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1.1 L’Adenosina
L’adenosina è un nucleoside endogeno costituito dalla base purinica Adenina e dallo zucchero pentoso D(-)ribosio, legati tra loro da un legame di tipo glicosidico tra l’atomo di azoto in posizione 9 della base e il carbonio in posizione 1 dello zucchero.
Fig.1.1.1 Struttura molecolare dell’adenosina
L’adenosina è una sostanza ubiquitaria nelle cellule dei mammiferi, ed è metabolicamente e strutturalmente correlata a nucleotidi biologicamente attivi: AMP (adenosina monofosfato), AMP ciclico (adenosina monofosfato ciclico), ADP (adenosina difosfato), ATP (adenosina trifosfato), coenzimi (NAD, FAD, coenzima A) ed agenti metilanti (S-adenosil-L-metionina).
L’adenosina è coinvolta nella costituzione degli acidi nucleici (RNA) e nel metabolismo purinico. In quanto componente delle suddette molecole, l’adenosina svolge un ruolo chiave in numerosi processi, quali l’utilizzazione dell’energia cellulare, la trasduzione del segnale (tramite l’attivazione di sistemi a cascata coinvolgenti secondi messaggeri) ed in alcuni meccanismi enzimatici redox fondamentali per il metabolismo cellulare. Tra le reazioni più significative nelle quali l’adenosina è coinvolta ci sono le degradazioni enzimatiche dei nucleotidi ATP, ADP, AMP, e AMP ciclico (cAMP) ad adenosina, la deaminazione ossidativa della stessa ad inosina da parte dell’adenosina deaminasi (ADA) e le
3 trasformazioni in ipoxantina, xantina o acido urico, fondamentali nella regolazione della concentrazione del nucleoside endogeno.
L’adenosina è un neuromodulatore del sistema nervoso centrale perché, a differenza dei neurotrasmettitori classici, non invia segnali tra neuroni o cellule ma è in grado di potenziare o inibire a livello presinaptico il rilascio di altri neurotrasmettitori tra cui l’aspartato, il glutammato, e l’acido γ-amminobutirrico (GABA). Inoltre a livello post-sinaptico regola la depolarizzazione e la iperpolarizzazione neuronale.
Come modulatore omeostatico, l’adenosina svolge un ruolo regolatore in condizioni fisiologiche ed uno protettivo in condizioni di emergenza, come l’ischemia e l’infarto. L’azione protettiva viene esplicata dalla riduzione dell’ipereccitabilità neuronale, dall’aumento del rifornimento di sangue locale, dalla riduzione dell’afflusso di Ca2+ nelle cellule e dalla prevenzione della morte cellulare.
La biosintesi dell’adenosina avviene attraverso le seguenti vie:
1) a livello sia intracellulare che extracellulare, per idrolisi a cascata dell’ATP a ADP e AMP, e per l’azione successiva della 5’-nucleotidasi;
2) per conversione intracellulare o extracellulare del cAMP a AMP attraverso la fosfodiesterasi e per la successiva degradazione dell’ AMP ad adenosina;
3) a livello intracellulare per conversione enzimatica della S-adenosilomocisteina (SAH) ad adenosina ad opera dell’enzima S-adenosilomocisteinasi. La maggior parte dell’adenosina viene sintetizzata attraverso tale via.
La concentrazione di adenosina viene mantenuta nell’ordine del μM, sia a livello intracellulare che extracellulare, grazie a trasportatori bidirezionali specifici, dipendenti dal gradiente di concentrazione, o attraverso la riutilizzazione di substrati biologici. Il tempo di emivita dell’adenosina in circolo è dell’ordine di alcuni secondi. Questa rapida degradazione indica che l’adenosina agisce localmente, vicino al sito da dove entra in circolo. [1]
L’eliminazione extracellulare dell’adenosina avviene attraverso tre processi: 1) Diffusione facilitata all’interno della cellula ad opera di un trasportatore;
4 2) Trasporto attivo tramite una proteina trasportatrice che richiede energia; 3) Deaminazione enzimatica ad inosina ad opera dell’adenosina deaminasi. [1]
Fig 1.1.2 Via metabolica dell’adenosina
1.2 Classificazione dei recettori dell'adenosina
L'adenosina media molti dei suoi effetti fisiologici mediante l’interazione con specifici recettori. I recettori per l’adenosina furono inizialmente classificati come
recettori purinergici P1 e P2.[2]
Tale distinzione era basata sull’ordine di potenza dell’adenosina e dei nucleotidi adeninici: la classe recettoriale P1 risulta maggiormente sensibile all’adenosina mentre la classe recettoriale P2 risulta preferenzialmente attivata da ATP ed ADP. Un’ulteriore differenziazione fra i recettori P1 ed i recettori P2 si basa sulla differente sensibilità all’antagonismo xantinico: [3] i recettori P1 risultano inibiti competitivamente da sostanze xantiniche rappresentate dalla caffeina, teobromina, teofillina che sono totalmente inattive sui recettori P2.
5 Entrambe le famiglie recettoriali presentano delle sottoclassificazioni identificabili secondo la struttura molecolare, il profilo farmacologico ed il meccanismo di trasduzione del segnale.
Successivamente è stata accertata l’esistenza di due sottotipi recettoriali P1 extracellulari in grado di modulare differentemente l’attività dell’adenilato ciclasi; inizialmente sono stati classificati come Ri e Rs, dove R rappresenta la necessità di avere la porzione di ribosio intatta ed I e S indicano che l’attivazione recettoriale porta rispettivamente all’inibizione od alla stimolazione dell’adenilato ciclasi. [1]
Successivamente tali sottotipi recettoriali sono stati definiti da Val Calker A1 e A2. [4]
Secondo le regole per la nomenclatura dei recettori e dei sottotipi recettoriali definite dal comitato internazionale per la nomenclatura dei recettori e la classificazione dei farmaci (IUPHAR), un recettore "completamente" definito includerebbe sia informazioni molecolari che farmacologiche su quel recettore. Questa definizione include un ligando endogeno noto, un profilo farmacologico univoco basato su dati di agonisti e antagonisti, una sequenza di amminoacidi distinta, un tipo strutturale (ad esempio, un canale ionico, legato a proteine G, ecc.) ed un sistema effettore. [1]
Sulla base di queste regole, i recettori P1 sono denominati "recettori dell’adenosina" (riferendosi al ligando endogeno), e attualmente sono stati definiti dal punto di vista farmacologico, strutturale e funzionale, quattro sottotipi del recettore P1: A1, A2A, A2B, A3. [5,6]
Ciascuno di questi sottotipi è stato caratterizzato da clonazione molecolare, un profilo di attività agonista, un profilo di attività antagonista ed un accoppiamento con proteine G e sistemi effettori.
Ognuno di questi sottotipi recettoriali è stato clonato in numerosi mammiferi, incluso l’uomo. I sottotipi A1, A2A, A2B sono stati scoperti ed inizialmente classificati col metodo farmacologico; la successiva clonazione, determinazione della sequenza ed espressione di ciascuno di questi sottotipi ha fornito conferme
6 strutturali e funzionali della loro classificazione originale come distinti sottotipi recettoriali adenosinici. Al contrario, il sottotipo A3 è stato inizialmente individuato attraverso studi di biologia molecolare, ai quali si sono aggiunti successivamente studi farmacologici classici. [1]
Figura 1.2.1 Regolazione dell'adenilciclasi mediante stimolazione del recettore dell'adenosina. [7]
L'analisi delle sequenze amminoacidiche dei recettori clonati dimostra che si adattano tutti al motivo strutturale che include sette domini transmembrana (7-TMS) e che è il modello per tutti i recettori accoppiati a proteine G.
Solitamente le sequenze amminoacidiche dei recettori accoppiati a proteine G mostrano nel complesso un’elevata omologia compresa fra l’85% ed il 95% per lo stesso sottotipo recettoriale nelle diverse specie, soprattutto nelle regioni trans membrana.
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1.2.1 Meccanismo di trasduzione dei recettori adenosinici
I recettori adenosinici (Fig. 1.2.1) appartengono alla superfamiglia dei recettori 7- TMS: si tratta di proteine integrali di membrana caratterizzate da sette segmenti transmembranali, da un sito extracellulare (porzione N-terminale) che riconosce il ligando e da un sito intracellulare (porzione C-terminale) che riconosce una proteina legante il GTP (guanosinatrifosfato) o proteina G. [1]
Le proteine G comprendono un’ampia famiglia di proteine costituite da tre subunità (α, β, γ) che si differenziano per la tipologia di subunità α (Gs, Gi, Gq, etc), in grado di attivare una particolare via di trasduzione del segnale intracellulare. I sette domini transmembrana, organizzati in strutture ad α-elica, sono costituiti ciascuno da 22-26 amminoacidi idrofobici e sono connessi tra loro da tre loop citoplasmatici e tre extracellulari. Questi ultimi contengono residui cisteinici capaci di formare ponti disolfuro, in grado di modificare notevolmente la conformazione del recettore. L’estremità N-terminale presenta i siti di glicosilazione, importanti nella formazione del legame farmaco-recettore. (Fig. 1.2.1).
