1 UNIVERSITA’ DI PISA
DIPARTIMENTO DI FARMACIA
Corso di Laurea Specialistica in Chimica e Tecnologia Farmaceutica
TESI DI LAUREA
IL RUOLO DELLA PLEIOTROFINA NELLA REGOLAZIONE DEL METABOLISMO EPATICO:
EFFETTI DELLA SOMMINISTRAZIONE DI UNA DIETA RICCA DI GRASSI.
Relatore : Candidato:
Prof.ssa Maria R. Mazzoni Jessie Agostini
Correlatore: Prof. Antonio Lucacchini
1 INDICE RIASSUNTO 4 INTRODUZIONE 7 OBBIETTIVI 21 MATERIALI E METODI 21 ANIMALI
PREPARAZIONE DELL’OMOGENATO EPATICO. 22
ANALISI CON WESTERN BLOT.
QUANTIFICAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELLE PROTEINE
TOTALI. 22
DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ DELLA LATTATO DEIDROGENASI. 23
DETERMINAZIONE DELL’ATTIVITA’ DELLA MALATO DEIDROGENASI. 24
DETERMINAZIONE DELL’ESPRESSIONE DELLE PROTEINE CON
WESTERN BLOT 25
RAPPRESENTAZIONE DEI RISULTATI ED ANALISI STATISTICA. 26
RISULTATI E DISCUSSIONE 27
PESO DEL FEGATO 27
CONTENUTO DI PROTEINE NELL’OMOGENEIZZATO CELLULARE. 29
ATTIVITA’ ENZIMATICHE. 30
ATTIVITA’ LATTATO DEIDROGENASI. 31
2
ESPRESSIONE DELLE PROTEINE NEL FEGATO 34
GLICEROLO CHINASI 35
RECETTORE DELL’INSULINA 37
PI3K. 39
CONCLUSIONI 41
3 LISTA DELLE ABBREVIAZIONI
AKT Proteina chinasi B BCA Acido Bicinconinico ECL Elettrochimioluminiscenza EDTA Acido etilendiaminotetraacetico GK Glicerolo chinasi
HF Dieta ricca di grassi IMC Indice di massa corporea LDH Lattato deidrogenasi LF Dieta povera di grassi MDH Malato deidrogenasi
MK Midkina
NADH Nicotinamide adenina dinucleotide NAFLD Malattia del fegato grasso non alcolico NASH Esteatoepatiti
PI3K Fosfatidil inositol 3-chinasi PTN Pleiotrofina
PVDF Fluoruro di polivinilideno
SDS-PAGE Dodecilsolfato di sodio - elettroforesi in gel di poliacrilamide TBST Tampone Tris- salino-Tween-20
TG Triacilgliceridi
4 Riassunto
L’obesità è una causa importante di resistenza all’insulina e contribuisce allo sviluppo del diabete di tipo 2. Nei pazienti con diabete, la coesistenza di obesità aumenta ancora di più la resistenza all’insulina e rende difficile il controllo glicemico. Differenti studi hanno posto in evidenza che a livello epatico la resistenza all’insulina è associata con l’accumulo locale di grasso e con lo sviluppo di steatosi.
La pleiotrofina (PTN) è una proteina che ha alta affinità per l’eparina ed alla quale si sono attribuite diverse funzioni biologiche che includono la mitogenesi, la angiogenesi e la riparazione dei tessuti dopo una lesione. Recenti studi (11) hanno posto in evidenza che la pleiotrofina è implicata nell’adipogenesi e nella rigenerazione del tessuto epatico a seguito di una lesione, ma sappiamo ancora poco sul ruolo della pleiotrofina nel metabolismo epatico.
Per questa ragione abbiamo voluto determinare, in un modello di topi Knock Out (KO) per la pleiotrofina ed in topi Wilde Type (WT) se la somministrazione di una dieta ricca di grassi per 10 settimane possa influenzare sia l’attività e l’espressione di enzimi del metabolismo epatico sia l’espressione delle proteine della cascata di segnalizzazione dell’ insulina sempre nel fegato.
In condizioni di dieta normale, il peso del fegato dei topi PTN-KO era sensibilmente minore di quello dei topi WT presumibilmente come conseguenza dell’assenza di questo fattore mitogenico. A livello metabolico, l’attività della malato deidrogenasi e l’espressione del glicerolo chinasi a livello epatico erano aumentate nei topi PTN-KO, suggerendo che questi animali abbiano una gluconeogenesi più attiva rispetto ai topi WT.
Nei topi WT, la somministrazione di una dieta ricca di grassi produce un aumento del peso del fegato a fronte di una diminuzione, per altro modesta, del contenuto di proteine, nel fegato come conseguenza di un maggiore deposito di lipidi. Aumenta anche l’attività gluconeogenica epatica sia nei topi WT che PTN-KO. Nei topi WT, la sintesi di glucosio
5 sembra aumentare soprattuto a partire da lattato come conseguenza di un aumento dell’attività della lattato deidrogenasi. Mentre nei topi PTN-KO, una aumento della gluconeogenesi può essere causato sia da un incremento, seppure modesto, dell’attività della lattato deidrogenasi che da un’aumentata espressione del glicerolo chinasi epatica.
6 Figura 1: Glicolisi e Gluconeogenesi (Google immagini)
7 INTRODUZIONE
L’obesità è una malattia metabolica che è associata a problemi di regolazione tanto del metabolismo lipidico come di quello glucidico e che si può diagnosticare in presenza di un indice di massa corporea (IMC) superiore a 30. L’obesità ed una dieta ricca di grassi si sono dimostrati essere fattori di rischio per lo sviluppo della resistenza all’insulina. Di fatto, nei pazienti diabetici, la coesistenza di obesità esaspera la resistenza all’insulina rendendo difficoltoso un adeguato controllo glicemico (1).
Figura 2: Fegato steatosico non alcolico (NAFLD) (da Google immagini)
La resistenza epatica all’insulina nell’ obesità può avere origine dall’accumulo di grasso localizzato nel fegato (2). In questo senso, davanti una situazione di sovralimentazione e con mancanza di esercizio fisico, il fegato ed altri tessuti immagazzinano l’eccesso di energia in forma di trigliceridi per proteggere l’organismo dall’effetto citotossico di alti livelli di acidi grassi. Certamente, questo meccanismo protettore si associa a lungo termine con lo sviluppo della malattia del fegato steatosico non alcolico (NAFLD) Figura 2. Questa malattia si
8 caratterizza per lo sviluppo della resistenza epatica all’insulina come conseguenza di detto accumulo dei triacilgliceridi, acidi grassi e dei loro metaboliti [acil-CoA, diacilglicerolo (DAG), ceramidi e glico e sfingolipidi] in assenza di un consumo "significativo" di alcol. Infine, differenti studi hanno messo in evidenza che l’accumulo di grasso intraepatico si associa in alcune occasioni con lo sviluppo della steatoepatite non alcolica (NASH), della fibrosi, della cirrosi e dell’insufficienza epatica (3) Figura 3.
