Profili di espressione genica dei tumori colorettali con instabilità microsatellitare: focus sui geni immuno-correlati

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Dipartimento di Ricerca Traslazionale e delle Nuove Tecnologie in Medicina e Chirurgia

Corso di Laurea Magistrale in Medicina e Chirurgia

TESI DI LAUREA

Profili di espressione genica dei tumori colorettali con

instabilità microsatellitare: focus sui geni immuno-correlati

Candidata

Relatore

Margherita Ambrosini

Chiar.mo Prof. Alfredo Falcone

Correlatrice

Dott.ssa Chiara Cremolini

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Sommario

Riassunto

... 5

Capitolo 1. Il tumore del colon-retto (CRC) ... 7

1.1 Epidemiologia ... 8

1.2 Fattori di rischio ...10

1.2.1 Fattori di rischio non modificabili ...11

1.2.2 Fattori di rischio modificabili ...16

1.2.3 Fattori protettivi ...19

1.3 Screening ...19

1.4 Cenni di anatomia patologica ...22

1.5 Patogenesi ...24

1.6 Presentazione clinica e diffusione ...28

1.7 Diagnosi ...31

1.8 Stadiazione e Prognosi ...33

Capitolo 2. Trattamento del tumore del colon-retto ... 37

2.1. Trattamento della malattia localizzata nei tumori del colon e del retto intraperitoneale ...37

2.1.1. Trattamento chirurgico ...37

2.1.2. Chemioterapia adiuvante ...40

2.2. Trattamento della malattia localizzata nel tumore del retto extraperitoneale .47 2.2.1. Trattamento chirurgico ...47

2.2.2. Terapia neoadiuvante e adiuvante nel tumore del retto extraperitoneale .48 2.3. Trattamento della malattia avanzata ...50

2.3.1. Principi generali ...50

2.3.1.1. Valutazione della resecabilità ...51

2.3.1.2. Fattori molecolari ...53

2.3.1.3. Sede del tumore primitivo ...57

2.3.2. Trattamento farmacologico della malattia avanzata non resecabile e metastatica ...60

2.3.2.1. I farmaci citotossici ...60

Terapia con doppiette ...61

Terapia con tripletta ...64

Monochemioterapia ...65

Chemioterapia nel trattamento della malattia refrattaria ...66

2.3.2.2. I farmaci a bersaglio molecolare ...66

Farmaci anti-angiogenici ...66

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Aflibercept e ramucirumab ...74

Regorafenib ...75

Farmaci anti-EGFR ...75

2.4. Scelta della strategia terapeutica nel paziente con malattia avanzata: un algoritmo ...86

Capitolo 3. Profili di espressione genica dei tumori colorettali con instabilità microsatellitare: focus sui geni immuno-correlati ... 90

3.1. Background e razionale ...90 3.2 Materiali e metodi ... 101 3.3 Risultati ... 105 3.4. Discussione ... 122 3.5. Conclusioni ... 124 Bibliografia ... 125

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Riassunto

Negli ultimi anni, i miglioramenti nell’ambito dello screening, della diagnosi e della gestione terapeutica personalizzata hanno determinato un netto miglioramento della prognosi dei pazienti con carcinoma colorettale (CRC).

Complessivamente, nel trattamento del tumore del colon-retto metastatico sono molteplici le opzioni di cura oggi disponibili, comprendenti trattamenti locoregionali (chirurgia, radioterapia, ablazione) integrati con terapie sistemiche; la scelta della strategia ottimale deve essere condivisa fin da subito da un team multidisciplinare e individualizzata sul singolo paziente in base alle caratteristiche cliniche e tumorali. La ricerca oncologica è quindi molto impegnata nell’individuazione di fattori prognostici e predittivi, sia dal punto di vista clinico che patologico-molecolare. Nello specifico, per quanto riguarda i tumori del colon-retto, essi possono essere raggruppati sulla base di talune specifiche caratteristiche molecolari che ne determinano diversa sensibilità ai vari trattamenti oltre che diversa prognosi. L‘instabilità dei microsatelliti (MSI-H), in particolare, alterazione dovuta a difetti nel sistema del mismatch repair (MMR), è al momento oggetto di estremo interesse scientifico, data l’evidenza di una sua correlazione con una maggiore sensibilità ai trattamenti immunologici. Le forme MSI-H risultano essere circa il 15% nello stadio II-III e il 4-5% nello stadio IV. I tumori colorettali MSI-H hanno caratteristiche peculiari e specifiche da un punto di vista clinico, istologico e molecolare: sono più frequentemente localizzati nel colon di destra e diagnosticati in giovane età ed ad uno stadio più precoce rispetto alle altre forme stabili; sono più spesso caratterizzati da un istotipo mucinoso e da una peculiare elevata infiltrazione linfocitaria intra-tumorale correlata ad una spiccata risposta immunitaria anti-intra-tumorale, oltre che dall’elevata frequenza della mutazione V600E del gene BRAF. L’instabilità dei microsatelliti ha anche importanti correlazioni prognostiche e predittive. Considerati gli stadi precoci di malattia, questi tumori hanno buona prognosi e verosimilmente non traggono beneficio da un trattamento adiuvante con le sole fluoropirimidine, mentre nello stadio di malattia metastatica hanno una prognosi più sfavorevole con una minore chemiosensibilità rispetto ai tumori stabili e una probabile resistenza al trattamento con alcuni farmaci a bersaglio molecolare, nello specifico gli anti-EGFR. Tuttavia, nello stadio avanzato, è molto promettente l’utilizzo di farmaci

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6 immunoterapici o checkpoint-inibitori. La loro efficacia, già dimostrata in alcuni studi di fase I-II, ha il suo razionale biologico nella presenza di un elevato carico mutazionale dei tumori MSI-H con conseguente presenza di numerosi neo-antigeni che determinano attivazione di una risposta immunitaria anti-tumorale ed una elevata infiltrazione linfocitaria. Lo studio di fase II multicentrico CheckMate-142 ha valutato, in due coorti separate di pazienti con CRC metastatico (mCRC) MSI-H/dMMR pretrattato con chemioterapia, l’efficacia del farmaco immunoterapico nivolumab (anticorpo monoclonale anti-PD-1) e della combinazione di nivolumab e ipilimumab (anti-CTLA4), mentre lo studio di fase II KEYNOTE-164 ha valutato, in pazienti con caratteristiche simili, l’efficacia di pembrolizumab (anti-PD-1). I risultati emersi da questi studi sono molto incoraggianti riguardo l’efficacia dell’immunoterapia in questo sottogruppo di pazienti. Tuttavia, ad una analisi più attenta, si può notare come solo circa la metà dei pazienti trattati con gli anti-PD1 e il 70% di quelli trattati con la combinazione dei due immunoterapici tragga un beneficio realmente significativo dalla terapia somministrata. Questo porta a pensare che i CRC MSI-H/dMMR possano costituire, in realtà, un gruppo eterogeneo di tumori che si differenziano per il diverso microambiente immunitario associato. Quest’ultima ipotesi è sostenuta anche da osservazioni sul melanoma, un altro tumore con elevato carico mutazionale e buona risposta all’immunoterapia, che hanno riconosciuto la presenza di due fenotipi differenti: un fenotipo tumorale “infiammato”, con spiccata attivazione immunitaria e un fenotipo “non infiammato”, che invece non la presenta, i quali sembrano correlare rispettivamente in modo positivo e negativo con la risposta all’immunoterapia.

Sulla base di tali considerazioni l’intento del nostro studio è stato quello di valutare il profilo immunitario dei tumori colorettali MSI-H/dMMR attraverso l’analisi dell’espressione dell’mRNA relativo a geni immuno-correlati utilizzando la piattaforma genica nanoString. Il risultato dell’analisi ha confermato come i tumori CRC MSI-H/dMMR costituiscono un gruppo eterogeneo di neoplasie dal punto di vista del microambiente immunitario. Dalla valutazione quantitativa complessiva dei geni maggiormente significativi in termini di differenza di espressione tra i vari campioni (o deregolazione) è stato possibile costruire un classificatore in grado di distinguere in modo dicotomico i CRC dMMR/MSI-H in due gruppi: i tumori cosiddetti COLD, che mostrano una significativa down-regolazione dei geni correlati

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7 al sistema immunitario, e i tumori cosiddetti NOT COLD, che, al contrario, mostrano una up-regolazione completa o parziale di questi geni. I tumori COLD rispetto ai NOT COLD si differenziano inoltre per caratteristiche cliniche, presentandosi più frequentemente negli stadi più avanzati di malattia e a livello del colon sinistro, di espressione genica, mostrando una netta deregolazione di numerosi geni immuno-correlati, nella densità delle popolazioni cellulari associate, in particolare presentando un numero minore di linfociti infiltranti il tumore (TILs), cellule citotossiche, macrofagi, cellule T, mastociti, cellule T CD8+ e cellule B, e, infine, nella prognosi, essendo la sopravvivenza globale inferiore, considerando sia la totalità dei pazienti, sia i pazienti con malattia metastatica.