Fig. 1.2.1.1. Modello del recettore dell’adenosina
Le proteine G sono proteine con struttura eterotrimerica, costituite da tre subunità, rispettivamente rappresentate dalla subunità α (di 40-45 KDa), dalla subunità ß (di 37 KDa) e dalla subunità γ (di 8-10 KDa). Le subunità α delle
8 proteine G presentano l’abilità di legare i nucleotidi guanilici, soprattutto il GTP e successivamente di idrolizzarlo grazie ad un’attività GTPasica intrinseca.
In assenza di stimolazione, la subunità α legata al GDP (guanosin difosfato), si trova associata al dimero ßγ, a formare un trimero inattivo. In seguito al legame dell’agonista al recettore, avviene un cambiamento conformazionale della proteina che induce il rilascio del GDP da parte della subunità α, che diventa affine per il GTP, dissociandosi dal dimero ßγ. La subunità attiva α-GTP interagisce con proteine effettrici, determinando l’attivazione o l’inibizione di enzimi intracellulari che svolgono un ruolo importante della produzione del secondo messaggero.
La proteina effettrice è rappresentata dall’Adenilato Ciclasi, enzima di membrana deputato alla trasformazione dell’ATP in AMP-3’5’-ciclico (cAMP), molecola che in diversi sistemi di trasduzione svolge il ruolo di secondo messaggero. Il cAMP solitamente attiva proteine chinasi, le quali a loro volta fosforilano altre proteine, attivando così una cascata di reazioni che portano alla risposta finale della stimolazione recettoriale.
I recettori adenosinici, in base ai sistemi di trasduzione, si possono così classificare:
- i recettori A1 sono solitamente accoppiati a una proteina Gi, con conseguente inibizione dell’enzima adenilato ciclasi e diminuzione dell’AMPc intracellulare; in alcuni casi, l’accoppiamento avviene anche con la Gk e la Gq, che modulano diversi effetti a livello dei canali del potassio, del calcio e della fosfolipasi C. Quest’ultima è una fosfodiesterasi che idrolizza il fosfatidilinositolo-4,5-difosfato, dando origine a inositolo trifosfato (IP3) e diacilglicerolo (DAG). [8]
IP3 provoca liberazione intracellulare di calcio dai depositi causando contrazione della muscolatura liscia e degradazione di glicogeno; DAG attiva la proteina chinasi C aumentandone l’affinità per il calcio e rendendola attiva a livelli fisiologici dello ione; si è vista anche attivazione di diversi canali del K+ (muscolari cardiaci e neuronali) attraverso l’accoppiamento con proteine G appartenenti alla famiglia delle G0 che ne aumentano la conduttanza;
9 - i recettori A2A e A2B sono prevalentemente accoppiati a una proteina Gs che porta ad un aumento della concentrazione intracellulare del cAMP.
- i recettori A3 sono accoppiati alle proteine Gi e Gq che mediano l’inibizione dell’adenilato ciclasi e la stimolazione della fosfolipasi C e dei canali del calcio. Il sito di legame per il ligando è costituito da una tasca formata dal riarrangiamento tridimensionale delle sette α-eliche transmembranarie. In particolare, si è scoperto che le porzioni recettoriali maggiormente coinvolte nel legame con il ligando sono i primi quattro segmenti transmembranali, mentre la porzione responsabile del mantenimento dell’accoppiamento con la proteina G è quella N-terminale del terzo loop intracellulare.
Il segmento intracellulare del recettore è deputato all’interazione con una proteina G diversa a seconda del sottotipo recettoriale.
Figura 1.2.1.2. Ciclo di attivazione della proteina G mediante recettori accoppiati a proteine G.
Il sottotipo recettoriale A1 media una vasta gamma di risposte di segnalazione, che possono essere causate dal suo accoppiamento con diverse proteine G. [7] Figura 1.2.3 La via di segnalazione più ampiamente riconosciuta del sottotipo
10 recettoriale A1 è l'inibizione di AC che causa una diminuzione nel secondo messaggero cAMP. [7]
Questo in turn modula l'attività della protein chinasi cAMP-dipendente, che fosforila diversi bersagli proteici. Un altro meccanismo di segnalazione del sottotipo recettoriale A1 è l'attivazione della fosfolipasi C (PLC) che porta al metabolismo della fosfoinositide della membrana e all'aumentata produzione di inositolo-1,4,5-trifosfato (IP3), diacilglicerolo (DAG) e mobilizzazione Ca2+. L’attivazione della fosfolipasi D (PLD) tramite A1 è stata descritta anche se, come nella maggior parte dei sistemi cellulari, questo potrebbe essere a valle dell'idrolisi del fosfoinositide e potrebbe richiedere l'attivazione intermedia della proteina chinasi C (PKC) o Ca2 +. La stimolazione di A1 AR può attivare diversi tipi di canali K +, descritti principalmente nel muscolo cardiaco e nei neuroni.
Figura 1.2.1.3. Percorsi intracellulari accoppiati al recettore dell'adenosina A1.[7]
I AR A2A trasducono il loro segnale attivando la proteina G eterotrimerica intracellulare e attivano l'AC portando all'accumulo di AMP ciclico e all'induzione della fosforilazione dipendente dalla chinasi A (PKA) della proteina dei canali di Ca2+ di tipo P.
Inoltre A2A AR è noto per attivare Gs, ma i recettori nello striato possono interagire prevalentemente con Golf (identificato per la prima volta nell'epitelio olfattivo) perché il Golf risulta altamente espresso nello striato rispetto a Gs. È
11 stato anche dimostrato che l'attivazione di AR A2A induce una fosforilazione dipendente dal cAMP della chinasi della proteina regolata dalla dopamina e dal cAMP (DARP-32), che in seguito alla fosforilazione viene convertita in un potente inibitore della fosfatasi proteica. È stato suggerito che la modulazione del rilascio di neurotrasmettitore nei terminali del nervo glutammatergico colinergico e ippocampale striatale può comportare l'attivazione di canali di Ca2 + PKA e di tipo P o l'attivazione di proteina G insensibile alla tossina colerica, PKC e tipo N Ca2 + canali. L'attività modulatoria di AR A2A sul rilascio di neurotrasmettitore è stata spesso utilizzata per spiegare le proprietà neuroprotettive associate al blocco AR A2A in diversi modelli di neurodegenerazione.
Figura 1.2.1.4. Interazioni dell'adenosina-dopamina nel sistema nervoso centrale. [7]
A2B AR stimola l'adenililciclasi accoppiando direttamente alle proteine intracellulari Gs. Tuttavia, è stato scoperto che vie di segnalazione intracellulari
addizionali sono accoppiate funzionalmente con A2B ARs. [7]
La stimolazione di A2B AR provoca l'accumulo di Ca2 + intracellulare un processo che si pensa sia mediato tramite diversi meccanismi come potenziamento dei canali di tipo P nei neuroni piramidali di ippocampo di cavia tramite l'accoppiamento con la proteina Gs che viene bloccata dalle protein chinasi
12 cAMP-dipendenti. Un altro meccanismo coinvolto potrebbe essere indipendente dal cAMP che richiede l'accoppiamento proteico Gs o tramite l'attivazione PLC. [7]
Figura1.2.1.5. Percorsi intracellulari accoppiati al recettore A2B dell'adenosina[7]
Di conseguenza, è stato proposto che i AR A2B siano anche accoppiati al PLC specifico del fosfatidilinositolo attraverso la proteina G della famiglia Gq e l'attivazione di questa via porti ad un aumento del diacilglicerolo che attiva PKC ed IP3. [7]
Inoltre, la segnalazione intracellulare di AR A2B può essere modulata dall'interazione con altri sistemi recettoriali, ad esempio, agenti che aumentano il calcio intracellulare o attivano la proteina chinasi C potenziano significativamente la produzione di cAMP mediata da A2B in varie cellule. D'altra parte, l'ingresso di calcio stimolato dalla bradichinina causa l'inibizione della adenililciclasi stimolata da A2B nelle cellule di astrocitoma, ma la stimolazione diretta della proteina chinasi C migliora la risposta A2B. È interessante notare che, per quanto riguarda i percorsi intracellulari, gli A2B AR hanno tanto in comune con A1 o A3 AR (attivazione della fosfolipasi C), come con A2A AR (attivazione di adenililciclasi). Sfortunatamente, la mancanza di agonisti ed antagonisti altamente selettivi degli A2B AR ha precluso per anni la caratterizzazione farmacologica di questo sistema recettoriale e rimane da chiarire se tutti i meccanismi descritti qui appartengono a ogni tipo di cellula che esprime AR A2B.