L’azione dell’insulina richiede un sistema molto coordinato nei meccanismi di fosforilazione e defosforilazione che trasmettono il segnale all’interno della cellula. L’unione dell’insulina al suo recettore, conduce a una autofosforilazione e attivazione del recettore stesso. Una volta attivato, il recettore fosforila ed attiva i substrati del recettore dell’insulina (IRS), dove IRS-2 è il principale mediadore della risposta nel caso del fegato. L’IRS-2 fosforilato serve da ancoraggio per il reclutamento della PI3K alla membrana plasmatica, la quale permette la formazione del fosfatidilinositolo-3,4,5 trisfosfato e la conseguente attivazione della proteina chinasi B (Akt). L’attivazione della via PI3K/Akt è capace di sopprimere la produzione del glucosio endogeno da parte del fegato (4) mediante due meccanismi:
Figura 3: Sviluppo della steatoepatite non alcolica (NASH) e della cirrosi (da Google Immagini)
9
L’attivazione della via PI3K/Akt diminuisce tanto l’attività, come l’espressione della fosfoenolpiruvato carbossichinasi (PEPCK), fruttosio-1,6-bisfosfatasi (FBPasi), e il glucosio-6-fosfatasi (G-6-Pasi) (5) quello che diminuisce la sintesi di nuove molecole di glucosio a partire dal lattato, aminoacidi, intermedi del ciclo dell’acido citrico e glicerolo (gluconeogenesi).
In secondo luogo l’attivazione della via PI3K/Akt conduce alla fosforilazione ed inibizione del glicogeno sintasi chinasi 3 β. Come conseguenza si stimola la sintesi di glicogeno e si inibisce la sua degradazione.
Figura 4: Meccanismi moleculari, il DAG conduce allo sviluppo della resistenza alll’insulina e all’iperglicemia [da “The role of hepatic lipids in hepatic insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. Jun 5;510(7503):84-91 (4)].
10 Quando si sviluppa resistenza all’insulina epatica questo meccanismo di transduzione della segnalizzazione dell’insulina è chiaramente alterato. A tal proposito, è stato descritto che un accumulo di grasso intraepatico conduce ad un aumento della concentrazione di piccole molecole sottoprodotti del catabolismo dei lipidi come il diacilglicerolo(DAG) Figura 4, le ceramidi o gli acil-CoA (6). Questi metaboliti sono capaci di attivare la proteina chinasi C (PKC). L’attivazione della PKC è capace di antagonizzare l’azione dell’insulina; così diminuisce la fosforilazione delle tirosine del recettore dell’insulina, si induce la fosforilazione dei residui di serina di IRS e come conseguenza di questi cambi di fosforilazioni diminuisce la transduzione del segnale dell’insulina all’interno della cellula (7).
Questa inadeguata risposta epatica all’insulina ha come risultato che la soppressione della produzione endogena di glucosio è chiaramente colpita. Di conseguenza tanto la degradazione del glicogeno epatico come la produzione di glucosio per gluconeogenesi si riscontrano molto attive e contribuiscono a una marcata iperglicemia a stomaco vuoto. In questo senso, nei pazienti con diabete di tipo 2, la gluconeogenesi ha dimostrato essere una causa predominante dell’elevata produzione endogena di glucosio, contribuendo aprossimatamente al 50-65% del glucosio libero. Oltretutto, è stato dimostrato che la gluconeogenesi a partire da lattato e da glicerolo è elevata nei pazienti obesi con diabete di tipo 2 come conseguenza dell’aumento della disponibilità del substrato e di un aumento della sua conversione intraepatica in glucosio (8).
11 Figura 5: Azione dell’insulina sul fegato,trasportatore GLUT-2(da Google immagini)
Pleiotrofina
La pleiotrofina (PTN) è una proteina che lega l’eparina con una omologia di sequenza del 50% con la midkina (MK) ed alla quale sono state attribuite diverse funzioni biologiche che includono la mitogenesi, l’angiogenesi e la riparazione dei tessuti dopo una lesione. Anche se l’espressione del mRNA condificante PTN nella vita fetale è elevato in una grande varietà di tessuti, la sua espressione nell’adulto si limita al cervello, le ossa e le gonadi (12).
Recentemente è stato suggerito che la pleiotrofina potrebbe giocare anche un ruolo importante nell adipogenesi e nella rigenerazione del fegato dopo un danno epatico. Di fatto, in uno studio dove è stao analizzato il profilo di espressione genica durante la differenzazione dei preadipociti, l’espressione della PTN variava durante il processo di differenzazione dei preadipociti; questo risultato suggerisce che la PTN possa essere un regolatore
12 dell’adipogenesi (13). Così come, altri studi hanno dimostrato che la PTN è un forte mitogeno per gli epatociti e che potrebbe avere un importante ruolo nello sviluppo e nella rigenerazione del fegato dopo una lesione (14). Ciò nonostante, fino ad oggi non c’è stato nessuno studio che abbia valutato il possibile ruolo della pleiotrofina sul metabolismo lipidico e glucidico nel fegato. Per questa ragione, nel presente lavoro abbiamo voluto valutare se la pleitrofina potesse essere implicata nel metabolismo dei carboidrati nel fegato, nell’accumulo lipidico epatico o nello sviluppo della resistenza all’insulina durante l’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
Per far questo abbiamo utilizzato un modello murino in cui è stato eliminato mediante gene targeting il gene della pleitrofina nella forma constitutiva. D’altra parte, come controllo, abbiamo anche utilizzato animali del ceppo selvaggio, WT. Questi animali sono stati gentilmente trattati con dieta a basso od alto contenuto di grassi dal Dr. Gonzalo Herradon dell’area di Farmacologia de la Universidad CEU-San Pablo di Madrid.