Le differenze nell’espressione dei geni relativi alle funzioni del sistema immunitario e quelle clinico-patologiche riscontrate tra questi due gruppi suggeriscono che, benché parte dello stesso sottogruppo molecolare, essi possano non beneficiare allo stesso modo dell’immunoterapia. Queste considerazioni, che dovranno essere ulteriormente confermate e validate, ci indicano la possibilità, in futuro, di selezionare tra i pazienti con CRC MSI-H/dMMR, quelli che potranno verosimilmente beneficiare del trattamento immunoterapico e quelli in cui questi tipi di farmaci non rappresentano la strategia ottimale.

Un’ulteriore prospettiva futura potrebbe essere quella di valutare l’applicazione di questo classificatore nei tumori colorettali stabili e nei tumori non colorettali, al fine di individuare potenziali pazienti responsivi all’immunoterapia anche in questi gruppi.

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Capitolo 1. Il tumore del colon-retto (CRC)

1.1 Epidemiologia

Il cancro del colon-retto (CRC) è la terza neoplasia maligna più frequentemente diagnosticata e la quarta causa di morte per cancro nel mondo, avendo comportato, sulla base delle ultime stime Globocan, circa 1,4 milioni di nuovi casi e circa 700'000 morti nel 2012. Rappresenta la terza neoplasia per incidenza negli uomini (746'000 casi, 10,0% del totale) e la seconda nelle donne (614'000 casi, 9,2% del totale). 1

Considerato l’andamento temporale e le proiezioni demografiche, ci si aspetta che il peso mondiale del CRC aumenti fino a determinare 2,2 milioni di nuovi casi e 1,1 milioni di morti nel 2030.2

La distribuzione del cancro del colon-retto nel mondo è variabile, con più di due terzi dei casi e circa il 60% delle morti totali verificantesi nei Paesi con un alto o molto alto indice di sviluppo umano (HDI).2 I tassi di incidenza più alti si registrano in

Australia e Nuova Zelanda (tasso standardizzato per età di 44.8 e 32.2 ogni 100’000 abitanti in uomini e donne, rispettivamente) e i più bassi in Africa occidentale (4,5 e 3,8 ogni 100'000 abitanti), mentre i più alti tassi di mortalità sono concentrati in Europa Centrale e Orientale (20,3 ogni 100’000 abitanti negli uomini e 11,7 ogni 100'000 abitanti nelle donne).1

Questa sua distribuzione è considerata un segno evidente della cosiddetta “cancer transition”, fenomeno per il quale nei Paesi maggiormente sviluppati si è assistito a una diminuzione di incidenza delle forme di cancro associate alle infezioni contestualmente all’aumento di quelle classicamente legate allo stile di vita occidentale, per un maggior consumo di alcol, dieta squilibrata, inattività fisica e abitudine al fumo condizioni già più frequenti nei Paesi ad alto reddito.2

A causa di questo fenomeno al giorno d’oggi si osserva un aumento di incidenza e di mortalità del CRC soprattutto in Europa Orientale, Asia e Sud America, mentre al contrario negli Stati Uniti, Australia, Nuova Zelanda e in diversi paesi dell’Europa Occidentale incidenza e mortalità si sono stabilizzate o sono in diminuzione.3

Questa diminuzione della mortalità negli Stati Uniti, Australia e Nuova Zelanda per buona parte riflette anche l’incremento del numero di diagnosi precoci effettuate grazie alle metodiche di screening e il possibile conseguente trattamento precoce e

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9 preventivo mediante polipectomia dei polipi adenomatosi, precursori del CRC; inoltre il miglioramento dei trattamenti peri-operatori, sia chemio che radio terapici, può aver contribuito alla diminuzione della mortalità in questi paesi a più alto reddito.2

In Italia, escludendo i tumori della cute non-melanoma, i tumori del colon-retto sono in assoluto i più frequenti (13% dei nuovi tumori diagnosticati all’anno in entrambi i sessi) rappresentando la seconda neoplasia più frequente sia negli uomini (dopo i tumori della prostata), sia nelle donne (dopo il tumore della mammella). Secondo le stime più recenti di AIOM-AIRTUM-Fondazione AIOM in Italia, nel 2017, sono stati diagnosticati circa 53’000 nuovi casi di tumore del grosso intestino.4

Complessivamente i tumori del colon-retto rappresentano la seconda causa di morte per neoplasia in entrambi i sessi (11% del totale dei decessi per tumore registrati in Italia nel 2013, pari a circa 19.000 eventi). I dati ISTAT indicano per il 2013 poco meno di 18’800 decessi attribuibili a tumori del colon-retto. Mentre fino agli anni Duemila i tassi di mortalità mostravano un aumento lieve e non significativo, dal 2005 in poi si è registrata una riduzione statisticamente significativa (2% annuo) sia nei maschi che nelle femmine.5

Oltre alla distribuzione geografica anche sesso, età e razza influenzano l’incidenza e la mortalità del CRC. Queste sono infatti entrambe più elevate, rispettivamente del 30% e del 40%, negli uomini rispetto alle donne, nonostante il rischio di sviluppare il tumore nell’arco della vita sia simile (4,6% contro 4,2%). Questa differenza varia inoltre con l’età: ad esempio, mentre non vi è molta differenza nell’incidenza tra sesso maschile e femminile fino a 40 anni, la differenza è molto accentuata tra i 55 e i 74 anni, quando il rischio è superiore nell’uomo del 50%. Probabilmente questo riflette una diversa esposizione ed interazione, complessa e non ben compresa, dei fattori di rischio nei due sessi.6

I tassi di incidenza e mortalità sono tendenzialmente maggiori nella razza nera rispetto alla bianca. Tra il 2009 e il 2013 il tasso di incidenza nella razza nera è stato del 20% superiore rispetto alla bianca, mentre la disparità dei tassi di mortalità è addirittura doppia di quella dell’incidenza (40% tra il 2010 e il 2014). Si pensa che queste differenze siano dovute al differente livello socio-economico tra le due razze, più basso nella popolazione afroamericana, con maggiore prevalenza di fattori di

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10 rischio quali obesità, dieta squilibrata e fumo, oltre al minore accesso alle metodiche di screening e trattamento precoce.6 È forte l’evidenza che nei soggetti di razza

nera, inoltre, più raramente viene ricevuto un adeguato trattamento sia chirurgico che radio e chemioterapico. A parità di trattamento ricevuto, la sopravvivenza nella razza nera è comunque più bassa, a fronte della stessa risposta alla terapia.7 Non

è chiaro se la differenza rifletta anche una diversità nei fattori biologici del tumore stesso.8

A livello globale, la sopravvivenza a 5 anni del CRC oscilla tra il 28% e il 42% nei Paesi in via di sviluppo, mentre supera il 60% negli Stati Uniti, Giappone e Svizzera.9

Il tasso di sopravvivenza negli Stati Uniti è del 65% a 5 anni dalla diagnosi e del 58% a 10 anni. La sopravvivenza differisce in base allo stadio di malattia alla diagnosi: il 39% di tutti i pazienti vengono diagnosticati ad uno stadio precoce di malattia e per questi la sopravvivenza a 5 anni è del 90%, mentre diminuisce al 71% e al 14% per i pazienti diagnosticati con malattia localmente avanzata o metastatica, rispettivamente. Nello specifico, il cancro del retto è diagnosticato più frequentemente ad uno stadio localizzato, poiché i sintomi appaiono più precocemente. La sopravvivenza globale relativa a 5 anni dalla diagnosi è lievemente superiore per il cancro del retto (67%) rispetto al cancro del colon (64%).6

Altri fattori che contribuiscono alle variazioni nella sopravvivenza sono: l’accessibilità allo screening, la possibilità di ricevere un trattamento di qualità e le eventuali comorbidità del paziente.9 In particolare, nello stadio localizzato si è

evidenziato un incremento di sopravvivenza a 5 anni, passando dal 55.2% al 73.0% per il colon e dal 45.2% al 69.2% per il retto, grazie all’introduzione, a partire dalla metà degli anni ’80, della chemioterapia adiuvante.10 Allo stesso modo, nella

malattia metastatica, i progressi raggiunti con le tecniche di resezione e ablazione delle metastasi, le nuove terapie mediche e le migliori indagini radiologiche hanno migliorato la sopravvivenza a 1 e 2 anni dalla diagnosi dal 35.9% al 52% e dal 16% al 33% negli ultimi venti anni. 11

1.2 Fattori di rischio

Il rischio di sviluppare un CRC nella popolazione generale dei Paesi Occidentali è di circa il 5%.12

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11 Oltre alla razza e all’età, già precedentemente menzionati, i principali fattori di rischio conosciuti per il CRC sono la predisposizione genetico-familiare e i fattori ambientali e possono dunque essere distinti in modificabili e non modificabili.