13 Coerentemente con tutti i AR, il primo ciclo extracellulare di tutte gli AR A3 contiene anche un potenziale sito di glicosilazione N-linked all'amminoacido 42 della sequenza consenso. [7]
Inoltre, nella regione C-terminale, il Cys302 della sequenza consenso è un potenziale sito di palmitoilazione che può essere necessario per la formazione di un quarto anello intracellulare e per l'interazione del recettore con le proteine G. Gli A3 AR sono in grado di causare l'inibizione dell'accumulo di cAMP stimolato dalla forskolina, di aumentare l'attività fosfolipasi di fosfolipasi C e D e di elevare il fosfatidilinositolo Livelli IP3 e di Ca2 + intracellulari.
Figura 1.2.1.6. Percorsi intracellulari accoppiati al recettore A3 dell'adenosina.[7]
1.2.2 Localizzazione dei recettori adenosinici
Recettori adenosinici A1
Questo sottotipo recettoriale è ubiquitariamente distribuito ed è prevalentemente presente all’interno del SNC sia pre- che post- sinapticamente. Alti livelli sono espressi nella corteccia cerebrale, nell’ippocampo, nel cervelletto, nel talamo, nel sistema limbico, nei gangli della base, nella colonna vertebrale, ma anche negli astrociti, nella microglia, e negli oligodendrociti, sebbene con densità minore. A livello periferico si trova nel tessuto adiposo; livelli intermedi si evidenziano nel muscolo scheletrico, nelle ghiandole salivari, nell’esofago, nel colon, nel fegato, nei reni, negli occhi, nei nodi seno-atriale e atrio-ventricolare
14 del cuore, nell’antro e nei testicoli; livelli ancora più bassi nei polmoni, nei ventricoli e nel pancreas.
Le principali funzioni fisiologiche mediate dal recettore A1 sono riportate nella tabella 1.2.1. [1,9]
SNC Riduzione del rilascio di trasmettitori
Sedazione
Effetti anticonvulsivanti Effetti ansiolitici
Effetti locomotore-deprimenti
Sistema cardiovascolare Effetto batmotropo negativo
Effetto cronotropo negativo Effetto dromotropo negativo Effetto inotropo negativo Cardioprotezione
Sistema metabolico Effetto antilipolitico
Incremento sensibilità all’insulina
Tratto GI Inibizione della secrezione acida
Sistema renale Riduzione di GFR
Inibizione del rilascio di renina Effetto antidiuretico
Vasocostrizione dell’arteria afferente
Tabella 1.2.1. Funzioni mediate dal recettore A1.
Principali applicazioni terapeutiche dei ligandi del recettore A1
A livello centrale gli agonisti A1 presentano proprietà neuro protettiva, analgesica, ansiolitica, anticonvulsivante e sedativa mentre gli antagonisti A1 presentano proprietà antidepressiva. A livello cardio-circolatorio gli agonisti A1 presentano proprietà antiaritmica, mentre gli antagonisti A1 svolgono un ruolo importante nel trattamento delle bradiaritmie post-infarto del miocardio.
A livello renale gli antagonisti presentano proprietà diuretiche, oltre a svolgere un’attività nel trattamento dell’insufficienza renale acuta.
Recettori adenosinici A2A
Il gene codificante per il recettore umano A2A è localizzato nel cromosoma 22, ed evidenzia un’omologia dell’82,9% con i recettori A2A del ratto. I recettori A2A sono presenti, a livello centrale, nelle regioni ricche di dopamina quali striato ,nucleo caudato, il putamen (gangli della base), nucleo accumbens, tubercolo olfattivo e
15 nelle cellule di Purkinjie del cervelletto; a livello periferico sono presenti nelle cellule endoteliali della muscolatura liscia vascolare, in piastrine, linfociti, monociti, macrofagi, neutrofili, basofili, eosinofili, mastociti, polmoni, cuore, vescica e tessuti immunitari, mentre nei neuroni spinali intermedi dello striato i recettori A2A sono in stretta associazione con i recettori dopaminergici D2.
Inoltre, da studi anatomici, biochimici, e comportamentali è stato evidenziato che i recettori A2A interagiscono, sia in modo diretto che indiretto, con differenti sistemi neurotrasmettitoriali, come quelli dopaminergici, GABAergici, colinergici e glutammatergici, sia nei gangli basali che in altre strutture cerebrali. I recettori A2A modulano la neurotrasmissione eccitatoria in diverse regioni del cervello: l’attivazione di tale sottotipo recettoriale sembra essere in grado di ridurre l’affinità della dopamina per i recettori D2.
Le principali funzioni fisiologiche mediate dal recettore A2A sono riportate nella tabella 1.2.2. [1,9]
SNC Regolazione sensoriale nei gangli basali
Stimolazione attività nervo sensoriale Sinergismo di inibizione D2
Sistema immunitario Inibizione attività leucociti e
polimorfonucleati
Inibizione rilascio citochine proinfiammatorie
(TNFα, IL-6, IL-8 e IL-12) Aumento rilascio citochine antiinfiammatorie
(IL-10)
Sistema cardiovascolare Inibizione aggregazione piastrinica
Vasodilatazione
Peggioramento danno da ischemia
Tabella 1.2.2. Funzioni mediate dal recettore A2A.
Principali applicazioni terapeutiche dei ligandi del recettore A2A
A livello centrale gli agonisti A2A presentano proprietà antipsicotiche, mentre gli antagonisti A2A presentano proprietà neuro protettiva, antidepressiva, antiparkinson ed anti corea di Huntington. A livello cardio-circolatorio gli agonisti
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A2A presentano proprietà antiipertensiva, antiaggregante piastinica,
vasodilatatoria, mentre gli antagonisti A2A svolgono un ruolo nel trattamento delle bradi aritmie post-infarto del miocardio. A livello periferico gli agonisti A2A presentano proprietà antiinfiammatoria.
Recettori adenosinici A2B
Inizialmente si pensava che l’espressione del recettore A2B fosse ristretta a organi quali vescica, intestino, polmone, epididimo, vasi deferenti, colonna vertebrale e cervello, ma successivamente sono stati localizzati anche in fibroblasti, vari letti vascolari, cellule ematopoietiche, mastociti, cellule del miocardio, cellule muscolari ed endotelio. A causa della mancanza di potenti radio ligandi con specifica selettività, la determinazione quantitativa della distribuzione tissutale dei recettori adenosinici A2B non è possibile; quindi le informazioni presenti in letteratura sono basate su dati riferiti ai livelli di mRNA (usando Northern blot analysis si determina direttamente l’mRNA), che si assumono come corrispondenti all’espressione della proteina. Diversi articoli attribuiscono ai recettori A2B effetti cardiovascolari, in quanto una loro attivazione può controllare: proliferazione fibroblastica, ripristino cardiaco, patologie quali ipertensione o infarto miocardico.[1]
Le principali funzioni fisiologiche mediate dal recettore A2B sono riportate nella tabella 1.2.3. [1,8]
SNC Inibizione trasmissione nervosa
Aumento sintesi IL-6 negli astrociti
Sistema cardiovascolare Aumento secrezione cloruri nel lume
intestinale
Sistema gastro-intestinale Vasodilatazione
Controllo proliferazione fibroblastica e ripristino cardiaco
Mastociti Ruolo nei processi infiammatori tra cui
l’asma
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Recettori Adenosinici A3
Il sottotipo recettoriale A3 risulta prevalentemente presente nei polmoni, fegato e cellule del sistema immunitario quali neutrofili, eosinofili e linfociti T; livelli più bassi si riscontrano nel cervello, cuore, testicoli e molti altri tessuti, ed in particolar modo nella microglia e negli astrociti.
Le principali funzioni fisiologiche mediate dal recettore A3 sono riportate nella tabella 1.2.4. [1]
SNC Neuroprotezione
Attività sedativo-ipnotiche, anticonvulsivanti ed anti-ansia Inibizione dell’esocitosi presinaptica
Sistema cardiovascolare Effetto anticoagulante
Ipotensione
Sistema immunitario Protezione cellulare (basse dosi)
Effetto pro-apoptotico (alte dosi)
Tabella 1.2.4. Funzioni mediate dal recettore A3
Principali applicazioni terapeutiche dei ligandi A3
A livello centrale gli agonisti A3 sono protettivi vascolari cronici, mentre gli antagonisti A3 protettivi vascolari acuti. A livello cardio-circolatorio gli agonisti A3 presentano proprietà cardioprotettiva. A livello respiratorio gli agonisti A3 presentano proprietà antiinfiammatoria ed antiasmatica mentre gli antagonisti A3 presentano proprietà antiallergica. Inoltre gli agonisti A3 sono antitumorali.
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1.3 Significato fisiologico dell’adenosina nei diversi distretti
dell’organismo
Le risposte fisiologiche mediante dall’adenosina dipendono dal sottotipo recettoriale attivato, dalla specie, dal tipo di tessuto interessato e dal suo stato metabolico.
Sistema nervoso centrale
Il SNC rappresenta il distretto presentante la maggiore concentrazione di recettori adenosinici; ciò avvalora l’ipotesi di uno specifico contributo purinergico ai processi di neurotrasmissione.