Recettori funzionali e percorsi di segnale intracellulare di midkina (MK) e pleiotrofina (PTN)
MK e PTN hanno simili funzioni che includono mitogenicità, sopravvivenza cellulare, oncogenicità, infiammazione, differenziazione e rinnovamento delle cellule staminali. Le funzioni di mitogenicità e sopravvivenza cellulare di MK e PTN si riflettono principalmente promuovendo la proliferazione cellulare non solo per le cellule normali provenienti dall'epitelio, dall'endotelio e dai fibroblasti dei tessuti, ma anche per linee cellulari di carcinoma che originano da diversi tessuti. Inoltre, MK e PTN svolgono un ruolo importante nel differenziamento cellulare e nello sviluppo dell’embrione. Durante lo sviluppo embrionale, in particolare nel sistema nervoso, gli mRNA codificanti MK e PTN sono fortemente espressi. MK è per prima altamente espressa a metà gestazione ed è seguita da una maggiore espressione di PTN che raggiunge il livello massimo intorno alla nascita. Sia
13 l’espersione di MK che di PTN sono localizzate nei processi gliali radiali del cervello lungo i quali migrano le cellule staminali neurali e si differenziano. Oltre che nel sistema nervoso, MK e PTN regolano anche la differenziazione e la morfogenesi di altri organi durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati (9).
In particolare, mentre MK e PTN sono scarsamente espresse nell’adulto, sono espresse in molti tessuti durante la rigenerazione dopo una ferita od un trauma. Inoltre, MK e PTN sono molto espresse in molti tumori e svolgono un ruolo chiave nella proliferazione e nella metastasi delle cellule tumorali, rendole così eccellenti biomarcatori e bersagli molecolari del cancro per lo sviluppo di nuovi farmaci anti-neoplastici. Allo stato attuale, il coinvolgimento di MK e PTN nella proliferazione e nel rinnovamento delle cellule staminali evidenziano ulteriormente il loro potenziale come agenti rigenerativi. Ad esempio, è stato dimostrato che MK promuove il recupero dal danno ischemico nel cuore e nel cervello, attenua la deposizione delle placche del peptide amiloide e la progressione della malattia di Alzheimer, facilita la rigenerazione del fegato ed aiuta la riparazione delle fratture ossee e delle lesioni muscolari. È stato anche dimostrato che la PTN promuove emopoiesi del midollo osseo. Le diverse funzioni di MK e PTN sono mediate attraverso l’attivazione di meccanismi molecolari come recettori cellulari di membrana e percorsi di segnalazione intracellulari. Ad oggi, sono stati fatti progressi chiave nel chiarire i meccanismi funzionali di MK e PTN, inclusi i diversi recettori e le complicate vie della segnalazione intracellulare.
MK è una proteina di 13 kDa ed è formatada 143 amminoacidi, mentre PTN ha un peso molecolare di 18 kDa ed è formata da 168 amminoacidi. Gli amminoacidi basici che sono importanti per la struttura e la funzione sono conservati. In particolare, MK e PTN I hanno domini N- e C-terminali simili conservati, rispettivamente con tre e due legami disolfuro ed una cerniera flessibile di collegamento reciproco.
La struttura della MK solubile analizzata dalla risonanza magnetica ha rivelato che sia la pozione N- che la porzione C-terminale hanno tre foglietti β anti-paralleli. Un loop
14 flessibile (Lys86, Lys87, Arg89) tra il secondo e terzo foglietto β nel dominio C-terminale media il legame con eparina, ed un altro sito legante eparina si trova in corrispondenza di una serie di aminoacidi basici (Lys79, Arg81, Lys102) sul foglietto β. La struttura della PTN solubile, risolta dalla risonanza magnetica, era simile analogamente a MK e il legame di eparina si verifica allo stesso modo su foglietti β.
Figura 6: Struttura della Midkina. Cited from Muramatsu, T., J. Biochem. 132,
359-371 (2002); Wiley Encyclopedia Mol. Med. pp2086-2088 (2002) [・2002, John Wiley & Sons]. This material is used by permission of John Wiley & Sons, Inc
15 E’ noto che le vie delle (proteine chinasi attivate da mitogeni) MAPK e del (fosfatidil inositolo 3-chinasi) PI3K/AKT (proteina chinasi B) hanno ruoli significativi nella proliferazione cellulare, nella sopravvivenza e nell’antiapoptosi. Molti tipi di cellule tumorali, di linee cellulari e di cellule normali che hanno una risposta mitogenica o di sopravvivenza dopo il trattamento con MK o con PTN le attuano attraverso l'attivazione della vie delle MAPK e di PI3K/AKT. MK inibisce, in maniera dose-dipendente, l'apoptosi dei neuroni indotta dalla privazione del siero attraverso la down regolazione dell'attività della proteina apoptotica caspasi-3. PTN promuove, mediante l’espressione di ALK, la proliferazione di molti tipi di linee cellulari: cellule endoteliali HUVEC, fibroblasti NIH3T3, cellule di carcinoma surrenalico SW-13, cellule di cancro del pancreas colo-357, cellule squamose ME-180, cellule di glioblastoma U87MG, U118MG e U138MG e cellule di carcinoma mammario MDA-MB 231 (11,12). La PTN induce la proliferazione per queste linee cellulari attraverso l’attivazione di ALK (chinasi del linfoma anaplastico) la quale fosforila substrati intracellulari a valle quali, SHC, fosfolipasi C-γ (PLC-γ) ed IRS-1 che ulteriormente attiva PI3K ed ERK1/2 (11,12). Oltre al recettore ALK, MK e PTN attivano anche le chinasi regolate da segnali extracellulari (ERK1/2) e PI3K/AKT attraverso i recettori RPTPζ in cellule simil-osteoblastiche e attraverso sia ανβ3 che RPTPζ nelle HUVEC. In presenza di MK, le vie delle MAPK e di PI3K/AKT partecipano al processo di recupero dei tessuti feriti, come il processo di recupero di lesioni ischemiche del miocardio, della cartilagine traumatizzata e della neurotossicità indotta da anfetamina. Le vie delle MAPK e di PI3K/AKT partecipano anche alla proliferazione e all’auto-rinnovamento delle cellule staminali, come le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali ematopoietiche (HSC) dopo stimolazione con PTN.
MK e PTN sono due importanti citochine che hanno molteplici funzioni sovrapposte le quali hanno diversi recettori di membrana per la loro segnalazione intracellulare. Allo stato
16 attuale, i farmaci anti-cancro che hanno come bersaglio la MK e la PTN e i loro recettori o percorsi intracellulari sono in corso di sviluppo. E’ stato anche discusso il targeting dei percorsi di segnalazione di MK e di PTN per curare la tossicodipendenza e i disturbi neurodegenerativi. Inoltre, le ricerche evidenziano sempre più che MK e PTN non solo posseggono un potenziale per la terapia del danno ischemico del cuore e del cervello, del morbo di Alzheimer, dell’emopoiesi del midollo osseo, di lesioni ossee e muscolari, e persino dell’immunodeficienza umana da infezione da virus (HIV), ma svolgono anche un ruolo importante nella rigenerazione tissutale nell’adulto. Quindi, in futuro, verranno fatti degli studi per chiarire i vari percorsi intracellulari della segnalazione di MK e di PTN in diversi tipi di malattie per gettare le basi per lo sviluppo di nuovi farmaci targeting MK e PTN (9).