1.2.1 Fattori di rischio non modificabili

I fattori di rischio non modificabili sono l’ereditarietà genica e la storia clinica personale; in particolare, una storia personale o familiare di CRC o di polipi adenomatosi, ma anche una storia personale di malattie infiammatorie croniche intestinali di lunga data. L’importanza di questa componente di rischio si riflette anche nella pratica clinica: individui con tali fattori, sia di ereditarietà familiare che personali, dovrebbero iniziare i programmi di screening prima dei canonici 50 anni. Circa il 30% dei pazienti con CRC ha una storia familiare della malattia, il 5% dei quali dovuto a specifiche alterazioni genetiche ereditate. Le conoscenze nell’ambito della familiarità dei CRC sono molto aumentate negli ultimi anni: si pensa che le forme di CRC che presentano familiarità possano essere in alcuni casi dovute all’interazione tra i fattori di rischio ambientali e l’effetto cumulativo di varie alterazioni geniche relativamente comuni, anche se non precisamente identificabili, che sono associate ad un modesto aumento del rischio, mentre in altri casi a sindromi ereditarie determinate da specifiche mutazioni geniche ad alta penetranza, molto più rare, ma che influenzano con forza maggiore il rischio di sviluppare la malattia.7

Per quanto riguarda le forme familiari, esse comportano un aumento del rischio di sviluppare la malattia di 2-4 volte negli individui con un parente di primo grado (genitore, fratello o sorella, figlio/a) a cui è stato diagnosticato un CRC rispetto agli individui con storia familiare negativa. Il rischio aumenta maggiormente se è presente più di un parente di primo grado con diagnosi di cancro del colon o se la diagnosi è avvenuta a una età inferiore ai 60 anni. Studi recenti indicano che il rischio familiare si estende, inoltre, anche oltre i parenti di primo grado13. Il rischio è

infine leggermente superiore tra gli individui con un parente di primo o secondo grado a cui è stato diagnosticato un adenoma colico, precursore del CRC14.

Per quanto riguarda le sindromi ereditarie associate al CRC le due principali sono la Sindrome di Lynch (LS o HNPCC, Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer) e la Poliposi adenomatosa familiare (FAP). La più comune tra queste è la Sindrome

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12 di Lynch, responsabile del 2-4% di tutti i casi. Oltre ad un aumento del rischio di sviluppare un CRC gli individui con LS hanno anche un aumento del rischio di sviluppare altre forme di cancro tra cui quello endometriale, ovarico, del piccolo intestino, stomaco, encefalo, ureteri, vie epatobiliari e cute. Si distinguono due forme di Sindrome di Lynch: nella prima (tipo I) l’aumentato rischio di neoplasie si ripercuote soltanto a livello colorettale, con prevalente localizzazione a livello prossimale e frequente riscontro di numerosi tumori primitivi concomitanti a livello colico, mentre nella forma di tipo II si sviluppano più frequentemente neoplasie extracoliche, tra cui il carcinoma dell'endometrio, tumori del tratto urinario e del sistema biliare. Circa il 18% degli uomini e il 19% delle donne con HNPCC svilupperanno un CRC entro i 50 anni, il 45% e il 54% rispettivamente entro i 70 anni; l’età media di diagnosi è tra i 45 e 50 anni.15 Il tumore dunque tende a

comparire ad una età più precoce rispetto a quella delle forme sporadiche, inoltre tende a essere più frequentemente localizzato a destra.7 La HNPCC è causata da

mutazioni ereditarie nei geni riparatori dei mismatch (MMR), ovvero geni che codificano per le proteine responsabili dell’identificazione, escissione e riparazione degli errori dell’appaiamento di basi che si verificano durante la replicazione del DNA. Tra gli almeno cinque geni riparatori (MLH1, MSH2, MSH3, MSH6, PMS2) i due più frequentemente mutati sono MLH1 e MSH2, mentre meno frequenti sono le alterazioni a carico di MSH6 e PMS2; nel complesso le mutazioni germinali in questi 4 geni rendono conto del 95% delle forme di HNPCC.16 Nell’ambito della sindrome

la mutazione genica ereditata è a carico di un solo allele; nel momento in cui viene perso o mutato anche l’altro allele si accumulano rapidamente mutazioni a carico del DNA cellulare, con velocità fino a 1000 volte superiore al normale, soprattutto in particolari regioni contenenti brevi sequenze ripetute di DNA chiamate microsatelliti, determinando il fenomeno della “instabilità dei microsatelliti” (si veda il paragrafo “Patogenesi”).15

Oggi, in ragione della possibile diagnosi precoce e prevenzione delle forme tumorali, vi è un interesse sempre maggiore nella ricerca delle migliori metodiche per l’identificazione di questa sindrome, soprattutto perché spesso la diagnosi non viene fatta fino a che non si sviluppa il tumore, e il rischio non è correlato solo all’insorgenza del CRC ma anche ad altri tumori.17-18 Un’accurata anamnesi

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13 familiare e personale rimane la strategia più importante per identificare famiglie con sindromi ereditarie correlate allo sviluppo del cancro.7

Il sospetto di Sindrome di Lynch può essere posto sulla base dei criteri di Amsterdam (modificati nel 1999), o dei criteri di Bethesda (modificati nel 2004). Criteri di Amsterdam:

• Diagnosi di CRC o di tumori extracolici associati alla LS prima dei 50 anni di età;

• Tre o più familiari, di cui almeno uno di primo grado, con diagnosi di tumore associato alla LS verificato istologicamente;

• Tumori associati alla LS che coinvolgono almeno due generazioni; • Esclusa diagnosi di FAP se presente CRC;

Criteri di Bethesda:

• Soggetto affetto da CRC di età < 50 anni

• Presenza di CRC o altri tumori associati alla LS sincroni o metacroni, a qualunque età

• CRC con fenotipo istopatologico MSI-H in soggetto di età <60 anni

• Paziente con CRC ed un parente di I grado di un paziente affetto da tumore associato alla LS; uno dei tumori deve essere diagnosticato ad un’età <50 anni

• Paziente con CRC con due o più parenti di I grado con tumori associati alla LS, indipendentemente dall’età

Per una diagnosi definitiva di LS è poi necessario il riscontro di una mutazione germinale nei geni del mismatch repair (MMR).

Oggi le linee guida NCCN19 raccomandano di eseguire il test di screening dei difetti

del sistema MMR (dMMR) per l’identificazione della Sindrome di Lynch in tutti i pazienti con nuova diagnosi di CRC, al fine di massimizzare la sensibilità di diagnosi della sindrome e, nel caso, poter procedere all’adeguata sorveglianza. In alternativa, in accordo con le evidenze presenti, lo screening può essere limitato ai pazienti con CRC con età <70 anni e a coloro con età > 70 anni che rientrano nei criteri Bethesda.

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14 Il test di screening al momento più utilizzato si basa sulla ricerca immunoistochimica (ICH) nel tessuto tumorale delle proteine codificate dai 4 geni del sistema MMR più frequentemente associati alla Sindrome di Lynch: MLH1, MSH2, MSH6, PMS2. Il test è positivo quando almeno una delle proteine è assente, suggerendo che la mancata espressione genica possa essere dovuta a una mutazione germinale. Nel caso in cui il test ICH sia positivo per la proteina MLH1 (ovvero la proteina non è espressa) dovrebbe essere ricercata la mutazione V600E di BRAF, la cui presenza esclude la diagnosi di Sindrome di Lynch in favore della diagnosi di tumore sporadico, mentre la sua assenza, ovvero il riscontro di fenotipo BRAF wild type, pone indicazione a consulenza genetica. In aggiunta, in caso di fenotipo BRAF wild type è possibile eseguire il test per la ricerca dell’ipermetilazione del promotore di

MLH1 che ha significato analogo alla presenza della mutazione V600E.È da

considerare che la percentuale di falsi negativi nel test immunoistochimico è del 5-10%, per cui in presenza di un forte sospetto clinico per la LS è giustificato considerare la valutazione genetica indipendentemente dal risultato del test.