L’attività dell’adenosina si traduce in un aumento del tono inibitorio sul SNC;[10] questo trova conferma nei numerosi dati relativi agli effetti inibitori dell’adenosina sul rilascio di neurotrasmettitori [11] e nell’osservazione dell’effetto di stimolazione psicomotoria dei suoi antagonisti xantinici.
L’ipotesi relativa all’azione deprimente dell’adenosina nel rilascio dei neurotrasmettitori quali il GABA (acido γ-amminobutirrico) è avvalorata dalla localizzazione dei recettori A1 sulle terminazioni assoniche dei neuroni inibitori. Inoltre è stato dimostrato il suo coinvolgimento a livello del SNC nella modificazione dei flussi ionici di membrana [12] e nella modulazione dei diversi tipi di secondi messaggeri. [13]
Il legame dell’adenosina con il proprio recettore influenza anche l’affinità di altri mediatori per la propria specie recettoriale ed è importante sottolineare il rilascio di adenosina nel tessuto cerebrale durante gli attacchi epilettici [14] e quindi il suo ruolo come anticonvulsivante endogeno. Un altro importante effetto dell’adenosina nel SNC è recentemente emerso studiando la liberazione di amminoacidi (glutammato e aspartato) da parte di regioni ischemiche nel cervello di ratto.
Inoltre i livelli di adenosina aumentano notevolmente in risposta ad ipossia, ischemia, infiammazione, eccitazione; una volta rilasciata a livello extracellulare, l’adenosina agisce da un lato come protezione da tali condizioni, ma dall’altro
19 può anche contribuire a neurotossicità, danno e morte cellulare. Infatti l’attivazione del recettore A1 blocca il rilascio del glutammato, prevalentemente tramite un’inibizione presinaptica. Contemporaneamente l’attivazione A1 inibisce la conduttanza al potassio a livello post sinaptico, provocando iperpolarizzazione neuronale ed è stato osservato che l’aumentato del livello di glutammato nel vallo sinaptico porta a tossicità neuronale e contribuisce al danno in patologie neurodegenerative. Quindi l’inibizione del suo rilascio tramite agonisti A1 presenta attività protettiva.
Al contrario, quello che sappiamo sul ruolo dell’A2A nel modulare la funzione neuronale è meno chiaro, in quanto la maggior parte degli studi si è focalizzata sul ruolo di tale recettore nei gangli della base, dove risulta maggiormente concentrato; comunque, al di fuori di tale zona, nelle regione extra-striatali, presenta una preponderante localizzazione presinaptica, esercitando quindi un ruolo di controllo nel rilascio dei neurotrasmettitori. La loro stimolazione facilita il rilascio di molti neurotrasmettitori come glutammato, GABA, glicina, acetilcolina, noradrenalina e serotonina.
Quindi il ruolo dell’adenosina nel cervello è il risultato di un equilibrio presente tra l’attivazione dei recettori A1 e A2A. [9]
Recenti studi hanno contribuito a capire come il recettore A2A dell’adenosina moduli la morte neuronale nel Parkinson, nell’Alzheimer, nella corea di Huntington, nella sclerosi multipla, nell’ischemia e nelle lesioni emorragiche cerebrali, nell’epilessia e nella demenza associata all’HIV. [15]
Contrariamente a quanto accade per gli A1, che in diverse condizioni patologiche tendono a desensibilizzare a lungo termine, stimoli di stress cronico a livello dei gangli della base causano un aumento dell’espressione degli A2A, come osservato in modelli animali di Parkinson e in pazienti con la stessa patologia; lo stesso fenomeno si è osservato in regioni extra-striatali. Un recente studio ha rilevato che una crisi convulsiva causa a lungo termine un aumento dei livelli del recettore A2A nella regione corticale, che contrasta con la diminuzione dell’espressione dell’A1. Anche in pazienti con Alzheimer e Corea di Huntigton è
20 stata osservata una up-regulation dei recettori A2A. Inoltre tale fenomeno è stato riscontrato anche in pazienti schizofrenici. In conclusione, l’equilibrio dell’espressione dei recettori A1 e A2A sembra essere modificato da stimoli di stress; infatti, in tali condizioni abbiamo una diminuzione dell’A1 e un aumento dell’A2A. [9]
Le patologie che si verificano a livello del sistema nervoso in cui è implicata l’adenosina sono diverse ed una delle più studiate è sicuramente il morbo di Parkinson. La malattia di Parkinson sovente definita come Morbo di Parkinson, Parkinson, parkinsonismo idiopatico, parkinsonismo primario, sindrome ipocinetica rigida o paralisi agitante è una malattia neurodegenerativa, caratterizzata dalla morte delle cellule che sintetizzano e rilasciano la dopamina che si trovano nel nucleo striato, regione nella quale è stata osservata una sovra espressione dei recettori A2A che può contribuire ad una degenerazione nigro-striatale, ed è stato osservato che la morte neuronale dopaminergica data dalla somministrazione di malonato è attenuata dal blocco dei recettori A2A. Inoltre, risulta presente un’interazione inibitoria tra i recettori postsinaptici della dopamina ed il recettore A2A dell’adenosina. Infatti l’attivazione di tale recettore riduce l’affinità degli agonisti D2 e porta ad una riduzione dell’attività locomotoria mediata dalla dopamina. Il blocco del recettore A2A è una valida strategia per il Parkinson in cui si può avere diminuzione della rigidità muscolare ed un potenziamento degli effetti della L-DOPA.
Nel morbo di Alzheimer, invece, patologia anch’essa neurodegenerativa, il ruolo dell’adenosina risulta importante nella deposizione della ß amiloide; proprio l’A2A è essenziale nell’espressione della ß amiloide e quindi il blocco del recettore A2A rafforza la resistenza delle cellule neuronali agli insulti, diminuisce la progressione della malattia e può facilitare i meccanismi di memorizzazione ed apprendimento. [15]
Quindi sono presenti diversi meccanismi e diverse situazioni in cui è possibile evidenziare il ruolo dei recettori A2A quali target terapeutici. Dall’evidenza del fatto che in condizioni di stress si abbia una up-regulation degli A2A, appare logico
21 concepire che la manipolazione degli effetti di tali recettori possa influenzare le conseguenze sul danno neuronale. Infatti diversi gruppi di studio, utilizzando differenti stimoli dannosi, hanno sistematicamente confermato l’abilità del blocco dell’A2A nel conferire una buona neuro protezione nelle zone striatali, corticali e dell’ippocampo, dovuto al fatto che gli effetti mediati dall’A2A regolano il rilascio di glutammato.
Inoltre un aspetto interessante relazionato con la neuro protezione dovuta al blocco dell’A2A è che gli effetti di tale recettore non sembrano desensibilizzarsi con la prolungata somministrazione di antagonisti. Questo mantenimento a lungo termine degli effetti degli antagonisti A2A probabilmente si riferisce alla sovra espressione di tali recettori durante condizioni di stress.
Questo rende tali recettori un importante target per la manipolazione del danno cellulare, così l’uso di antagonisti A2A sembra essere la più promettente strategia neuro protettiva basata sul sistema modulatorio dell’adenosina. [9]
Il sistema cardiovascolare
L’adenosina, agisce anche a vari livelli del sistema cardiovascolare. Il bilancio tra la richiesta e l’apporto di ossigeno al cuore può regolare la produzione di adenosina. [16]
Una inadeguata ossigenazione del tessuto cardiaco può essere provocata da un decremento di apporto di ossigeno (ischemia) o da un aumento della richiesta (eccessiva attività). La conseguente bassa pressione parziale di ossigeno causa a sua volta una caduta nella carica energetica della cellula, prevalentemente in compartimenti sensibili come i mitocondri; questa caduta energetica, processo che coinvolge l’ATP, si riflette in un aumento dei livelli locali di adenosina, la quale tenderà a ripristinare la normale ossigenazione del tessuto. Questo scopo viene raggiunto dalla combinazione degli effetti che l’adenosina produce per interazione con i diversi sottotipi recettoriali. In particolare l’effetto A1 mediato provoca una riduzione della richiesta di ossigeno e l’effetto A2A un aumento dell’apporto; inoltre, l’effetto sull’A2A induce vasodilatazione ed inibizione
22 dell’aggregazione piastrinica, [17] che determinano un aumento del flusso sanguigno e quindi dell’apporto di ossigeno; quindi l’adenosina può assumere un ruolo fisiologico come autacoide nella regolazione del flusso coronarico. [18,19] Infatti durante ipossia o ischemia i suoi livelli aumentano e in caso di aumentato apporto di ossigeno (somministrazione di nitroglicerina) i suoi livelli diminuiscono. Questo meccanismo di feed-back permette al cuore di regolare il flusso coronarico ad ogni variazione di richiesta energetica; a livello periferico l’adenosina presenta proprietà vasodilatante per azione sui recettori A2B localizzati sull’endotelio dei vasi. [20,21]
Inoltre a livello cardiaco si osservano potenti effetti cronotropi (frequenza), inotropi (forza di contrazione), dromotropi (flusso del potenziale atrio-ventricolare) negativi mediati dal recettore A1, che riducono la frequenza di scarica delle cellule pacemaker. [22,23]
Infine, l’adenosina svolge, oltre a questi effetti diretti, anche un controllo indiretto sulla funzione cardiaca antagonizzando le azioni stimolanti dei recettori ß-adrenergici; è stato anche proposto un ruolo dell’adenosina nella regolazione del flusso ematico cerebrale e dei muscoli scheletrici, [24] ma le prove sono meno convincenti che per il flusso coronarico.