Possiamo riassumere che la PTN, un efficace fattore angiogenico e neurotrofico, è sovraespressa in molte condizioni patologiche. E’ un fattore di crescita secreto che viene anche chiamato peptide associato e regolato dall'eparina (HARP) o molecola associata alla crescita legante l'eparina (HB-GAM) e si lega ai cinque recettori della superficie cellulare: tra cui il recettore tirosin fosfatasi (RPTPβ/ζ), e la chinasi del linfoma anaplastico (ALK). Insieme alla midkina, la PTN forma una famiglia di proteine leganti l'eparina che sono normalmente espresse sia temporalmente che spazialmente. La PTN è stata ampiamente identificata in vari tumori umani dove mostra una funzione di proto-oncogene. Non solo la PTN è coinvolta nella tumorigenesi pruomovendo l'angiogenesi e la proliferazione delle cellule tumorali, ma influenza anche l'invasione e le metastasi perineurale rimodellando il microambiente cellulare neoplastico. Diversi approcci che annullano la segnalazione costitutiva di PTN nelle cellule neoplastiche annullano in modo efficace l'angiogenesi del tumore. Inoltre, la funzione della PTN è stata anche studiata nei tessuti fibrotici, nelle cicatrici ipertrofiche e nell'artrite reumatoide, dove è coinvolta nella fibrogenesi e nell'infiammazione. Inoltre, come fattore neuroprotettivo efficace, la PTN è altamente regolata nei disturbi
17 neurodegenerativi. Alcuni studi hanno dimostrato che la PTN stimola la crescita dei neuriti dai neuroni coltivati, induce una forma bipolare di precursori delle cellule gliali, promuove la crescita e la rigenerazione assonale e supporta la sopravvivenza neuronale (10).
Il ruolo della midkina e della pleiotrofina nella rigenerazione epatica
Figura 7: Rigenerazione epatica (da Google immagini)
Il fegato adulto possiede un'alta capacità rigenerativa Figura 7. La rigenerazione dopo epatectomia parziale (PH) è un buon modello per studiare la rigenerazione del fegato. La maggior parte degli epatociti rimanenti partecipa al processo rigenerativo e le cellule stellate epatiche (HSC) sostengono efficacemente la crescita degli epatociti, in particolare degli epatociti di piccole dimensioni . Nei roditori il fegato raggiunge la sua massa iniziale entro 7-14 giorni dopo il PH; quindi le cellule rientrano nella fase di riposo . Vari fattori di crescita e citochine sono coinvolti nei processi di rigenerazione epatica. Sono particolarmente importanti il fattore di crescita dell'epatocita (HGF), ilfattore di crescita epidermico, l’interleuchina-6 (IL-6), il fattore di necrosi tumorale (TNF-α), il fattore di crescita trasformante (TGF–α) ed il fattore di crescita epidermico legante l'eparina.
18 La MK migliora la crescita, la migrazione e la sopravvivenza di varie cellule.L'espressione di MK nel tessuto adulto è notevolmente limitata, e nel topo solo il rene e l'utero esprimono questa molecola ad alti livelli . Nell'uomo, la MK non è espressa anche nel fegato, mentre un’espressione intensa di MK viene frequentemente riscontrata nel carcinoma epatocellulare . A seguito di lesioni tissutali, la MK esibisce due diverse funzioni. In primo luogo, migliora la migrazione dei leucociti infiammatori e aumenta la condizione patologica dei tessuti. Pertanto, la formazione di neointima ed il danno renale dopo lesione ischemica sono meno gravi nei topi carenti del gene codificante la MK (Mdk) rispetto ai topi WT. In secondo luogo, la MK inibisce l'apoptosi delle cellule danneggiate; la somministrazione di MK aumenta la sopravvivenza delle cellule neuronali nei segmenti esterni dei fotorecettori esposti a luce costante, e nell'ippocampo dopo il danno ischemico. Pertanto, è stato studiato se la rigenerazione del fegato fosse alterata nei topi Mdk-KO.
La PTN ha circa il 50% di identità con la MK. La PTN migliora la crescita degli epatociti e l'espressione di PTN è aumentata dopo gravi lesioni epatiche quali epatite, fibrosi epatica o PH . Quindi, è stato simultaneamente esaminato se i topi carenti del gene codificante per PTN (Ptn) mostravano normali processi di rigenerazione epatica. Confrontando la crescita delle cellule epatiche in topi Mdk(-/-), Ptn(-/-) e WT dopo PH. In terza, settima e quattordicesima giornata dopo PH, la proliferazione cellulare nel fegato, valutata misurando la proteina nucleare delle cellule proliferanti (PCNA), risulta essere significativamente inferiore nei topi Mdk(-/-) e Ptn(-/-) rispetto ai controlli wild WT.
MK e PTN sono coinvolte sia nell'infiammazione che nella riparazione dopo PH.
E’ stata osservata una soppressione della proliferazione cellulare nei giorni 3-14 dopo PH sia nei topi Mdk(-/-) che in quelli Ptn(-/-). Il grado di soppressione nei topi Mdk(-/-) allo stadio iniziale della rigenerazione era paragonabile a quello osservato nei topi carenti di IL-6 e di TNF-α, mentre l'effetto della deplezione di PTN non era così marcato.. Sebbene i topi Ptn(-/-) mostrino una tendenza simile a quelli Mdk(-/-), la diminuzione del peso del fegato rigenerato
19 non è statisticamente significativa. Queste differenze potrebbero essere correlate alla diversa abilità di MK e di PTN di attrarre i neutrofili in vivo. Il peso del fegato risultava diverso anche nel primo giorno dopo PH tra topi WT e Mdk(-/-), molto probabilmente a causa delle differenze nell'infiammazione, che influenza l'assorbimento di liquidi. Un problema da ricordare è che la riduzione del peso del fegato nei topi Mdk(-/-) può essere la conseguenza o della differenza finale nella rigenerazione epatica o del ritardo della rigenerazione. In ogni caso, è importante che anche se MK e PTN aumentano il danno tissutale poco dopo la PH, alla fine promuovono il processo di rigenerazione epatica.