In alternativa all’analisi ICH può essere eseguita l’analisi MSI con tecnica di amplificazione con PCR (Polymerase Chain Reaction) che utilizza un particolare pannello costituito da cinque microsatelliti che vengono usati come markers, al fine di trovarvi eventuali variazioni di lunghezza, segno di instabilità. Il pannello comprende due ripetizioni mononucleotidiche (BAT-25 e BAT-26) e tre ripetizioni dinucleotidiche (D2S123, D5S346 e D17S250; tumori con instabilità di due o più loci analizzati sono definiti ad alta instabilità (MSI-H); quelli con un singolo locus alterato sono detti a bassa instabilità (MSI-L); tumori senza alterazioni sono stabili (MSS). Questo pannello è conosciuto come “Bethesda Panel”.20

L’altra più comune sindrome genetica di predisposizione è la Poliposi Adenomatosa Familiare (FAP), responsabile di meno dell’1% di tutti i casi di CRC. Si caratterizza per lo sviluppo di almeno centinaia fino a migliaia di polipi adenomatosi colorettali, indistinguibili morfologicamente da quelli sporadici, più frequentemente di tipo tubulare, che compaiono a partire dai 10-12 anni d’età fino a quella di circa 66 anni.21 Senza intervento il rischio di sviluppare il cancro è del 100% entro l’età di 40

anni.22 La mutazione genica ereditata è a carico del gene oncosoppressore APC

(adenomatous poliposis colon), alla quale segue un’iper-stimolazione della proliferazione cellulare, che talvolta può manifestarsi anche spontaneamente,

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15 motivo per cui la FAP può ritrovarsi anche in persone che non hanno una storia familiare positiva per la malattia, costituendo forme sporadiche di tumore. Esiste una forma di FAP attenuata (aFAP), che si caratterizza per l’insorgenza di meno di cento polipi ad una età più tardiva, nonostante il rischio di sviluppare il CRC rimanga alto. La FAP inoltre presenta due varianti associate a specifiche mutazioni di APC che clinicamente si associano ad altre manifestazioni extraintenstinali: la Sindrome di Gardner con multipli osteomi, cisti epidermiche, tumori desmoidi e della tiroide e la Sindrome di Turcot (più rara) con tumori del sistema nervoso centrale quali gliomi.15

Un’altra sindrome affine alla FAP è la MAP (MUTYH-associated poliposis), che comporta un numero di polipi simile a quello della forma attenuata della FAP e ha caratteristiche cliniche molto più variabili.

La poliposi giovanile e la Sindrome di Peutz-Jeghers sono altre due sindromi associate a poliposi del colon e che possono comportare un rischio, sebbene minore rispetto a quello della FAP, di sviluppare un CRC. I polipi che si sviluppano in queste due sindromi sono di tipo amartomatoso. La poliposi giovanile si caratterizza per l’insorgenza di almeno 5 polipi che possono trovarsi in tutto il tratto gastrointestinale, non solo nel colon, e nel 20-50% dei casi è associata a mutazioni germinali nei geni appartenenti alla superfamiglia genica del TGF-β, quali SMAD4 o BMPR1A.23 La

Sindrome di Peutz-Jeghers è una sindrome dovuta alla mutazione del gene STK11, ereditato per via autosomica dominante, che si caratterizza per la comparsa, a una età media di 11 anni, di polipi amartomatosi multipli gastrointestinali associati a una iperpigmentazione muco-cutanea a livello orale di colorito variabile dal bluastro al marrone, segno utile per sospettare clinicamente la patologia. Il rischio di sviluppare tumori del colon si associa al rischio di sviluppare anche altre neoplasie quali tumori del pancreas, mammella, polmone, ovaio.15

Nell’ambito delle patologie cliniche che aumentano il rischio di sviluppare conseguentemente un CRC, che generalmente si verifica in giovane età, ci sono le malattie infiammatorie croniche intestinali, ovvero il Morbo di Chron, la Retto Colite Ulcerosa e la Colite Indeterminata, nelle quali l’organo è sottoposto ad infiammazione per un lungo periodo di tempo, condizione che incrementa di circa

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16 due volte il rischio rispetto alla popolazione generale.24 Il rischio è strettamente

correlato all’estensione dell’interessamento colico, alla durata e alla gravità della malattia, ma è diminuito ad oggi grazie al miglior controllo medico dell’infiammazione e alla sorveglianza clinica della eventuale degenerazione neoplastica riscontrabile nelle lesioni premaligne.7

1.2.2 Fattori di rischio modificabili

L’impatto dei fattori di rischio modificabili, in particolare dei fattori ambientali comportamentali, emerge da molti studi, recentemente è stato infatti dimostrato come un peso adeguato, esercizio fisico regolare, consumo limitato di alcol e una dieta salutare riducano il rischio di sviluppare il CRC di più di un terzo (37%)2.

Questi fattori sono detti modificabili poiché la loro presenza dipende dalla volontà umana e sono dunque potenzialmente eliminabili. I principali sono l’inattività fisica, il sovrappeso e l’obesità, i fattori alimentari, il fumo e l’alcol. Sono dunque quei fattori tradizionalmente associati con lo stile di vita dei paesi ad alto reddito, cioè lo stile di vita “occidentale”; questa associazione è tanto forte che l’aumento di incidenza del CRC in questi Paesi è considerato un segno della transizione economica.

L’influenza della dieta nell’insorgenza del CRC è suggerita dalle differenze nell’incidenza mondiale del CRC e dal rapido aumento del rischio che colpisce le popolazioni migranti negli Stati Uniti. Questo avviene sia in modo diretto tramite gli alimenti consumati, sia in modo indiretto attraverso l’eccessiva nutrizione e l’obesità. Inoltre la dieta ha anche un’importante influenza sui microrganismi del grosso intestino: si ritiene che la composizione del microbioma intestinale giochi un ruolo importante sia in positivo che in negativo sulla cancerogenesi, mediante l’influenza sulla risposta immune e sull’infiammazione. Tra gli elementi della dieta con comprovata evidenza scientifica di legame con il CRC ci sono l’apporto di fibre, frutta, verdura e carni rosse.7

Una dieta ricca di fibre è molto probabilmente correlata ad una diminuzione del rischio di CRC, costituendo un fattore protettivo per lo sviluppo dello stesso. Infatti, l’alto apporto di fibre favorirebbe una minore esposizione della mucosa intestinale agli agenti cancerogeni in ragione del maggior volume e di un più veloce transito fecale. Tuttavia i risultati degli studi condotti in merito, inclusi quelli da studi controllati e randomizzati, rimangono inconcludenti.25

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17 Frutta e verdura sono in aggiunta ricche di antiossidanti e micronutrienti, come vitamina C, tocoferolo, carotenoidi, glucosinolati (precursori degli istiocinati) e folati, ovvero elementi essenziali per la sintesi, la riparazione e la metilazione del DNA, a lungo studiati come possibili agenti chemoprotettivi.26-27 Anche per quanto riguarda

frutta e verdura i risultati sono contrastanti e l’unico effetto protettivo sembra essere presente se si confronta l’effetto del moderato consumo, che aggiunge piccoli benefici, rispetto al basso consumo26-28. In ogni caso dati i benefici generali di una

dieta ricca di fibre l’American Cancer Society e la World Cancer Research Fund supportano una dieta ad alto contenuto di cereali integrali, frutta e verdura per la prevenzione del cancro.6

Carni rosse e/o trasformate attraverso i processi di salatura, affumicatura o fermentazione aumentano il rischio sia del cancro del colon che del cancro del retto. Nel 2015 la IARC (International Agency for Research on Cancer) ha classificato le carni trasformate come “cancerogene per l’uomo” e le carni rosse come “probabilmente cancerogene per l’uomo”, sulla base dell’evidenza che le correla al rischio di sviluppare il CRC. L’esatto meccanismo con cui questi alimenti influiscono sulla cancerogenesi non è chiaro, ma potrebbe essere correlato all’effetto dei costituenti stessi della carne o ai cancerogeni che si formano durante i processi di cottura ad alte temperature, di fermentazione e di affumicatura.7 La carne cotta ad

alta temperatura contiene amine eterocicliche, delle quali è stato individuato il potenziale effetto mutageno insieme agli N-nitroso composti formatisi in seguito alla sua ingestione nel tratto gastrointestinale. La cottura potenzia la reazione di sintesi di queste sostanze dannose, ed è catalizzata dall’eme contenuto in elevata quantità nelle carni rosse, motivo per cui questi alimenti sono più a rischio rispetto alle carni fresche e al pesce. Il gruppo eme stimola la formazione di radicali liberi che danneggiano il DNA e alterano la normale proliferazione dell'epitelio intestinale. D’altra parte i radicali liberi dell'ossigeno vengono normalmente contrastati da meccanismi endogeni, che possono essere incentivati e potenziati da una dieta ricca di frutta e verdura contenente antiossidanti, ma questo può non essere sufficiente a proteggere il colon dal danno al DNA.29-30

L’attività fisica sembra essere strettamente associata con una riduzione del rischio del cancro del colon, ma non con quello del retto. Studi mostrano che le persone più attive fisicamente hanno un rischio più basso del 25% di sviluppare tumori del

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18 colon sia prossimali che distali rispetto alle persone meno attive; inoltre queste hanno anche una riduzione della mortalità legata al cancro del colon, una volta sviluppatosi. Perfino le persone sedentarie che diventano attive più tardi nella vita potrebbero avere una riduzione del rischio.7 Su questi presupposti l’American

Cancer Society e il Centers for Disease Control and Prevention raccomandano agli adulti di eseguire almeno 150 minuti di attività fisica a moderata intensità o 75 minuti a elevata intensità (o una combinazione di queste) ogni settimana, preferibilmente distribuita omogeneamente.