Il sistema immunitario
L’adenosina presenta un ruolo importante nelle funzioni immunitarie ed è un modulatore endogeno dell’infiammazione. Il metabolismo purinico riveste un ruolo importante nella risposta immunitaria e la prova di ciò è stata ottenuta osservando che l’attività ridotta o assente dell’ADA (adenosina deaminasi) nell’uomo è stata associata ad una forma autosomica di una grave immunodeficienza combinata. In questa malattia, l’accumulo intracellulare di adenosina a livello delle cellule immunitarie provoca alterazioni dell’equilibrio energetico e l’attivazione di vie di morte con conseguente apoptosi dei linfociti che risulta letale entro pochi anni di vita. Nel morbo di Hodgin sono ridotte sia l’attività dell’ADA che delle 5’-nucleotidasi.[25]
23 Gli elevati livelli di adenosina e dei suoi metaboliti provocano inibizione selettiva sia della differenziazione che della funzione effettrice dei linfociti. Alcuni studi hanno dimostrato che i recettori presenti sui linfociti T sono prevalentemente A2A; è stato suggerito che i recettori adenosinici giochino un ruolo fondamentale nel limitare le risposte degli auto-antigeni, cosa che accade nei tessuti danneggiati da ischemia o processi infiammatori.
Infatti l’adenosina, rilasciata dalle cellule anossiche o dall’endotelio vascolare danneggiato, è capace di inibire tramite i recettori A2A le reazioni immuno fisiologiche relativamente deboli causate da antigeni non molto potenti come gli auto-antigeni, mentre la sua attività immunosoppressiva non è tale da inibire risposte immunitarie provocate da antigeni potenti quali virus e batteri.
Inoltre la concentrazione di adenosina nel sangue (da 3·10-7M a 3·10-6 M) o nei tessuti ben ossigenati non è tale da causare soppressione dell’azione linfocitaria, mentre i suoi livelli nelle aree di infiammazione o ischemiche sono tali da inibire la funzione dei linfociti T e prevenire lo sviluppo di una reazione autoimmune. Inoltre, a livello periferico l’attivazione dell’A2A attenua la risposta infiammatoria. Infatti essa è un potente agente antiinfiammatorio che “spegne” (triggers off) i segnali nelle cellule immunitarie attivate. Gli agonisti A2A sono tra i più potenti agenti antiinfiammatori mai conosciuti, ed è stato visto che l’attivazione dei recettori A2A conferisce robusta protezione nei confronti del danno tissutale da riperfusione ischemica in diversi organi quali cuore, vasi, fegato, rene, pelle. Infine, gli studi fatti indicano che l’attivazione dell’A2A inibisce il rilascio di citochine pro-infiammatorie dalle cellule attivate come macrofagi, cellule dendritiche, monociti, cellule T e che il blocco di tale recettore in periferia esacerba il danno tissutale. L’adenosina, ad alta concentrazione, come quella che si ha nei tessuti danneggiati, inibisce la produzione di specie reattive dell’ossigeno, potenzialmente tossiche, conferendo protezione. [9]
24
L’apparato respiratorio
L’adenosina e i suoi analoghi sintetici possono modificare il tono della muscolatura liscia bronchiale producendo transitoria bronco costrizione seguita da prolungato rilassamento (A1). [26]
Nei soggetti non asmatici la somministrazione di adenosina per inalazione non produce effetti significativi sul calibro delle vie aeree, mentre nei soggetti asmatici provoca potente bronco costrizione (sistema NANC: non adrenergico-non colinergico). La capacità dei derivati xantinici di provocare broncodilatazione non sembra tuttavia legata all’antagonismo sull’adenosina. Questo non preclude il suo potenziale ruolo di mediatore anche nell’asma.
Il metabolismo
L’adenosina presenta diverse funzioni metaboliche che sono rispettivamente rappresentate da: 1) l’inibizione della lipolisi (effetto A1 mediato); provocando una riduzione della richiesta di ossigeno dal cuore e determinando così una minore disponibilità di acidi grassi quali substrati catabolici.
2) l’aumento della sensibilità dei tessuti all’insulina (effetto A1mediato). 3) la stimolazione della secrezione pancreatica di insulina e glucagone. 4) la stimolazione della gluconeogenesi epatica (effetto A2 mediato);
Il rene
L’adenosina svolge un complesso ruolo fisiologico nella regolazione dell’attività renale, in quanto interviene nel controllo emodinamico con un’azione di costrizione (A1 mediata) o di dilatazione (A2A mediata) delle arteriole afferenti renali; [26] agisce inoltre sulle cellule juxtaglomerulari inibendo la secrezione di renina (A1 mediata) da cui deriva un minor lavoro speso dal rene nel riassorbimento di sodio (sistema renina-angiotensina aldosterone) che risulta in una minore vasocostrizione vasale. Inoltre inibisce la diuresi e la filtrazione glomerulare (effetto A1 mediato). Valutando tali effetti, si intuisce il potenziale
25 impiego di antagonisti di tale recettore come diuretici e protettivi in casi di insufficienza renale grave. [27]
1.4 Antagonisti del recettore dell'adenosina
A
1Il sottotipo recettoriale A1 risulta particolarmente espresso nel sistema nervoso centrale (SNC), con alti livelli nella corteccia cerebrale, nell'ippocampo, nel cervelletto, nel talamo, nel tronco cerebrale e nel midollo spinale. Numerosi tessuti periferici esprimono tale sottotipo recettoriale anche nei dotti deferenti, testicoli, tessuto adiposo bianco, stomaco, milza, ipofisi, ghiandola surrenale, cuore, aorta, fegato, occhio e vescica. Bassi livelli si trovano nel polmone, nel rene e nell'intestino tenue. [28]
Diversi antagonisti A1 sono stati studiati come agenti diuretici, per il trattamento di malattie polmonari croniche, per la terapia cardiaca e per il trattamento della demenza. [29]
L'adenosina, agendo su sottotipo recettoriale A1, esercita effetti antidiuretici. Gli antagonisti A1, bloccando o riducendo l'azione dell'adenosina, possono essere efficaci come agenti diuretici. Gli antagonisti A1 hanno dimostrato essere diuretici risparmiatori di potassio con proprietà di protezione dei reni e potrebbero essere particolarmente utili nei disturbi della ritenzione di liquidi, spesso sperimentati da pazienti affetti da insufficienza cardiaca congestizia. In questi pazienti, gli antagonisti A1 presentano proprietà interessanti dell'aumento della diuresi e della velocità di filtrazione glomerulare, a differenza del diuretico furosemide che aumenta la diuresi a scapito di una diminuzione della velocità di filtrazione glomerulare. Gli antagonisti A1 possono aumentare la formazione di urina e, poiché non diminuiscono il flusso ematico renale, sono particolarmente utili per mantenere la filtrazione glomerulare in pazienti con edema secondario a ridotta funzionalità cardiaca. Recenti studi clinici hanno confermato i loro effetti benefici sulla funzionalità renale, anche se in molti studi i benefici renali scompaiono con dosi più elevate di questi farmaci. Gli studi in corso dovrebbero
26 essere in grado di dimostrare se gli antagonisti A1 possono essere utilizzati per migliorare la funzionalità renale senza influire negativamente sui pazienti con insufficienza cardiaca. [29]
Gli antagonisti A1 sono testati nel trattamento delle bradiaritmie associate a infarto miocardico inferiore, arresto cardiaco e rigetto del trapianto cardiaco e potrebbero essere utili nel trattamento delle cardiopatie croniche, sopprimendo la fibrosi cardiaca e diminuendo l'albuminuria, senza effetti sulla pressione sanguigna. [29]
Come riportato in precedenza, l'adenosina svolge un ruolo significativo nelle malattie polmonari ed è prodotta endogenamente da molte cellule durante l'ipossia, lo stress, la stimolazione allergica e l'esercizio fisico. Agonisti e antagonisti dei diversi sottotipi recettoriali sono stati testati in molti studi preclinici in vitro e in vivo e sono passati a studi clinici per valutare il loro potenziale come nuovi farmaci antiasmatici. In particolare gli antagonisti A1 potrebbero rappresentare farmaci utili per il trattamento di patologie polmonari croniche come l'asma, la broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) e la fibrosi polmonare. [28]
L'osservazione degli effetti della caffeina, un classico antagonista dell'adenosina non selettivo, sul SNC, incluso un miglioramento della consapevolezza e dell'apprendimento, ha incoraggiato la ricerca di antagonisti selettivi dotati di attività centrale, ed è stato riportato che il blocco del sottotipo recettoriale A1 è coinvolto negli effetti di stimolo discriminatorio di dosi di caffeina rilevanti dal punto di vista comportamentale. Tuttavia altri autori hanno dimostrato che il sottotipo recettoriale A2A è il principale mediatore dell'effetto stimolatore comportamentale della caffeina. Gli antagonisti selettivi di A1 inducono il miglioramento della cognizione, portando a un miglioramento generale delle prestazioni della memoria. Questo è potenzialmente utile nel trattamento della demenza e dei disturbi d'ansia. In un recente articolo, Trevitt e colleghi hanno riferito che il trattamento con il CPT antagonista A1 (8-ciclopentil-1,3-dimetilxantina) in un modello di morbo di Parkinson (PD) produce un
27 miglioramento dose-dipendente della locomozione, suggerendo che, sebbene il ruolo del sottotipo recettoriale A1 nella malattia di Parkinson (PD) non è ancora chiaro, l'antagonismo A1 può produrre effetti terapeutici benefici, in particolare all'inizio del trattamento. [29]
L'adenosina risulta essere coinvolta anche in altre attività, per esempio nella regolazione della funzione ossea; recentemente è stato riportato che gli antagonisti A1 riducevano la perdita ossea, indicando il loro potenziale utilizzo nel trattamento di osteopenia, osteoporosi e altre malattie ossee (ad esempio malattia di Paget). Altre potenziali applicazioni terapeutiche degli antagonisti del sottotipo recettoriale A1 sono rappresentate dal trattamento della sepsi, in associazione con antibiotici e dal trattamento delle lesioni da ischemia da riperfusione epatica.