Abbiamo già stabilito che MK svolge ruoli importanti nel reclutamento di cellule infiammatorie sia nella nefrite che nella formazione di neointima; la migrazione delle cellule infiammatorie è soppressa nei topi Mdk(-/-) il che porta ad una condizione patologica meno grave. Inoltre, poichè la singola deplezione di MK o di PTN sopprime significativamente la migrazione, è stato suggerito che le due molecole partecipino ad aspetti diversi dei processi migratori.
Una spiegazione ovvia per la diminuzione della proliferazione cellulare nei topi con deficienza di MK o di PTN è che questi fattori agiscano direttamente sugli epatociti e ne promuovono la proliferazione. Infatti, la PTN migliora la proliferazione degli epatociti in coltura. Anche la MK esibisce un’attività simile, e HGF aumenta l'attività di MK. La diminuzione della migrazione dei leucociti infiammatori nel fegato dopo PH può anche contribuire alla diminuzione della proliferazione cellulare, poiché si prevede che i leucociti migrati secerneranno fattori che promuovono la proliferazione degli epatociti. Il fatto che le cellule infiammatorie infiltrate e le cellule epatiche che si dividono si trovino nello stesso ambiente è coerente con questa visione. In effetti, è stato recentemente riportato(11), che nei topi carenti di ICAM-1 il reclutamento di leucociti infiammatori e la rigenerazione epatica è compromessa con concomitante diminuzione dei livelli di TNF-α e di IL-6. Tuttavia, la diminuzione della proliferazione degli epatociti nei topi con deficienza di ICAM-1 è
20 moderata, vale a dire una diminuzione del 40-50% rispetto al livello nei topi WT, suggerendo che la diminuzione dell'infiammazione da sola non può spiegare la forte soppressione della crescita degli epatociti nei topi Mdk(-/-). In generale, sono necessari ulteriori studi per distinguere gli effetti diretti di MK e di PTN sulla proliferazione degli epatociti e i loro effetti indiretti attraverso il miglioramento di altri fattori di crescita.
L'espressione della proteina MK inizia ad aumentare il terzo giorno dopo PH, ed il suo contenuto continua ad aumentare anche fino al quattordicesimo giorno dopo PH. Questo lento aumento del contenuto di MK è coerente con quanto riportato precedentemente; dopo trattamento con AAF, il livello di mRNA codificante per MK è massimo al giorno 13. HGF raggiunge il picco al terzo giorno, questo rapido aumento è coerente con l'importante ruolo dell'HGF nella rigenerazione epatica, sebbene almeno una parte dell'HGF, che innesca la replicazione iniziale degli epatociti, venga rilasciata dalla matrice extracellulare mediante la stimolazione di MK .Pertanto, la mancanza di MK o di PTN ritarda l'espressione di HGF in terza giornata. Questo ritardo può essere un fattore nel ridurre la proliferazione cellulare nei topi deficienti di queste citochine.
Possiamo concludere che MK e PTN sono coinvolte nel reclutamento di leucociti infiammatori nella PH e nella promozione della rigenerazione epatica. Pertanto, il potenziamento del danno epatico valutato dall’AST osservato nei topi WT è stato rilevato solo in prima giornata e non sono state rilevate differenze di mortalità e peso corporeo tra topi WR e KO. D'altra parte, il deficit nella proliferazione degli epatociti è stato osservato dalla terza alla quattordicesima giornata nei topi KO. L'identificazione di MK e PTN come molecole che potenziano la rigenerazione epatica indica che la diminuzione o l'assenza della loro espressione può essere correlata con l'anormalità nel recupero del fegato danneggiato (11).
21 OBIETTIVI
In seguito alle informazioni esposte precedentemente, in questo studio ci siamo prefissati i seguenti obbiettivi :
1. Valutare l’effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN(-/-) sull’attività e l’espressione degli enzimi del metabolismo epatico.
2. Valutare l’effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN(-/-) sull’espressione delle proteine della cascata di segnalizzazione dell’insulina.
MATERIALI E METODI
1. Animali.
Per la realizzazione del presente lavoro è sto utilizzato tessuto epatico di topi femmine WT(PTN+/+) e KO per la pleiotrofina (PTN-KO, PTN-/-).
Sono stati utilizzati 24 topi di 6 mesi di età (12 WT e 12 PTN-KO) che sono stati suddivisi in quattro suttogruppi:
6 WT alimentati ad libitum con una dieta povera di grassi (WT LF). 6 WT alimentati ad libitum con una dieta ricca di grassi (WT HF). 6 PTN-KO alimentati ad libitum con una dieta povera di grassi (KO LF). 6 PTN-KO alimentati ad libitum con una dieta ricca di grassi (KO HF).
La somministrazione della dieta è stata mantenuto per 10 settimane, passate le quali gli animali sono stati sacrificati. Dopo un digiuno di 6 ore, gli animali, anestetizzati con CO2, sono stati sacrificati mediante ghigliottina e quindi dissezioneati.
Il fegato è stato congelato in azoto liquido e quindi conservato a -80ºC fino al suo utilizzo.
22 2. Preparazione dell’omogenato epatico per i saggi enzimatici.
Per la preparazione dell’omogenato epatico sono stati pesati approssimatamente 50 mg di fegato in una provetta da 2 ml contenente 1 ml di tampone Tris 50 mM, pH 7.4 e una sferetta di metallo. La disgregazione del tessuto è stata ottenuta utilizzando il TissueLyser LT programmato a 45 Hz/minuto per una durata di 4 minuti. I residui cellulari insolubili sono stai eliminati mediante centrifugazione a 17.000 g per 30 min a 4°C. E’ stato raccolto il surnatante di cui è stata misurata la concentrazione proteica e l’attività dei differenti enzimi. La concentrazione delle proteine è stata determinata mediante il saggio basato sulla reazione con l’acido bicinconinico (Pierce, Rockford, IL).
3. Preparazione dell’omogenato epatico per l’analisi Western Blot.
Per la preparazione dell’omogenato del fegato sono stati pesati approsimatamente 50 mg di tessuto in una provetta da 2 ml contenente 1 ml di tampone di omogenizzazione (HEPES 30 mM, EDTA 5 mM, Triton X -100 1%, desossicolato di sodio 0,5%, 8 mM Na3VO4 8 mM, NaF 1 mM e Pefablock 2 mM), pH 7.4, ed una sferetta di metallo. La disgregazione del tessuto è stata effettuata utilizzando il TissueLyser LT programmato a 45 Hz/minuto per 4 minuti. I residui cellulari insolubili sono stati eliminati medinate centrifugazione a 17.000 g per 30 min a 4°C. E’ stato raccolto il surnatante in cui è stata quantificata la concentrazione proteica e determinata l’espressione di specifiche proteine mediante Western blot. La concentrazione proteica è stata determinata utilizzando il kit commerciale BCA-200 Protein Assay Kit (Pierce).