Come già accennato in riferimento alla dieta, l’eccesso di peso corporeo, comprendente il sovrappeso e l’obesità, aumenta il rischio di CRC, maggiormente negli uomini rispetto alle donne, e maggiormente per i tumori del colon rispetto al retto. Nello specifico un uomo obeso ha un rischio di circa il 50% in più del cancro del colon e di circa il 20% in più di cancro del retto, mentre per una donna obesa il rischio è rispettivamente del 20% in più per il colon e del 10% in più per il retto.31 Il

rischio aggiuntivo determinato dall’obesità è indipendente dalla attività fisica; si ritiene che l’eccesso di peso corporeo abbia un impatto negativo sulla salute metabolica, la quale sottende al funzionamento corretto di tutti i processi biochimici dell’organismo. Studi recenti dimostrano che una non ottimale salute metabolica potrebbe essere correlata all’incidenza del CRC e alla sopravvivenza anche indipendentemente dall’obesità.7

Un consumo moderato o elevato di alcol è associato ad un aumentato rischio di CRC, associazione non valida per il basso consumo (<12,5 grammi al giorno di etanolo, circa una bevanda alcolica al giorno).7 Da alcune metanalisi è emerso che

il consumo medio di 2 o 3 bevande alcoliche al giorno comporta un rischio maggiore di circa il 20% di sviluppare CRC, se confrontato con i non bevitori o con i bevitori occasionali, e che il consumo di più di 3 bevande al giorno comporta circa un rischio maggiore del 40%32. L’associazione è più forte negli uomini rispetto alle donne,

probabilmente per il diverso metabolismo dell’alcol correlato al diverso assetto ormonale.

Nel novembre 2009 la IARC ha segnalato che ci sono sufficienti evidenze per concludere che il fumo di tabacco causi il CRC. L’associazione sembra essere più forte per il cancro del retto rispetto a quello del colon.7 Il fumo è inoltre associato

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19 con una più bassa sopravvivenza specifica per CRC, soprattutto per i fumatori attuali.33

1.2.3 Fattori protettivi

Tra i fattori protettivi troviamo alcuni elementi dietetici quali l’ apporto di vitamina D e di calcio che sembrano essere correlati a un ridotto sviluppo di tumori del colon distale e del retto.34

Molti studi epidemiologici sembrano inoltre suggerire un ruolo protettivo nell’uso di aspirina e FANS35. Sembra inoltre che i pazienti trattati con aspirina e che

successivamente sviluppano un CRC tendano comunque ad avere forme meno aggressive ed una minore mortalità.36 Il meccanismo di tale chemio-prevenzione

non è stato ancora compreso, ma è probabilmente mediato dall’inibizione della ciclossigenasi-2 (COX-2). Questo enzima è iperespresso nell’epitelio neoplastico e sembra regolare l’angiogenesi e l’apoptosi. L’American Cancer Society tuttavia non raccomanda l’uso di questi farmaci per la prevenzione del cancro nella popolazione generale a causa dei potenziali effetti collaterali severi quali il sanguinamento gastrointestinale.

1.3 Screening

Le metodiche di screening rientrano nell’ambito della prevenzione secondaria delle malattie, misura necessaria al fine di effettuare una diagnosi precoce di una lesione tumorale o pretumorale in fase asintomatica, in modo tale da poterne ridurre la mortalità specifica.

Il CRC risponde ai presupposti necessari per l’attuazione di uno screening efficace: è un tumore ad elevata incidenza e mortalità, si manifesta con una lunga fase preclinica identificabile, la diagnosi precoce garantisce possibilità terapeutiche migliori ed è attuabile grazie a un test sensibile, specifico, economico, semplice e non invasivo.

I test attualmente utilizzati per lo screening sono la ricerca del sangue occulto fecale (RSO) e l’endoscopia, il cui scopo è quello di individuare il sanguinamento di polipi o di lesioni tumorali precoci nel primo caso, o di visualizzarli direttamente nel secondo.

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20 I test per la ricerca del sangue occulto nelle feci (RSO) si basano sul presupposto che le lesioni tumorali, sia polipoidi che non, sanguinino, e che il sangue possa essere presente in tracce microscopiche all’interno delle feci. I due tipi di test attualmente disponibili sono i test al guaiaco (gFOBTs: guaiac Fecal Occult Blood Test) e i test immunochimici (FITs o iFOBTs: Fecal Immunochemical Test o immunochemical Fecal Occult Blood Test). In entrambi i casi la raccolta del campione è affidata al paziente tramite un kit fornitogli preventivamente.

Il primo tipo di test ricerca l’attività perossidasica di vari tipi di emoglobina, compresa quella di origine animale e necessita pertanto di una restrizione dietetica nei tre giorni precedenti per evitare falsi positivi. Esso è eseguito su tre campioni fecali consecutivi al fine di ridurre i falsi negativi derivanti da sanguinamenti intermittenti da parte della neoplasia. Il secondo è una metodica immunochimica basata sull’uso di anticorpi diretti specificamente nei confronti dell’emoglobina umana, cosa che lo rende non influenzabile da alimenti e necessita di uno, al massimo due, campioni fecali.

Studi recenti dimostrano una maggiore sensibilità del FIT test rispetto al gFOBT sia per CRC (61-91%) sia per gli adenomi (27-67%), nonostante sia anch’esso aspecifico.37

L’importanza dello screening mediante RSO si evince da un recente e importante studio descrittivo italiano che ha confrontato le regioni in cui sono stati introdotti precocemente (nel 2002-2004) programmi di screening organizzati mediante il test FIT eseguito ogni due anni rispetto a quelle che lo hanno introdotto più tardivamente (nel 2008-2009) con il risultato di riduzione della mortalità specifica per CRC del 22%.38-39

Una alternativa alla RSO è la ricerca del DNA tumorale sul campione fecale, il quale può contenere cellule esfoliate dalle lesioni tumorali e dunque raccolte dalle feci nel passaggio attraverso il lume intestinale. L’unico test approvato dall’FDA è il Cologuard, un FIT-DNA test che ricerca sia la presenza di sangue nelle feci con test immunochimico che alcune sequenze geniche considerate biomarkers per il CRC e per le lesioni polipoidi preneoplastiche in fase avanzata. Ad oggi in Italia, tutti i test che si basano sulla ricerca di marcatori fecali sono considerati ancora sperimentali.40

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21 Il test endoscopico di scelta è la pancolonscopia, considerata completa quando la visualizzazione della mucosa colica giunge fino alla valvola ileo-ciecale. Questa tecnica costituisce una metodica diagnostica estremamente sensibile e specifica, grazie alla possibilità di ispezionare l'intera mucosa colica e di eseguire biopsie. Al tempo stesso costituisce una metodica terapeutica, permettendo la rimozione di polipi sospetti, il cui esame istologico potrà valutare l’eventuale presenza di degenerazione neoplastica e il grado della stessa, interrompendo in questo modo la sequenza che dall’adenoma porta al cancro. Per queste sue caratteristiche è stato attribuito a questo esame endoscopico il ruolo di test ideale, sia per la prevenzione, sia per la diagnosi precoce del CRC, tanto che una sua negatività in soggetti senza particolari fattori di rischio non necessita di ulteriore rivalutazione prima di 10 anni7. In questa popolazione è un test indicato per lo screening solo

dopo la positività dei test non invasivi sul campione fecale.