Gli antagonisti del sottotipo recettoriale A1 prototipo sono le xantine, la teofillina e la caffeina; un gran numero di derivati della xantina è stata sintetizzata e studiata per questa attività. Tuttavia anche un elevato numero di derivati non xantinici è stato riportato come antagonisti A1 potenti e selettivi, ad esempio: derivati dell’adenina, della pirazolo[1,5-a]piridina, derivati imidazolici triciclici. Entrambi i derivati, xantinici e non xantinici, sono privi della frazione di zucchero che caratterizza la maggior parte degli agonisti A1. Solitamente, gli antagonisti A1 sono composti biciclici o triciclici, eterocicli planari, aromatici o ricchi di elettroni π, e contenenti azoto; i sostituenti idrofobi possono aumentare l'affinità, mentre i sostituenti idrofili, che rendono molti degli antagonisti ad alta affinità abbastanza solubili in acqua, non sono generalmente ben tollerati. [29]
1.4.1 Derivati xantinici
La classe più nota di composti classificati come antagonisti dell'adenosina sono le alchilxantine. Un gran numero di questi derivati è stato preparato nel tentativo di aumentare la potenza e la selettività. Sono stati identificati composti di potenza molto più elevata rispetto al prototipo caffeina, che di solito derivano dalla sostituzione con 1,3-dialchile e 8-arile o 8-cicloalchile. Tuttavia, questa classe di
28 composti mostra attività aggiuntive non correlate al blocco dei recettori adenosinici e ha avuto un successo limitato nell’identificazione di agenti selettivi nei confronti del sottotipo recettoriale A1 come agenti terapeutici. [30]
Teofillina 2 (1,3-dimetilxantina) e caffeina 3 (1,3,7-trimetilxantina) sono i classici antagonisti della xantina non selettivi che mostrano affinità micromolare in tutti i sottotipi AR.
La teofillina fu estratta per la prima volta dalle foglie di tè intorno al 1888. Il farmaco fu chimicamente identificato e sintetizzato nel 1896. Vi sono molti esempi di potenti antagonisti A1 che contengono una voluminosa sostituzione lipofila nella posizione 8 dell'1,3-dipropilxantina. La doxofillina 4 (7-(1,3-diossalan-2-ilmetil)teofillina) è un broncodilatatore xantinico che differisce dalla teofillina in quanto contiene un gruppo diossolano in posizione 7. Un gran numero di modifiche sul nucleo xantinico alle posizioni 1- , 3- e 8- ha portato alla scoperta di 8-ciclopentil-1,3-dipropilxantina (DPCPX) 5, selettivo per il sottotipo recettoriale A1 di ratto rispetto al sottotipo recettoriale A2A e meno selettivo per l'uomo (h) A1 rispetto al sottotipo recettoriale hA2A e hA2B. Altre xantine sostituite sono state proposte come antagonisti A1 AR, in particolare
1,3-dipropil-8-(3-noradamantil)xantina (KW-3902) 6 e
1,3-dipropil-8-[2-(5,6-epossinorbornil)xantina (BG-9719) 7. In questo composto, definito anche Naxifylline, l'anello xantinico e l'epossido sono, rispettivamente, situati endo ed eso nella frazione norbornana, e quest'ultimo ha un centro asimmetrico in C-2. Mentre era presente un piccolo effetto stereochimico sull'affinità tra gli enantiomeri per il sottotipo recettoriale hA1, l'isomero R sembrava essere meno potente dell'isomero S nel ratto. Recentemente, è stata studiata una serie di xantine sostituite con norbornil-lattoni strutturalmente correlate a BG-9719 8. Questi derivati, in cui la xantina occupa la posizione eso sul sistema ad anello norbornilico, hanno mostrato un'elevata affinità e selettività di legame A1 rispetto al sottotipo recettoriale A2A strettamente correlato. I lattoni possedevano un'attività in vivo simile se non migliore a BG-9719 nei modelli di diuresi del ratto. [30]
29 N N N H N O O N N N N O O N N N N O O O O
2 Teofillina 3 Caffeina 4 Doxofillina
N N N H N O O N N N H N O O 5 DPCPX 6 KW-3902 N N N H N O O O H N N N H N O O O O H 7 BG-9719 8 BG-9719
Figura 1.4.1.1. Antagonisti A1 AR (Xantine).
1.4.2 Derivati Xantinici solubili in acqua come antagonisti A1 AR
I derivati xantinici con affinità più elevata nella figura 1.4.1.1. presentano sostituenti notevolmente apolari. L'utilità della maggior parte di questi composti per la somministrazione endovenosa nel trattamento di pazienti con insufficienza cardiaca congestizia con scompenso acuto può essere limitata a causa della loro bassa solubilità in acqua. Nella ricerca di un antagonista selettivo A1 con maggiore solubilità in acqua, una serie di 1,3-sostituiti-8-cicloesil- e 8-biciciclo-[2.2.2]ottilxantine è stata studiata da Kiesman et al. [31]
Questi autori hanno inizialmente concentrato la loro attenzione sui derivati xantinici dell'acido 8-cicloesil-trans-4-carbossilico pubblicati da Katsushima e
30 collaboratori, [32] che mostravano una bassa affinità di legame con A1 AR. Hanno ampliato questa serie di composti e preparato i derivati biciciclo-[2.2.2]ottani mediante l'aggiunta di un ponte a due carboni che collega le posizioni 1- e 4 attraverso l'anello del cicloesano. L’ottimizzazione del sostituente testa di ponte ha quindi portato all’acido propionico 9 (BG-9928, Figura 1.4.2.1) [33] che ha mantenuto alta potenza (cane A1, Ki 29 nM) e selettività per A1 AR (163 volte contro A2A AR; 24 volte vs A2B AR; 1452 vs A3 AR); questo composto presenta una efficacia orale migliorata in un modello di diuresi sul ratto e elevata biodisponibilità orale nelle scimmie ratto, cane e scimmia cynomolgus.
Un'altra molecola idrosolubile che è stata descritta come un potenziale nuovo farmaco orale per l'asma è il 3-[2-(4-amminofenil)etil]-8-benzil-7-{2-etil-(2-idrossietil)ammino]etil}-1-propil-3,7-diidropurina-2,6-dione] 10 (L-97-1, Figura 1.4.2.1). Questo composto è un antagonista A1 (Ki 580 nM) con selettività almeno 100 volte su A2A e A2B AR. N N N H N O O R Bicyclo[2.2.1]octylxanthines N N N H N O O OH 9 BG-9928 H2N N N N N O O N OH 10 L-97-1 N N N H N O OH N
11 Tricyclic imidazole derivative
31
1.4.3 Derivati imidazolinici triciclici
Questi composti sono essenzialmente derivati xantinici in cui il sito basico aggiuntivo ha la funzione di aumentare significativamente la solubilità in acqua rispetto alle xantine analoghe, senza perdita sostanziale nell'affinità di legame A1. In relazione alla scoperta di BG-9928 e dei derivati triciclici dell’imidazolina riportati in letteratura, Vu et al. [34] hanno riportato la sintesi del composto 11, l'isomero R del 7,8-diidro-8-etil-2-(4-biciclo[2.2.2]ottan-1-ol)-4-propil-1H-imidazo-[2,1-i]purin-5(4H)-one, un antagonista A1 potente con buona selettività sugli altri tre AR. L'imidazolina è un antagonista A1 AR potente e altamente competitivo, altamente solubile in acqua (> 100 mg / ml). Inoltre, presenta una biodisponibilità orale dell'84% ed un'emivita orale di 3,8 ore nei ratti.