23 4. Quantificazione della concentrazione delle proteine totali
La concentrazione delle proteine totali è stata misurata con il kit commerciale BCA-200 Protein Assay Kit (Pierce). Questo metodo si basa nella reazione delle proteine con l’acido bicinconinico (BCA) che genera un complesso colorato con un massimo di assorbanza a 562 nm che è lineare con l’incremento della concentrazione delle proteine.
5. Determinazione dell’attività della lattato deidrogenasi. a) Principio:
La determinazione dell’attività della lattato deidrogenasi, è stata realizzata mediante la determinazione spettrofotometrica continua a 340 nm del NADH. La riduzione del NADH/min è proporzionale alla quantità di piruvato che è convertito a lattato/minuto Figura 8. Ma, nelle condizioni della reazione, la riduzione del cofattore è anche proporzionale alla quantità di enzima.
b) Determinazione dell’attività enzimatica:
Per la determinazione dell’attività della lattato deidrogenasi a 490 µl di soluzione di reazione (piruvato 1.1 mM, NADH 0.12 mM in tampone fosfato 100 mM, pH 7.5) alla temperatura di 37ºC erano aggiunti 10 µl di surnatante di omogenato epatico diluito 1/4 in tampone fosfato 100 mM, pH 7.5. Dopo la miscelazione per inversione è stata misurata
24 l’assorbanza a 340 nm ogni 15 secondi con uno spettrofotometro Beckman DU640 per un tempo totale di 225 secondi. L’attività della LDH è stata calcolata come mostrato di seguito:
UI enzima/ml= Abs340 nm/min x 0.5 x Fd / 6,22 x 0.01
Per il calcolo dell’attività enzimatica specifica sono state divise le UI di enzima/ml per la concentrazione proteica (mg/ml) del campione ottenuta mediante il metodo dell’acido bicinconinico, come mostrato di seguito:
Unità Internazionali/mg proteina= (UI/ml)/(mg proteine/ml).
6. Determinazione dell’attività della malato deidrogenasi. a) Principio:
La determinazione dell’attività della malato deidrogenasi è stata realizzata mediante la determinazione spettrofotometrica continua a 340 nm del NADH. La scomparsa del NADH/min è proporzionale alla quantità di ossalacetato che è convertito a malato/min Figura 9. Ma, nelle condizioni della reazione, la riduzione del cofattore è anche proporzionale alla quantità di enzima
0.5= Volume totale del saggio in ml Fd= fattore di diluizione=4
6.22= coeficiente di estinzione molare del NADH a 340 nm 0.01= Volume di enzima utilizzato in ml
25 b) Determinazione dell’attività enzimatica:
Per la determinazione dell’attività della malato deidrogenasi a 490 µl di soluzione di reazione (ossalacetato 7.6 mM, NADH 0.14 mM in tampone fosfato 100 mM, pH 7.5) alla temperatura di 37ºC sono stati aggiunti 10 µl di surnatante dell’omogenato epatico diluito 1/4 in tampone fosfato 100 mM 7.5. Dopo la miscelazione per inversione, è stata misurata l’assorbanza a 340 nm ogni 15 secondi con uno spettrofotometro Beckman DU640 per un tempo totale di 225 secondi. L’attività della MDH è stata calcolata come mostrato di seguito:
UI enzima/ml= Abs340 nm/min x 0.5 x Fd / 6,22 x 0.01
Per il calcolo dell’attività enzimatica specifica sono state divise le UI di enzima/ml per la concentrazione proteica (mg/ml) del campione ottenuta mediante il metodo dell’acido bicinconinico, come mostrato di seguito:
Unità Internazionali/mg proteina= (UI/ml)/(mg proteine/ml).
7. Determinazione dell’espressione delle proteine mediante Western Blot
Per la determinazione dell’espressione delle proteine mediante Western Blot, le proteine (25 g) del surnatante dell’omogenato epatico di ogni gruppo sperimentale sono state separate mediante SDS-PAGE Figura 9. Le proteine sono state, quindi, trasferite mediante elelettroblotting a membrane di PVDF. Le membrane sono state incubate per 30 min a
0.5= Volume totale del saggio in ml Fd= fattore di diluizione=4
6.22= coefficiente di estinzione molare del NADH a 340 nm 0.01= Volume di enzima utilizzato in ml
26 temperatura ambiente in TBST contenente latte in polvere scremato al 10% (TBSTM) e quindi sono state incubate a 4° C per tutta la notte in TBSTM contenente uno dei seguenti anticorpi: IR-ß della Santa Cruz Biotechnology; glicerolo chinasi di Abcam o anti-PI3K di Upstate Biotechnology.
Dopodichè, le membrane sono state lavate ed incubate a temperatura ambiente, con un anticorpo secondario coniugato con la perossidasi. Le bande inmunorreattive sono state visualizzate usando il sistema di chemiluminescenza ECL e sono state quantificate mediante densitometria.
Figura 10: Elettroforesi per SDS-PAGE (da Google immagini)
8. Presentazione dei risultati e calcoli statistici.
I risultati sono stati espressati come la media dei valori ottenuti per ogni gruppo sperimentale ± l’errore standard (ES). Per determinare l’omogeneità delle varianze tra i gruppi, è stato usato il test di Levene. Le analisi statistiche tra due gruppi sono state effettuate utilizzando il test di Student. Il livello di significatività statistica è stato stabilito per valori di p 0,05. Le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando il programa GraphPad prism 5.0 per Windows.
27 RISULTATI
1. Effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi a topi WT e PTN-KO sul peso del fegato e sul contenuto proteico epatico.
In primo luogo abbiamo voluto determinare se l’eliminazione del gene della pleiotrofina e la somministrazione di una dieta ricca di grassi possa avere un effetto sul peso del fegato e sul contenuto proteico epatico.
Figura 11. Peso del fegato. Peso del fegato dei topi WT o PTN-KO alimentati con una dieta povera di grassi (LF) o ricca di grassi (HF). I risultati sono espressi come Media ± ES. Le differenze statisticamente significative tra i gruppi sono indicate: *, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001.
PESO DEL HÍGADO
WT L WT H PTN LF PTN HF 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
*
**
***
P e s o d e l h íg a d o ( g )28 In primo luogo abbiamo natato che il peso del fegato era significativamente superiore nei topi WT rispetto ai topi PTN-KO Figura 11. Nei topi WT, la somministrazione di una dieta ricca di grassi provocava un marcato incremento nel peso del fegato, mentre non provocava nessuna variazione statisticamente significativa nei topi PTN-KO.