Studi osservazionali suggeriscono che l’esame di screening con colonscopia possa contribuire a ridurre l’incidenza del CRC di circa il 40% e la mortalità di circa il 50% 41-42, grazie anche al fatto che riduce l’incidenza delle forme più avanzate di

carcinoma. Note negative si rilevano nella sua invasività, nella variabilità inter-operatore della sua esecuzione, nel rischio di complicanze (sanguinamento, perforazione), oltre che nella necessità di una rigida preparazione orale. Nonostante la colonscopia virtuale risolva alcuni di questi svantaggi non può essere proposta come metodica di screening, per la più bassa sensibilità nei confronti di lesioni di piccole dimensioni, per il necessario utilizzo delle radiazioni e per gli elevati costi. In Italia, in definitiva, viene proposto il test immunochimico di ricerca del sangue occulto nelle feci a tutta la popolazione con rischio generico, cioè a tutti gli individui di età superiore ai 50 anni senza fattori di rischio tali da influenzare le metodiche di screening, eseguita ogni due anni fino ai 69 anni. La positività del test deve essere seguita da una conferma endoscopica.40

L'intensità della sorveglianza necessaria varia in base alla categoria di rischio, per cui è fondamentale l'individuazione di sottopopolazioni con caratteristiche diverse. Le linee guida AIOM riportano queste categorie e definiscono i relativi programmi di screening.40

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22 In caso di diagnosi di carcinoma del colon-retto o di polipi adenomatosi in un familiare di primo grado di età <60 anni o in 2 o più parenti di primo grado a qualsiasi età (non sindrome ereditaria) si raccomanda di eseguire la colonscopia ogni 5 anni dai 40 anni, o da 10 anni prima dell’età del familiare più giovane con diagnosi di CRC.

In caso di diagnosi di carcinoma del colon-retto o polipi adenomatosi in un familiare di primo grado di età >60 anni o in almeno 2 parenti di secondo grado di qualsiasi età il percorso standard di screening deve iniziare a 40 anni.

I pazienti con sindromi genetiche hanno un rischio notevolmente aumentato rispetto alla popolazione generale, per cui si raccomanda che i pazienti con Polipomatosi Adenomatosa familiare (FAP) eseguano la colonscopia ogni 1-2 anni, il test genetico e la sigmoidoscopia (annuale) volta a individuare i segni della FAP dai 10-12 anni. Nei pazienti con Sindrome di Lynch (HNPCC) è indicato eseguire la colonscopia ogni 1-2 anni e il test genetico da 20-25 anni o da 10 anni prima dell’età del familiare più giovane con diagnosi di carcinoma del colon-retto.

In caso di Malattie infiammatorie croniche intestinali (IBD) la colonscopia deve essere eseguita ogni 1-2 anni dopo circa 8-12 anni dalla comparsa dei sintomi di colite.

Infine, i pazienti con diagnosi personale di CRC devono effettuare una pancolonscopia prima della chirurgia (se non eseguibile, per occlusione, 3-6 mesi dopo l’intervento) e dopo 12 mesi dall’intervento. Se l’esame risulta negativo può essere ripetuto dopo ulteriori 2 anni e poi ogni 5 anni.

1.4 Cenni di anatomia patologica

I carcinomi colo-rettali originano come lesioni in situ, sia che partano da formazioni polipoidi sia che partano da lesioni piatte della mucosa, fino ad infiltrare progressivamente le tonache della parete intestinale.

Dal punto di vista macroscopico si distinguono quattro quadri principali:

- Vegetante o polipoide: neoformazione ben circoscritta che protrude nel lume intestinale, di tipo sessile, con aspetto a cavolfiore o fungoide, oppure peduncolata. È più frequentemente presente a livello del colon destro, con minima invasione e risposta fibroblastica, ma spiccati fenomeni neoangiogenici.

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23 - Ulcerata: ulcerazione maligna con margini sollevati e irregolari.

- Infiltrante: ulcerazione centrale a margini rilevati ed estesi, di più frequente riscontro in sede colica sinistra con estesa invasione della parete intestinale, elevata risposta fibroblastica ma minima angiogenesi.

- Anulare-stenosante: diffuso, infiltrante e stenosante, con progressivo restringimento circolare del lume, più frequentemente presente a livello delle flessure.

I tumori del colon prossimale tendono ad accrescersi come masse polipoidi esofitiche che si estendono lungo la parete del cieco e del colon ascendente; raramente queste lesioni causano occlusione del lume, in accordo con la maggiore ampiezza dell’organo a questo livello. Al contrario i carcinomi del colon distale tendono a essere lesioni a crescita circonferenziale anulare e producono stenosi e restringimento luminale determinando un'intensa reazione desmoplastica stromale, a volte fino all’occlusione.15

Dal punto di vista microscopico la WHO (World Health Organization) distingue i diversi istotipi del tumore colorettale, distinguendo i tumori epiteliali (più frequenti), dai tumori non epiteliali.

I tumori epiteliali sono classificati come segue:

- Adenocarcinoma NAS, costituito dalla proliferazione di cellule neoplastiche cilindriche che compongono lumi ghiandolari (85% dei casi);

- Adenocarcinoma mucinoso (10%) caratterizzato dalla presenza di abbondante muco extracellulare, che costituisce oltre il 50% del volume tumorale, più frequentemente localizzato a destra e spesso associato a instabilità microsatellitare.

Questi rappresentano i due istotipi principali, mentre i successivi insieme costituiscono circa il 5% di tutti i casi:

- Carcinoma a cellule ad anello con castone, costituito per più del 50% da cellule con un vacuolo intracitoplasmatico contenente mucina che disloca il nucleo in periferia, sono disperse solitamente in un ricco stroma fibroso; - Carcinoma squamoso, con aspetti morfologici di tipo squamoso.

- Carcinoma adenosquamoso, con aree di tipo ghiandolare miste ad aspetti squamosi;

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24 - Carcinoma indifferenziato, privo di aspetti morfologici di differenziazione

epiteliale;

- Carcinoma a piccole cellule, con caratteristiche morfologiche e biologiche simili a quelle del carcinoma a piccole cellule polmonare;

- Carcinoma midollare, prevalentemente costituito da lamine e trabecole solide di cellule, in genere regolari e con modeste atipie nucleari, e caratterizzato dalla presenza di numerosi linfociti intraepiteliali

Altro parametro da considerare in un CRC è il grading istologico, ossia il grado di differenziazione cellulare, che dovrebbe essere basato sulla valutazione dell’area peggiorativa, indipendentemente dalla sua estensione, escludendo dalla valutazione il margine di avanzamento tumorale.

Si identificano 4 gradi di differenziazione cellulare (grading):

• Grado 1, ben differenziato: neoplasie ben differenziate, caratterizzate da cellule cilindriche simili alla loro controparte adenomatosa, che invadono la sottomucosa e la tonaca muscolare propria;

• Grado 2, moderatamente differenziato: neoplasie moderatamente differenziate;

• Grado 3, scarsamente differenziato: neoplasie scarsamente differenziate; • Grado 4, indifferenziato: neoplasie anaplastiche, prive di strutture ghiandolari Nonostante questa differenziazione nella pratica clinica si tende ad utilizzare una distinzione dicotomica in “basso” (ben e moderatamente differenziato) ed “alto” (scarsamente differenziato, indifferenziato) grado.

Il referto anatomopatologico deve obbligatoriamente indicare, oltre all’istotipo e al grado di differenziazione, l’entità d’infiltrazione della parete intestinale, della sierosa e del grasso periviscerale, la distanza della lesione dai margini di resezione prossimale e distale, il numero di linfonodi asportati e dei linfonodi positivi al coinvolgimento metastatico.43

1.5 Patogenesi

La cancerogenesi è un processo multifasico e progressivo a livello genotipico e fenotipico che deriva dall’accumulo di successive mutazioni.15 Gli studi sulla

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25 generali di oncogenesi. Indipendentemente dall'evento iniziante, vi è una ben definita concatenazione di alterazioni genetiche che conduce all'insorgenza dei carcinomi colo-rettali. Queste alterazioni interferiscono con i processi di crescita, sopravvivenza e differenziazione della cellula epiteliale.

La combinazione di questi eventi molecolari è molto eterogenea e comprende sia anomalie genetiche che epigenetiche, che vengono riscontrate anche nei tumori legati a sindromi ereditarie, il cui studio ha contribuito alla comprensione dei meccanismi che si verificano nei tumori sporadici.