Ulteriori modifiche dei derivati imidazolici triciclici hanno anche dimostrato che il gruppo idrossile di testa di ponte poteva essere sostituito con un acido propionico senza una perdita significativa nell'affinità di legame o nell'attività in vivo.
1.4.4 Derivati Pirazolo[1,5-a]piridinici
Un'altra classe di composti strutturalmente correlati al nucleo xantinico è costituita da derivati del nucleo pirazolo-[1,5-a]-piridinico. Un composto di questa serie (composto 12 FK-453), sintetizzato da Akahane et al., [35] ha mostrato una potente e selettiva attività antagonista nei confronti del sottotipo recettoriale adenosinico A1 ed è stato selezionato per un'ulteriore valutazione. Varie modifiche sono state eseguite su questo nucleo, come la limitazione dell'acrililammide in un nucleo di piridazinone (composto 13, FK-838) che ha prodotto un significativo aumento di potenza e selettività. [36]
FK-838 è un antagonista adenosinico A1 selettivo (IC50 A1 120 nM; IC50 A2 5900 nM), i cui effetti diuretici e natriuretici sembrano essere dovuti sia agli effetti emodinamici renali sia alla diretta inibizione del riassorbimento prossimale del Na+ tubulare. Il processo di progettazione che ha portato alla scoperta del composto 14 FR-166124, acido (2-[2-[6-oxo-3- (2-fenilpirazolo[1,5-a]
piridin-3-il)-32 1,6-diidropiridazina-1-il]-1-cicloesenil]acetico) ha comportato l'introduzione di vari gruppi ciclici acidi sul N2 dell'anello del piridazinone, al posto del gruppo di acido butirrico di FK-838, allo scopo di conferire rigidità e mimare la conformazione di FK-453. Il composto 14 è un derivato più potente con maggiore selettività A2A/A1 e solubilità in acqua molto elevata sotto forma di sale di sodio (>200 mg/ml). [37, 38] N N N O HO 12 FK-453 N N N N O OH O 13 FK-838 N N N N O COOH 14 FR-166124
Figura 1.4.4.1. A1 antagonisti AR (pirazolopiridine)
1.4.5 Derivati dell'adenina
I primi derivati dell'adenina che hanno mostrato attività antagonista dell'adenosina sono stati l'1-metil- e la 9-metiladenina. [39]
Fu osservato che l'adenina stessa e la 9-metiladenina mostravano un antagonismo competitivo specifico a basse concentrazioni, ma esibivano attività inibitoria non specifica a concentrazioni più elevate. Poiché la sostituzione N6 dell'adenosina era stata utilizzata per conferire selettività all'agonista per il recettore A1, era chiaro che un antagonista selettivo poteva potenzialmente essere ottenuto sostituendo lo zucchero ribosio con un gruppo metilico per generare N6-9-metiladenina sostituita. [40, 41]
Un ulteriore studio di relazioni struttura-attività ha portato all’identificazione del composto 15, (±)-N6-(endo-2-norbornil)-9-metiladenina N-0861, che è stato sottoposto a sviluppo come agente cardiovascolare per il trattamento di malattie
33 correlate all’adenosina, con affinità trascurabile (Ki> 10000 nM) per alfa 1, alfa 2 e beta adrenocettori, recettori dopaminergici D1 e D2 e recettori serotoninergici 5-HT2. [42] Studi di legame con radioligandi hanno dimostrato che il composto 15 (N-0861), si lega con elevata affinità al sottotipo recettoriale A1 nelle membrane caudate bovine, dove è selettivo di 600 volte per il sottotipo A1 vs A2. [42] Il composto 15 N-0861 si lega con minore affinità al sottotipo recettoriale A1 nel ratto ed alla corteccia cerebrale di maiale ed al tessuto atriale di cavia e umano. [43]
La sostituzione in posizione 8 dell’adenina con un residuo
isopropilmetilamminico ha dato i migliori risultati, portanto al composto 16 (WRC-0571), che è un antagonista A1 AR altamente potente e selettivo con potenza e solubilità in acqua superiore rispetto al composto 15 (N-0861). Inoltre, mostrava un'elevata affinità per hA1 (Ki 1,7 nM) ed un'affinità molto più bassa per hA2A e hA3 AR (Ki 105 e 7940 nM, rispettivamente). Negli studi funzionali, ha inibito potentemente la risposta inotropa negativa mediata da A1 al 5'-(N-etil-carbossammido)adenosina (NECA) nell'atrio di cavia isolata (pKb 8,41), mentre è risultato molto meno attivo contro il rilassamento dell'aorta di cavia A2B -mediato, indotto da NECA (pKb <5). [44]
N N N N NH N N N N NH HO N 15 N-0861 16 WRC-0571
Figura 1.4.5.1. Antagonisti A1 AR (adenine)
34
1.5 Antagonisti del recettore dell'adenosina A
2AAll'interno del cervello i recettori A2A sono prevaletemene espressi nello striato, nel nucleo accumbens e nel tubercolo olfattivo. Una coespressione di A2A con i recettori della dopamina D2 è stata riportata nei neuroni striatopallidici GABAergici, dove agonisti dell’adenosina e della dopamina esercitano effetti antagonisti nella regolazione dell'attività locomotoria. L'attivazione di AR A2A nei neuroni striatopallidali diminuisce l'affinità dei recettori D2 per la dopamina, antagonizzando gli effetti dei recettori D2. L'interazione negativa tra i recettori A2A e D2 è alla base dell'uso degli antagonisti A2A come nuovo approccio terapeutico nel trattamento del morbo di Parkinson (PD). [45]
Inoltre, i recettori A2A possono presentare un ruolo importante nei processi neurodegenerativi; di conseguenza, un effetto neuroprotettivo è stato dimostrato dopo l'assunzione di caffeina o l'inattivazione di A2A AR contro la neurodegenerazione dopaminergica in un modello di neurotossina del morbo di Parkinson. [46]
Inoltre, due ampi studi epidemiologici prospettici hanno fortemente associato il consumo di caffeina a un ridotto rischio di sviluppare il morbo di Parkinson. [47, 48] Infine, la recente scoperta che l'A2A può formare complessi recettori eteromerici funzionali con altri recettori accoppiati a proteine G come D2 e recettori mGlu5 ha anche suggerito nuove opportunità per gli antagonisti A2A nel PD. [49]
In futuro, lo sviluppo di ligandi bivalenti, in grado di attivare D2 e bloccare A2A, od antagonizzare sia i sottotipi A2A che mGlu5, potrebbero rappresentare una strategia promettente per il trattamento di questa malattia neurodegenerativa. [50, 51]
Oltre alla protezione contro la perdita del neurone striatale e nigrale da parte degli antagonisti A2A, sono presenti anche dati che supportano il loro ruolo protettivo al di fuori dei gangli della base. [52]
L’iniezione locale di un antagonista A2A previene la morte dei neuroni dipendente dal glutammato nella corteccia ippocampale [53] e riduce anche il danno corticale in una varietà di modelli di ictus ischemico. In topi A2A-knockout (KO), l'ischemia
35 focale transitoria causa meno danni neuronali rispetto ai loro esemplari wild-type (WT). [54]
Pertanto, sembra che l'attivazione tonica dei recettori A2A possa essere responsabile del segnale pericoloso durante la lesione, al contrario degli effetti neuroprotettivi indotti dall'attivazione endogena di A1. Recentemente, l'inattivazione selettiva o la ricostituzione di A2A AR nelle cellule del midollo osseo ha rivelato il loro contributo allo sviluppo di lesioni cerebrali ischemiche. [55] Il coinvolgimento di A2A AR nella neuroprotezione è probabilmente complesso, poiché la stimolazione di questo sottotipo diminuisce anche il danno cerebrale dopo eccitotossicità e lesioni traumatiche. [56, 57]
La protezione contro ischemia mediata da A2A è stata evidenziata nella miocardia, nel rene e nel fegato e nella lesione da riperfusione ischemica nel midollo spinale. [58, 59]
Una elevata espressione di A2A AR è stata riscontrata in piastrine, leucociti, vasi muscolatura liscia e cellule endoteliali, con importanti implicazioni nella regolazione delle risposte infiammatorie ed è ormai noto che la stimolazione dei recettori A2A nelle cellule immunitarie induce effetti anti-infiammatori, principalmente grazie alla sua capacità di aumentare i livelli di cAMP, che ha forti effetti immunosoppressori. [60]
