interesse da parte delle compagnie farmaceutiche nella ricerca di molecole inibitrici della BTK come possibili farmaci per la cura di patologie autoimmunitarie, come l’artrite reumatoide , il lupus erimatoso e la sclerosi multipla.
Lo scopo di questa tesi è stato quello di ricercare nuovi inibitori della chinasi BTK tramite studi di virtual screening (VS) di database commerciali.
La prima parte dello studio si è basata sull’analisi delle strutture cristallografiche della BTK contenenti ligandi noti in letteratura. La BTK ha uno stato attivo ed uno inattivo; la definizione di questo stato è data principalmente della sequenza amminoacidica DFG (aminoacidi 539-541) che può trovarsi in posizione “in” (verso l’interno) ed in posizione “out” (verso l’esterno). Quando è in posizione “out”, ostacola il legame dell’ATP con la proteina e ad essa si associa uno stato inattivo dell’enzima; quando invece la sequenza aminoacidica DFG si trova in posizione “in”, lo stato risulta essere attivo.
Ai fini del mio lavoro di tesi, si sono tenute in considerazione solo tre delle nove strutture cristallografiche note, in cui i ligandi complessati interagiscono con la forma attiva dell’enzima. Una delle tre strutture (codice PDB 3K54) contiene un noto antileucemico, il Dasatinib, ed è stata quella utilizzata nei vari step receptor-based del VS poiché presenta la definizione di un loop importante per un’ulteriore stabilizzazione del ligando al suo interno .
Dopo validazione, si è sottoposto il database commerciale Allvendor (contenente circa 780.000 composti) ad uno screening ligand-based col programma ROCS, utilizzando come riferimento i ligandi contenuti nelle tre strutture cristallografiche prese in analisi. Il programma, che utilizza un metodo shape-based, basato sulla sovrapposizione della forma, ha permesso di selezionare tutte quelle molecole strutturalmente simili alle tre note in bibliografia.
I risultati ottenuti dallo screening sono stati soggetti ad un ulteriore filtro da parte del programma FLAP, utilizzando stavolta un metodo receptor-based, sfruttando quindi le interazioni che le
ipotetiche strutture possano avere con la zona cerniera del recettore e l’affinità di esse per il sito recettoriale.
Il filtraggio con FLAP ha ridotto il numero di molecole iniziali portandole a circa 923, esse sono state poi sottoposte al docking utilizzando il programma GOLD, tale programma analizza il complesso proteina-ligando in termini energetici. I risultati si sono in seguito visualizzati e analizzati, tenendo in considerazione solo quelle molecole che stabilivano almeno due legami ad idrogeno nella zona cerniera dell’enzima. L’analisi ha portato all’ottenimento di 58 strutture, un numero ragionevole di composti da essere sottoposti allo studio di dinamica molecolare, essendo un calcolo molto accurato, che richiede tempi macchina lunghi, viene utilizzato in una delle ultime fasi del protocollo, in maniera da poter fornirgli un numero adeguato di molecole.
Lo studio di dinamica molecolare consente di verificare la stabilità del complesso fornendogli energia. A differenza del docking, dove si considera il recettore come un’entità completamente immobile, nella dinamica molecolare anche l'enzima ha un certo grado di libertà conformazionale, che possiamo impostare noi variando determinati parametri.
Con questa analisi è stato possibile individuare e selezionare i composti in grado di mantenere almeno due interazioni ad idrogeno fondamentali con la zona cerniera della proteina per almeno l'85% della simulazione. In questo modo, delle 58 strutture solo 5 sono state tenute in considerazione.
Tali composti saranno acquistati e saggiati allo scopo di verificarne l'attività inibitoria sulla proteina ed il loro possibile utilizzo come nuovi potenziali lead per lo sviluppo di nuovi inibitori della BTK.