Sono state definite almeno due vie patogenetiche distinte15:

• La via APC/ β-catenina, associata alla classica sequenza adenoma-carcinoma

• La via dell’instabilità dei microsatelliti

La classica sequenza adenoma-carcinoma, che comprende circa l’80% dei tumori sporadici, comporta in genere la mutazione del gene oncosoppressore APC all’inizio del processo neoplastico. Tale mutazione avviene casualmente nei tumori sporadici, mentre è ereditata geneticamente a carico di un singolo allele con modalità autosomica dominante nei tumori associati alla Poliposi Adenomatosa Familiare. La disattivazione funzionale di entrambe le copie alleliche del gene APC, per mutazione genica o per eventi epigenetici, comporta l’insorgenza degli adenomi colorettali.

APC è un gene localizzato nella regione cromosomica 5q, che codifica per

l’omonima proteina, la quale è un regolatore negativo essenziale della via di segnalazione della β-catenina, componente della via di segnalazione WNT. La principale funzione della APC è di modulare i livelli intracitoplasmatici di β-catenina, proteina in grado di migrare nel nucleo e formare complessi proteici con TCF, fattore di trascrizione nucleare. Normalmente, in assenza di segnali provenienti da WNT, la proteina APC lega e promuove la degradazione della β-catenina. Con la perdita della funzione di APC, la β-catenina si accumula nel citoplasma indipendentemente dall’effetto della segnalazione WNT e trasloca verso il nucleo, dove attiva la trascrizione dei geni, ad esempio quelli che codificano MYC e la ciclina D1, che promuovono la proliferazione.

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26 Inoltre, la β-catenina, legando APC ed actina, permette la connessione con la α-catenina e con la γ-α-catenina, strutture che conferiscono stabilità alla proteina E-caderina, la quale media l'adesione cellula-cellula. Il sovvertimento della stabilità di questi meccanismi provoca una perdita dell’inibizione da contatto, caratteristica chiave dei carcinomi che giustifica l'invasività locale e a distanza.

Questa fase è seguita da ulteriori mutazioni, comprese le mutazioni attivanti in

KRAS, che promuovono la crescita e prevengono l’apoptosi, e che sono, appunto,

successive alla mutazione di APC, come dimostrato dalla loro presenza nel solo 10% degli adenomi <1cm, ma nel 50% degli adenomi >1cm e dei carcinomi invasivi. La progressione neoplastica è poi associata a mutazioni in altri geni oncosoppressori, ad esempio quelli che codificano per le proteine SMAD2 e SMAD4, attuatori della segnalazione di TGF-β: poiché normalmente la segnalazione di TGFβ inibisce il ciclo cellulare, la perdita di questi geni può consentirne la crescita incontrollata. L’effetto di questa mutazione sembra essere quello di accelerare la progressione negli stati tardivi della cancerogenesi. L’oncosoppressore p53 risulta mutato nel 70-80% dei tumori del colon, mentre è raramente coinvolto negli adenomi, e questo suggerisce che le mutazioni di p53 si possano verificare anche in fase avanzata della progressione tumorale. La perdita di funzione di p53 e degli altri geni oncosoppressori è spesso causata da delezioni cromosomiche, a dimostrare come l’instabilità cromosomica sia una caratteristica della via APC/β-catenina; in alternativa si può verificare il silenziamento ad opera della metilazione delle isole CpG, regioni situate in posizione 5’ di alcuni geni, che ne regolano l’espressione. Anche l’espressione della telomerasi aumenta a mano a mano che le lesioni avanzano. (Figura 1)

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27 L’altra principale via di alterazione molecolare che porta all’insorgenza del CRC ha origine dalla perdita di funzione dei geni per la riparazione del DNA del sistema Mismatch Repair (MMR), come esaminato nella Sindrome di Lynch, dei quali i più frequentemente mutati sono MSH2(2p16) e MLH1(3p21). Senza questo meccanismo di correzione degli errori, nel genoma si accumulano mutazioni che a mano a mano possono coinvolgere oncogeni e oncosoppressori. L’effetto principale che questo determina è la condizione definita “instabilità dei microsatelliti”. I microsatelliti sono sequenze costitute da 1-6 nucleotidi appaiati ripetute in tandem 10-60 volte, sparse lungo tutto il genoma, che, nelle cellule non mutate, sono di lunghezza costante, mentre nelle cellule con mutazione dei geni MMR presentano un numero di ripetizioni variabili. La loro natura ripetitiva rende queste sequenze vulnerabili a variazioni della lunghezza durante la replicazione del DNA, ma normalmente il sistema MMR, correggendo le basi non correttamente appaiate e/o eventuali inserzioni e delezioni generatesi durante il processo di replicazione, ne mantiene la stabilità.44 Nel momento in cui i microsatelliti diventano instabili,

riducendosi o aumentando di lunghezza nelle cellule tumorali, creano alleli non reperibili tra le cellule normali dello stesso paziente.15 Spesso i microsatelliti si

trovano a fianco di regioni non codificanti di DNA, ma nel momento in cui le mutazioni si trovano in quelle sequenze presenti nella regione codificante o promotrice di geni coinvolti nella regolazione della crescita cellulare, determinano uno stimolo alla proliferazione cellulare. Ad esempio, questo accade quando si situano in quei geni che codificano per il recettore TGF-β di tipo II e per la proteina proapoptotica BAX. Poiché TGF-β inibisce la proliferazione delle cellule epiteliali del colon, le proteine recettoriali mutanti di TGF-β di tipo II possono contribuire a una crescita cellulare incontrollata, mentre la perdita di BAX può aumentare la sopravvivenza dei cloni geneticamente anomali. Nei tumori con MSI sono inoltre frequenti le mutazioni dell’oncogene BRAF e il silenziamento del gene MLH1 dovuto all’ipermetilazione di CpG, mentre in genere KRAS e p53 non presentano solitamente mutazioni. Di conseguenza la combinazione di instabilità dei microsatelliti, mutazioni di BRAF, e la metilazione di bersagli specifici, come MLH1, costituisce la firma di questa via di carcinogenesi. (Figura2)

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28 Figura2.

Le due vie molecolari appena descritte sono le principali che portano alla formazione dei tumori colorettali. In realtà, è possibile individuarne anche una terza, che presenta un aumento della metilazione dell’isola CpG, promotrice di alcuni geni in assenza di instabilità dei microsatelliti. Molti di questi tumori nascondono mutazioni di KRAS, mentre le mutazioni di p53 e BRAF sono piuttosto rare.

1.6 Presentazione clinica e diffusione

Il tumore del colon-retto si presenta clinicamente con diverse modalità a seconda della sede di insorgenza, della diffusione locale o a distanza e dell’eventuale presenza di complicanze clinicamente rilevanti come prima manifestazione. I segni o sintomi che portano alla diagnosi possono essere lievi, e diversi a seconda della localizzazione e diffusione del tumore, oppure severi, fino a comportare l’accesso in pronto soccorso, soprattutto in caso di occlusione o perforazione intestinale, o molto più raramente emorragia massiva.

Nonostante questo, nella maggior parte dei casi il primum movens per la diagnosi del tumore è la positività ai test di screening, in paziente del tutto asintomatico. Nel paziente con tumore del colon ascendente (di destra) sintomatico, in assenza di complicanze che richiedano un intervento in urgenza, generalmente il quadro principale è quello di una anemia sideropenica, con affaticamento, astenia, perdita di peso inspiegabile e dispnea, a causa dello stillicidio ematico cronico. Questo è rilevabile non come sangue visibile ad occhio nudo ma come sangue occulto nelle feci, ed è determinato dalla lenta crescita della lesione vegetante all’interno del lume, di più ampio calibro rispetto a quello che si trova nelle porzioni distali del colon, raggiungendo così maggiori dimensioni, spesso ulcerandosi e sanguinando. A

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29 questo si può associare un dolore di tipo gravativo e subcontinuo ai quadranti addominali di destra e, talvolta, all'epigastrio, e una vaga sintomatologia dispeptica. Nelle fasi avanzate della malattia si può riscontrare una massa palpabile in fossa iliaca destra, così come più abbondanti sanguinamenti, melena e uno spiccato dimagrimento, fino alla cachessia.

Al contrario, se il tumore insorge nel colon discendente (di sinistra) sia per il lume intestinale di calibro inferiore, sia per la tendenza allo sviluppo infiltrante e anulare-stenosante delle neoformazioni, la sintomatologia si manifesta di solito più precocemente. Il quadro clinico è dominato da sintomi di tipo occlusivo-ostruttivo, che si manifestano principalmente con alterazioni dell’alvo, con caratteristica alternanza tra diarrea e stipsi. Si aggiungono dolori addominali intermittenti e di intensità variabile a livello dei quadranti di sinistra o anche diffusi e frequentemente l’emissione di sangue macroscopico con le feci, talvolta associata a muco.

