Materiali e superfici ad impronta molecolare per il riconoscimento di specie biologicamente attive

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(1)SOMMARIO. SOMMARIO L’ingegneria tissutale si occupa della realizzazione di sostituti biologici, contenenti cellule vitali e funzionanti, capaci di ripristinare mantenere o migliorare specifiche funzioni dei tessuti. Particolare attenzione viene attualmente rivolta allo sviluppo di scaffold in grado migliorare l’adesione delle cellule trapiantate e di guidarne la crescita e l’organizzazione. La conoscenza di come le cellule si organizzano all’interno del corpo permette di stabilire quali proprietà tali scaffold devono possedere. Processi cellulari come l’adesione, la migrazione, la crescita e l’espressione genica sono controllati dalle interazioni con l’ambiente circostante: le caratteristiche di quest’ultimo, cioè, determinano la risposta delle cellule. La loro adesione ad una superficie artificiale è in generale mediata da specifici recettori di membrana come le integrine, una famiglia di proteine di transmembrana collegate al citoscheletro, che riconoscono particolari sequenze peptidiche presenti in alcune proteine della matrice extracellulare (collagene, laminina, fibronectina, ecc.). Le integrine forniscono un vincolo meccanico non solo tra la membrana e la matrice extracellulare, ma anche tra la matrice stessa ed il citoscheletro; in più, in molte situazioni esse regolano certi segnali biochimici necessari per la sopravvivenza, la crescita e l’espressione funzionale delle cellule. L’inclusione di queste proteine su substrati artificiali non ha trovato largo utilizzo soprattutto perché è possibile migliorare l’adesione cellulare includendo nella superficie artificiale anche solo corte catene oligopeptidiche quali la sequenza arginina-glicina-acido aspartico (RGD), che viene riconosciuta dalle integrine della membrana cellulare. Un approccio alternativo per la realizzazione di scaffold avanzati per l’adesione e la proliferazione cellulare è rappresentato dalla tecnologia ad impronta molecolare (molecular imprinting technology). Tale tecnologia permette di introdurre in un materiale polimerico siti di riconoscimento per determinate specie molecolari (template) attraverso la polimerizzazione di un monomero in presenza del template in modo da mantenere la disposizione spaziale delle funzionalità del polimero anche dopo la rimozione del template, conferendo così alla matrice polimerica una “memoria” selettiva nei confronti di tale molecola stampo.. 1.

(2) SOMMARIO. Il molecular imprinting è una valida alternativa ai sistemi di riconoscimento molecolare presenti nei sistemi biologici, come ad esempio quello degli anticorpi: le matrici macromolecolari preparate con questa procedura, infatti, possono essere stabili anche in condizioni chimico-fisiche critiche, avere una durata di molti anni senza alcuna riduzione delle prestazioni e possono essere utilizzate ripetutamente senza alterazione della “memoria”. Per questo hanno trovato applicazione in numerosi settori come quello della separazione per affinità (cromatografia), della catalisi ad elevata selettività e dei sensori. Infine è possibile intravedere sviluppi molto interessanti nel settore dei biomateriali e in particolare nell’ingegneria tissutale. Questo lavoro di tesi rappresenta uno dei primi passi verso la realizzazione di materiali polimerici per applicazione di ingeneria tissutale che opereranno come sistemi intelligenti nel riconoscimento di specifiche sequenze peptidiche o proteine coinvolte nell’adesione cellulare in modo da ottimizzare e controllare la ricrescita dei tessuti. A tal fine vengono qui riportati gli studi condotti su differenti sistemi ad impronta molecolare appositamente sintetizzati, capaci di riconoscere la sequenza peptidica treonina-alanina-alanina, rappresentativa di una regione esposta della fibronectina, proteina della matrice extracellulare che gioca un ruolo fondamentale nel processo di adesione cellulare. Viene inoltre valutata l’efficacia di alcuni dei sistemi preparati nel riconoscere strutture proteiche di dimensioni maggiori quali l’albumina. I polimeri sono stati sintetizzati sotto forma di nanoparticelle sferiche, mediante polimerizzazione per precipitazione, in condizioni di elevata diluizione dei reagenti nel solvente (acetonitrile), e sotto forma di film sottili, per l’ottenimento dei quali è stata messa a punto una metodologia di sintesi basata sulla tecnica di spin-coating della miscela di reazione (senza l’impiego di solvente). Per le particelle si è adoperato come template il tripeptide protetto Z-Thr-Ala-Ala-OMe (TAA), l’acido metacrilico (MAA) come monomero funzionale e il trimetilolpropano trimetacrilato (TRIM) o il pentaeritritol triacrilato (PETRA) come reticolanti. Dei film preparati, una prima serie è stata imprintata con il peptide TAA, mentre una seconda ha visto come molecola stampo l’albumina del siero bovino (BSA). Per la sintesi dei primi si è utilizzato o l’acido metacrilico o il dimetilamminopropil metacrilammide (DMAPMA) come monomeri, in accoppiata con il TRIM o il PETRA quali reticolanti, con. 2.

(3) SOMMARIO. rapporti molari monomero:reticolante variabili. Riguardo ai film imprintati con BSA, essi sono stati preparati esclusivamente con DMAPMA e PETRA. I materiali polimerici così ottenuti sono stati caratterizzati nelle loro proprietà morfologiche, termiche e spettroscopiche e, successivamente all’estrazione del template, ne è stata testata la capacità nel rilegare la stessa molecola stampo in presenza di differenti solventi. Per tutti i polimeri imprintati con il TAA, inoltre, sono state condotte prove di selettività adoperando soluzioni di rilegame contenenti un composto analogo al template ma non identico, il peptide Z-Thr-Ile-Leu-OMe.. 3.

(4) SOMMARIO. 4.

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