Come mostrato nella Figura 12 , che illustra il contenuto di proteine del fegato, i topi WT mostravano una minore concentrazione proteica per grammo di fegato rispetto ai topi PTN-KO. Il contenuto di proteine epatiche tende a diminuire per l’effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi PTN-KO; nonostante, che questa diminuzione non sia risultata statisticamente significativa.
Un minore contenuto di proteine nel fegato dei topi alimentati con una dieta ricca di grassi può essere giustificato da un maggior accumulo di lipidi. Di fatto, risultati precenti, hanno rivelato che il contenuto di lipidi nel fegato aumenta a seguito della somministrazione di una dieta ricca di grassi tanto nei topi WT come nei topi PTN-KO, sebbene l’incremento nei topi PTN-KO sia significativamente minore (12).
29 Figura 12. Contenuto di proteine epatiche. Contenuto di proteine nel fegato di topi WT o PTN alimentati con una dieta povera di grassi (LF) o ricca di grassi (HF). I risultati sono espressi come Media ± ES.
Questi risultati concordano con uno studio di Lee e collaboratori (16) che hanno osservato che la sommistrazione di una dieta ricca di grassi induce un incremento del peso del fegato dovuto fondamentalmente ad un incremento nell’accumulo di lipidi in questo tessuto (13) Questo accumolo di lipidi può condurre allo sviluppo del fegato steatosico non alcolico nei topi WT e una misura minore nei topi PTN-KO.
mg PROTEINA/g tejido WT LF WT HF PTN LF PTN HF 0 50 100 150 200 m g p ro te ín a /g t e ji d o mg PROTEINA/g tessuto
30 2. Effetti della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN-KO
sull’attività e/o l’espressione di enzimi del metabolismo epatico.
Come abbiamo commentato nell’introduzione la somministrazione di una dieta ricca di grassi può condurre al maggior accumulo di trigliceridi nel fegato degli animali che ricevono questo supplemento di grasso. Questa steatosi epatica può modificare la risposta di soppressione della gluconeogenesi epatica dovuta a concentrazioni fisiologiche di insulina, e quindi condurre sia allo sviluppo di iperglicemia e allo stato di resistenza all’insulina (8).
Per queste ragioni abbiamo voluto determinare l’attività e/o l’espressione di tre enzimi implicati nel metabolismo epatico:
La lattato deidrogenasi epatica che è implicata nella conversione del lattato generato per glicolisi anaerobica in piruvato.
La malato deidrogenasi epatica i cui isoenzimi sono implicati nella transformazione del malato in ossalacetato partecipando cosí sia alla sintesi de novo di glucosio (isoenzima citosolico) che alla catalisi di una delle reazioni del ciclo del acido citrico (isoenzima mitocondriale).
La glicerolo chinasi epatica che catalizza il trasferimento di un gruppo fosfato al glicerolo formando glicerolo 3-fosfato. Questo glicerolo 3-fosfato può essere utilizzato per la riesterificazione con acidi grassi per la formazione di triacilgliceridi, o per la sintesi di glucosio attraverso la sua conversione in diidrossiacetone fosfato (gluconeogenesi).
Glicerolo chinasi
31 2.1. Attività della lattato deidrogenasi.
In primo luogo abbiamo voluto determinare l’attività della lattato deidrogenasi epatica in modo da valutare se la gluconeogenesi a partire dal lattato potesse essere modificata per l’eliminazione della pleiotrofina o per l’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
Come è mostrato nella Figura 14, è stato rilevato un incremento significativo dell’attività della lattato deidrogenasi (LDH) nei topi WT alimentati con una dieta ricca di grassi. Anche l’attività della LDH nei topi KO mostra un lieve incremento a seguito della somministrazione della dieta ricca di grassi. Tuttavia, nei topi PTN-KO l’attività della LDH è significativamente inferiore rispetto ai corrispondenti controlli WT, independentemente dal tipo di dieta che hanno ricevuto. La somministrazione della dieta ricca di grassi con il conseguente maggior accumulo di trigliceridi nel fegato dei topi WT può essere in relazione con una maggiore produzione di glucosio a partire dal lattato (15).
Figura 14. Attività della lattato deidrogenasi epatica. Attività della lattato deidrogenasi nel fegato dei topi WT o PTN-KO alimentati con una dieta povera di grassi (LF)
LDH WT LF WT HF KO LF KO HF 0 1 2 3
*
*
*
Un id a d e s / m g p ro te ín a32 o ricca di grassi (HF). I risultati sono espressi come media ± ES. Le differenze statísticamente significative tra i gruppi sono indicate: *, p < 0.05.
Quindi nei topi PTN-KO la produzione di piruvato a partire dal lattato, che può essere utilizzato per la sintesi di glucosio, potrebbe essere inferiore a quella che si ha nei topi WT. Questo effetto può suggerire due possibilità: o una minore disponibilità di questo substrato gluconeogenico perchè la produzione di lattato nei tessuti extraepatici dalla glicolisi anaerobia è minore nei topi PTN-KO che nei topi WT, e/o che la gluconeogenesi epatica a partire dal lattato sia meno attiva nei topi PTN-KO.
2.2. Effetti della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN-KO sull’attività della malato deidrogenasi.
In secondo luogo abbiamo voluto determinare l’attività della malato deidrogenasi. Questo enzima, oltre a catalizzare una delle tappe del ciclo dell’acido citrico, è implicato nella formazione epatica di glucosio. L’enzima citosolico è responsabile della conversione del malato a ossalacetato, il quale può essere transformato in fosfoenolpiruvato, in uno delle tappe chiave della gluconeogenesi. Così abbiamo voluto valutare se la gluconeogenesi a partire dagli intermedi del ciclo dell’acido citrico può essere modificata a seguito dell’eliminazione della pleiotrofina o per un’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
Come viene mostrato nella Figura 15, la somministrazione di una dieta ricca di grassi non ha modificato l’attività della malato deidrogenasi (MDH) nei topi WT. Al contrario, nei topi PTN-KO, alimentanti con un dieta a basso contenuto di grassi, l’attività MDH è significativamente superiore rispetto ai corrispondenti controlli (WT). Tuttavia, anche nei topi PTN-KO, l’attività della MDH non viene significativamente modificata dall’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
33 Figura 15. Attività della malato deidrogenasi epatica. Attività della malato deidrogenasi nel fegato dei topi WT o PTN-KO alimentati con una dieta povera di grassi (LF) o ricca di grassi (HF). I risultati sono espressi come media ± ES. Le differenze statisticamente significative tra i gruppi si sono indicate: **, p < 0.01.