Le lesioni rettali sono prevalentemente ulcerate, vegetanti e facilmente sanguinanti, e determinano sintomi differenti in base alla localizzazione sovrampollare, ampollare o sottoampollare. Nelle forme sovrampollari i quadri clinici sono sovrapponibili a quelli descritti per il colon sinistro, mentre nelle neoplasie ampollari prevale il tenesmo, con senso di peso e di corpo estraneo, talora accompagnato da dolore gravativo e/o da rettorragia associata a mucorrea. Infine le forme sottoampollari, a rapida evoluzione verso la stenosi, si manifestano con evacuazione di feci nastriformi miste a muco e sangue. Possono inoltre essere presenti tenesmo e dolore perianale e perineale che si accentua durante la defecazione. Le lesioni in questa sede entrano in diagnosi differenziale con lesioni emorroidarie e ragadi, motivo per cui la presenza di rettorragia e/o modifiche dell’alvo richiede sempre una esplorazione digitale del retto e, eventualmente, una rettosigmoidoscopia.

I già citati quadri di perforazione (più frequente a destra) o di occlusione/sub-occlusione intestinale (più frequente a sinistra), sono talvolta il primo segno clinico della malattia e possono complicarsi determinando una peritonite diffusa o un processo flogistico peritoneale circoscritto, oltre che la formazione di tratti fistolosi nell’ambito degli organi vicini (fistole colo-enteriche, colo-vescicali, colo-uterine). Un esordio di malattia di questo tipo costituisce un fattore prognostico sfavorevole, a

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30 cui si associa una riduzione della sopravvivenza a 5 anni e una maggiore mortalità intraoperatoria; tale impatto prognostico è verosimilmente legato alla fase tardiva cui si giunge alla diagnosi.

Ulteriori sintomi possono essere quelli legati all’impegno metastatico a distanza, primo tra tutti quello epatico, condizione che alla diagnosi si trova in circa il 10-15% dei pazienti.

Il carcinoma del colon-retto può diffondere attraverso diverse vie. La diffusione per continuità avviene attraverso infiltrazione lungo la parete e nel contesto del suo spessore, con approfondimento progressivo attraverso i diversi strati; all’aumentare della profondità di infiltrazione corrisponde un peggioramento della prognosi in relazione all’aumentato rischio di invasione linfatica e/o ematica. La diffusione per contiguità comporta la progressiva infiltrazione degli organi circostanti. Dopo aver superato la tonaca sierosa il tumore può diffondere per via endocavitaria causando carcinosi peritoneale, che determina lesioni voluminose e/o lesioni molto piccole e numerose nel contesto del peritoneo. La diffusione per via linfatica avviene attraverso le stazioni che seguono il decorso dei vasi sanguigni, per il colon sono distinte in epicoliche e paracoliche, le prime ad essere coinvolte, seguite dalle intermedie e successivamente dalle principali, queste ultime situate lungo le arterie mesenteriche. Il retto ha invece tre vie differenti di deflusso linfatico: una superiore, che drena la porzione superiore del retto ed anche parte di quella inferiore, una media per la porzione inferiore del retto e per la prima parte del canale anale, ed una inferiore per la restante parte del canale e l’orifizio anale. Tutte queste seguono il decorso dei vasi emorroidari che irrorano le tre porzioni rettali.

La diffusione per via ematica è dipendente dalla sede di primitiva insorgenza del tumore. I tumori del colon e della parte superiore del retto, ovvero la stragrande maggioranza delle neoplasie colorettali, seguono il drenaggio da parte delle vene tributarie del sistema portale, al quale segue possibile metastatizzazione epatica. La porzione al di sotto del retto medio viene invece drenata dalle vene emorroidarie medie ed inferiori, le quali sono tributarie del circolo sistemico tramite la vena cava inferiore, rendendo il polmone la prima stazione di filtro. Tuttavia, la presenza di numerose anastomosi porto-cavali rende ragione della relativa facilità con cui cellule neoplastiche dai distretti drenati dalla vena porta raggiungono comunque, in prima

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31 istanza, il polmone. Così come le anastomosi con il plesso venoso vertebrale spiegano la frequenza delle metastasi in questa sede, soprattutto per lesioni primitive del retto medio e inferiore.12-8-43

1.7 Diagnosi

La diagnosi del carcinoma del colon-retto viene posta in seguito al sospetto clinico, nel caso del tumore sintomatico, o della positività dell’esame del sangue occulto nelle feci nel paziente asintomatico, come già esaminato. Il primo approccio diagnostico è necessariamente composto da un esame clinico, comprensivo di anamnesi con valutazione dei fattori di rischio e familiarità, e di esame obiettivo con la palpazione dell’addome, per la ricerca di eventuali masse a livello dell’intestino, del fegato e dei linfonodi, e contestuale esplorazione digito-rettale. L’esplorazione digito-rettale è una manovra molto importante poiché può consentire di palpare le neoplasie situate nel retto basso; la sua accuratezza è estremamente variabile, essendo una manovra operatore dipendente, in base all’esperienza del clinico e al tipo di lesione.

La diagnosi di certezza del tumore del colon-retto, a questo punto, si ottiene sulla base dei risultati della colonscopia o della retto-sigmoidoscopia e della biopsia con l’esame istologico.

La colonscopia è l’esame diagnostico più accurato, caratterizzata da sensibilità del 97% e specificità del 98%.40 Essa permette di localizzare e biopsiare la lesione,

diagnosticare eventuali tumori multipli sincroni ed eseguire una polipectomia con scopo terapeutico. Nel caso di masse rettali palpabili può essere utile a fine diagnostico la retto-sigmoidoscopia, la quale è in grado di studiare circa 60 cm di intestino crasso a partire dall’ano, con una sensibilità e una specificità, in questo tratto, simili a quelle della colonscopia, ma con un minor rischio di perforazione. Le linee guida AIOM 2017 indicano il suo possibile utilizzo a fine diagnostico in associazione alla colonscopia virtuale o al clisma con doppio contrasto. Comunque, circa il 30% di questi pazienti necessita poi di essere sottoposto a colonscopia. La presenza di lesioni stenosanti e occludenti il lume intestinale rappresenta un ostacolo all’esame endoscopico. In questo caso è possibile eseguire esami radiologici quali Rx con clisma opaco o TC-colonscopia (colonscopia virtuale). Il clisma opaco presenta una sensibilità del 55-95% e, nei casi in cui non sia

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32 effettuabile una pancolonscopia, a causa talvolta anche di motivi anatomici, quali il dolicocolon o sindromi aderenziali, conserva ancora un ruolo diagnostico; il reperto tipico è un difetto di riempimento del mezzo di contrasto di tipo variabile a seconda del tipo di neoplasia. La TC-colonscopia è una tecnica di più recente introduzione che unisce la procedura del clisma con doppio contrasto alla TC tridimensionale al fine di ottenere una ricostruzione dell’intestino crasso. Tutt’oggi, quindi, la colon-TC viene utilizzata nei centri specializzati come alternativa al clisma opaco oppure nei casi in cui l’esame endoscopico risulti dubbio per la presenza di lesioni ostruttive.45

A svantaggio di queste metodiche rimane l’impossibilità di eseguire prelievi bioptici per accertare l’istologia di lesioni sospette e di asportare lesioni polipoidi.

La conferma diagnostica, infatti, è data dall’esame istologico che accerta la natura della lesione, e può essere eseguito su un campione bioptico o su una lesione polipoide quando resecata.

Agli esami diagnostici seguono poi gli esami necessari al fine di una corretta stadiazione, fondamentale per stabilire l’approccio terapeutico e per eseguire una valutazione prognostica.

La TC total body con mezzo di contrasto (mdc) è fondamentale per valutare sia l’estensione loco-regionale che l’estensione della malattia a distanza. Per lo studio della neoplasia primitiva a livello locale la TC fornisce utili informazioni sulle dimensioni del processo neoplastico, sui rapporti con le strutture vicine e sulla situazione linfonodale.

Nel tumore rettale extraperitoneale, per la valutazione loco-regionale, si utilizzano inoltre l'ecografia trans-rettale e la RMN della pelvi con mdc, esami che permettono di studiare in modo più accurato l’infiltrazione della parete colica, del mesoretto, del plesso venoso e del grasso periviscerale, oltre che la presenza di linfoadenopatie periviscerali.46

Per la valutazione delle lesioni a distanza la TC total body con mdc è l’esame più diffuso e accurato. L’ecografia addomino-pelvica, poco utile ai fini della stadiazione loco-regionale, è spesso indicata come esame di prima istanza per la ricerca di metastasi a livello epatico. Nei pazienti con metastasi epatiche potenzialmente resecabili è inoltre utile l’esecuzione di una RM epatica con mezzo di contrasto

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