La stimolazione di A2A AR inibisce l'aderenza dei neutrofili all'endotelio, la degranulazione dell'attivazione di neutrofili e monociti, oltre alla generazione di anioni superossido. Gli A2A AR sono stati recentemente definiti come sensori e terminatori di attività proinfiammatorie. La più forte evidenza del ruolo chiave di A2A nell'infiammazione deriva dallo studio di Ohta et al, [61] che utilizza topi A2A -KO. In questo modello la mancanza del sottotipo A2A porta ad un aumento dell'infiammazione e del danno tissutale, suggerendo quindi un ruolo regolatore negativo e non ridondante per A2A. Inoltre tale modello permette di apprezzare che la regolazione adenosinergica delle cellule immunitarie è fondamentale nel normale controllo fisiologico dell'infiammazione in vivo nonostante il fatto che
36 siano presenti altri recettori accoppiati a proteine G e ligandi che innalzano il cAMP come le catecolamine, le prostaglandine, la dopamina e istamina. [60]
Infine è interessante notare che l' A2A AR ha dimostrato di essere coinvolto nella promozione della guarigione delle ferite e nell'angiogenesi. [62, 63]
A2A AR svolge un ruolo attivo nella patogenesi della fibrosi dermica, suggerendo un ruolo per gli antagonisti come nuovo approccio terapeutico nel trattamento e nella prevenzione della fibrosi dermica e di malattie come lo scleroderma. [64]
1.5.1 Stiril-xantine
La 1,3-dipropil-7-metil-8- (3,4-dimetossistiril) xantina 17 (KF17837) è stato il primo antagonista di A2A AR in questa classe chimica di composti. [65]
La 3-clorostirilicaffeina 18 (CSC) è meno potente di KF17837 ma mostra una selettività migliore per il sottotipo A1 AR. [66]
L’introduzione di un propargile in posizione 1 in combinazione con il gruppo 8-stirilico nel composto 19 (BS-DMPX) aumenta l’affinità per A2A con ritenzione della selettività. [67]
La 1,3-dietil-7-metil-8-(3,4-dimetossistiril)xantina 20 (KW-6002, anche
denominata istradefillina) è una 8-stirilxantina con alta affinità per il A2A AR di ratto; a causa della sua elevata affinità e selettività, un derivato radiomarcato, [11C]-KW-6002 marcato alla posizione O-metilica aromatica, è stato sviluppato per essere utilizzato per tracciare A2A in vivo. [68, 69]
Recentemente, KW-6002 (il composto 20) è stato selezionato per gli studi clinici di fase III per il trattamento del morbo di Parkinson. Tuttavia, questo composto presenta problemi metabolici e scarsa fotostabilità in forma solida e pertanto la sua approvazione è stata declinata dalla FDA nel 2008. [70]
37 N N N H N O O OCH3 OCH3 N N N N O O Cl 17KF-17837 18CSC N N N N O O Br N N N N O O OCH3 OCH3 19BS-DMPX 20 KW-6002
Figura 1.5.1.1. Antagonisti dell'AR A2A (stiril-xantine)
1.5.2 Derivati della 9H-Purina
Sulla base della modellazione molecolare di un certo numero di potenti antagonisti adenosinici, Minetti et al., hanno progettato e sintetizzato una serie di derivati purinici 2-alchil-sostituiti come antagonisti per A2A. [70]
Il composto 21 ST-1535 (2-n-butile-9-metil-8-[1,2,3]triazol-2-il-9H-purin-6-ilammina), è stato il più interessante.
N N N N N N N NH2 21
38
1.5.3 Derivati biciclici
Negli anni passati diversi ricercatori hanno focalizzato la loro attenzione sui derivati azotati biciclici caratterizzati dal nucleo 1,2,4-triazolico fuso con l'anello piridinico, pirimidinico o tiazolico, in cui l'atomo di azoto è condiviso dai due anelli. In particolare il composto 22, ZM 241385, è risultato uno dei più potenti antagonisti per A2A mai riportati, con idrosolubilità favorevole. Sebbene diversi sostituenti possano essere introdotti nel sistema biciclico, l'attività antagonista aumenta quando un sostituente 2-furilico viene introdotto sul carbonio del nucleo triazolico e gruppi anilinici e amminici liberi o sostituiti sono presenti sull'anello esagonale.[70]
Modifiche delle caratteristiche farmacocinetiche di questo tipo di derivati possono essere ottenute mediante l'introduzione di un sostituente ossidrilico o amminico sul gruppo arilico o di vari sostituenti sulla posizione 5; soprattutto il derivato 23 ha mostrato grande potenza e selettività per A2A rispetto a A1 AR. Diversi isosteri del nucleo triazolo-triazinico sono stati sintetizzati; in particolare alcune oxazolo-pirimidine (composto 24) e triazolo-pirazine (composti 25 e 26) hanno mostrato una buona potenza per A2A ed una buona selettività rispetto a A1 AR. [70] N N N N N O NH2 N H HO N N N N N O NH2 N N O F 22 ZM241385 23
39 N N N N N O NH2 H N HO O N N N N N O NH2 N 24 25
Figura 1.5.3.1 Antagonisti per A2A (derivati bi-eterociclici)
1.5.4 Pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pirimidine
La 9-cloro-2-furan-2-il-[1,2,4]triazolo[1,5-c]chinazolin-5-ilammina, denominata CGS-15943 (composto 26) è stato il primo antagonista per il sottotipo A2A, potente ma scarsamente selettivo. [71]
La sostituzione bioisosterica dell'anello fenilico del CGS-15943 con un pirazolo-N7-sostituito ha portato al primo esempio di un antagonista dell'adenosina che mostra il nucleo pirazolotriazolo-pirimidinico, denominato 8-FBPTP (composto
27,
8-(4-fluorobenzil)-2-(2-furil)-8H-pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c]pirimidin-5-ammina). [72]
I requisiti strutturali essenziali di questo composto per l'affinità A2A sono la porzione furilica ed il gruppo amminico libero in posizione 5. Partendo da queste osservazioni, Baraldi et al. [73, 74] hanno focalizzato il loro interesse sull’anello pirazolico, preservando gli altri elementi strutturali. Diversi sostituenti alchilici, arilici e fenilalchilici sono stati introdotti in entrambe le posizioni N7 e N8. I dati biologici delle molecole ottenute hanno indicato che i migliori radicali erano catene fenilalchiliche e, tra questi, la lunghezza del distanziatore introdotto tra l'anello fenilico e l'azoto pirazolo è stata ottimizzata a due o tre atomi di carbonio. Due composti selezionati di questa famiglia, denominati SCH-58261 (composto 28, 5-ammino-7-(β-feniletil)2-(2-furil)-pirazolo[4,3-e] 1,2,4]triazolo-[1,5-c]pirimidina) e SCH-63390 (29,
5-ammino-7-(3-fenilpropil)2-(2-furil)-40 pirazolo[4,3-e][1,2,4]triazolo[1,5-c] pirimidina) [73, 74] si sono dimostrati antagonisti di A2A potenti e selettivi, sia nel ratto che nei modelli umani. È stato anche notato che i derivati N7-sostituiti erano più selettivi per A2A AR rispetto ai corrispondenti N8-analoghi.
Dalla famiglia dei composti SCH, il 5-ammino-7-(3-(4-metossifenil)propil)-2-(2-furil)pirazolo[4,3-e]-1,2,4-triazolo[1, 5-c]pirimidina (SCH-442416, composto 30) è stato selezionato per lo sviluppo di un nuovo ligando per la tomografia ad emissione di positroni (PET), in quanto la sua struttura chimica consente una facile introduzione di un gruppo metilico mediante O-alchilazione diretta della funzione fenolica con [11C]CH3I in condizioni alcaline. [75]
Lo scopo di questo studio si basa sull’utilizzo di *11C]SCH-442416, il composto 30, come nuovo ligando per l'imaging in vivo di A2A usando PET. L’affinità di legame in vitro nel cervello e nella periferia, il buon rapporto segnale-rumore osservato tra 5 e 15 minuti dopo l'iniezione e la bassa presenza di metaboliti radioattivi hanno indicato che [11C]SCH-442416 rappresenta il primo ligando non-xantinico adatto per l'imaging in vivo di A2A utilizzando PET.. [75]
1.5.5 Antagonisti del recettore A2A solubili in acqua
La principale restrizione degli antagonisti triciclici era la bassa solubilità in acqua che limita il loro screening farmacologico. A partire da questo limite Baraldi et al. [74, 76]
hanno descritto una seconda generazione di pirazolo-triazolopirimidine contenenti sostituenti ossigenati sulle catene fenilalchiliche in posizione 7 (composti 31-34). Il composto 31 mostrava il miglior valore dell'affinità per A2A, suggerendo che il gruppo 4-idrossi influenza positivamente l'interazione con il recettore, anche se la sua presenza nella molecola non è sufficiente per raggiungere un buon profilo di solubilità in acqua.