La maggiore attività della malato deidrogenasi nei topi PTN-KO può condurre o ad un aumento nella produzione di glucosio a partire da substrati gluconeogenici e/o ad un incremento dell’ossidazione dell’acetil-CoA nel ciclo dell’acido citrico.
Risultati precedenti a questo lavoro, che hanno valutato il metabolismo di questi topi hanno dimostrato che i topi PTN-KO a 6 mesi di età traggono l’energia in condizioni basali fondamentalmente dalla β ossidazione, mentre i topi WT ossidano in forma equiparabile sia glucosio che acidi grassi per garantizzare le proprie necessità energetiche (16).
MALATO DESHIDROGENASA WT LF WT HF KO LF KO HF 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
**
Un id a d e s / m g p ro te ín a MALATO DEIDROGENASI34 Inoltre, nei topi PTN-kO a 6 mesi di età, l’espressione di uno degli enzimi chiave della gluconeogenesi la PEPCK è sta riscontrata essere significativamente aumentata in confronto con i topi WT .
3. Effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN-KO sull’espressione della glicerolo chinasi.
In terzo luogo abbiamo voluto determinare se l’espressione della glicerolo chinasi (GK) può essere modificata dall’eliminazione della pleiotrofina o dalla somministrazione di una dieta ricca di grassi. Questo enzima catalizza una delle tappe necessarie per la riesterificazione del glicerolo con gli acidi grassi ed è implicato nella formazione epatica di glucosio. Di fatto, è responsabile della conversione citosolica del glicerolo a glicerolo 3-fosfato, il quale può essere transformato in seguito a diidrossiacetone fosfato che può essere utilizzato per la gluconeogenesi.
Come è mostrato nella Figura 16, l’espressione di questo enzima nei topi WT alimentati con una dieta ricca di grassi non varia significativamente. Tuttavia, i topi PTN-KO mostrano un’espressione del glicerolo chinasi significativamente superiore rispetto ai corrispondenti controlli (WT), e questa espressione aumenta ulteriormente a seguito dell’alimentazione con una dieta ricca di grassi.
35 Figura 16 . Espressione della glicerolo chinasi. Espressione della GK valutata mediante WB nel fegato dei topi WT o PTN-KO alimentati con una dieta povera di grassi (LF) o ricca di grassi (HF). I risultati sono espressi come media ± ES. Le differenze statisticamente significative tra i gruppi sono indicate: **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
Questi risultati possono suggerire che nei topi PTN-KO la sintesi di glucosio a partire dal glicerolo sia molto aumentata.
Dato che i topi PTN-KO hanno presentato in condizioni basali un aumento dell’attività della MDH epatica e dell’espressione della glicerolo chinasi, si può ipotizzare che la sintesi di glucosio in questi animali a partire da glicerolo e dagli intermedi del ciclo dell’acido citrico sia molto attiva. Questi risultati sono conformi con i dati ottenuti in un precedente lavoro . Di fatti, come si è già detto i topi PTN-KO a 6 mesi di età presentano un aumento importante dell’espressione della fosfoenolpiruvato carbossichinasi, uno degli enzimi implicati nella
GLICEROL QUINASA WT LF WT HF PTN LF PTN HF 0 5 10 15 20 25
*
***
***
u .a . GLICEROLO CHINASI36 regolazione della gluconeogenesi, e sviluppano iperglicemia e intolleranza al glucosio con l’età. Questo aumento della produzione di glucosio nei topi PTN-KO potrebbe essere in ralzione con un’alterata risposta epatica all’insulina. Questa resistenza epatica all’insulina produrrebbe un’inadeguata soppresione della gluconeogenesi epatica in condizioni di normoinsulinemia. Per provare a vedere se nel nostro modello sperimentale si generi resistenza all’insulina nel fegato, è stata valutata l’espressione nel fegato di questi animali di due proteine implicate nella trasduzione del segnale dell’insulina all’interno della cellula: il recettore dell’insulina e la PI3K.
4. Effetto della somministrazione di una dieta ricca di grassi nei topi WT e PTN-KO sull’espressione delle proteine della cascata di segnalazione dell’insulina.
Ci siamo proposti di determinare se l’eliminazione del gene della pleiotrofina e la somministrazione di una dieta ricca di grassi possa avere un effecto sull’espressione di due proteine implicate nelle fasi iniziali della cascata di segnalazione dell’insulina.
Figura 17: La cascata di eventi data dall’attivazione del recettore dell’insulina (da Google immagini)
37 4.1. Espressione del recettore dell’insulina
38 RECEPTOR DE INSULINA WT LF WT HF PTN LF PTN HF 0 5 10 15 20
*
*
u .a .In primo luogo abbiamo analizzato l’espressione del recettore dell’insulina, un recettore di membrana al quale si lega l’insulina e che è la prima delle proteine implicate nella trasduzione del segnale dell’insulina all’interno della cellula.
Figura 19. Espressione del recettore dell’ insulina. Espressione del recettore dell’ insulina determinato mediante WB nel fegato dei topi WT o PTN-OK alimentati con una dieta povera di grassi (LF) o ricca di grassi (HF). I resultati sono espressi come media ± ES.
Le differenze statisticamente significative tra i gruppi sono indicate: *, p < 0.05. .
Come viene mostrato nella Figura 19, l’espressione del recettore dell’insulina nei topi WT non viene modificata a seguito della somministrazione della dieta ricca di grassi. Nei topi PTN-KO l’espressione del recettore era significativamente inferiore rispetto ai corrispondenti controlli (WT). La somministrazione di una dieta ricca di grassi ai topi PTN-KO ha provocato
39 un incremento dei livelli di espressione di questa proteina che hanno raggiunto valori simili a quelli trovati nei topi WT.
4.2. Espressione del fosfatidil inositol 3-chinasi (PI3K)
Finalmente, per verificare se l’espressione di PI3K nel fegato di questi topi possa modificarsi a seguito dell’eliminazione della pleiotrofina o per la somministrazione di una dieta ricca di grassi, il suo contenuto nel surnatante dell’omogenato epatico è stato valutato mediante WB.
Figura 20. Espressione del PI3K. Espressione di PI3K valutata mediante WB
Come viene mostrato nella Figura 20, l’eliminazione della PTN non ha avuto nessun effetto sull’espressione di PI3K. Così come, i livelli di questa proteina non sono moficati a seguito della somministrazione di una dieta ricca di grassi in nessuno dei due modelli murina, WT e PTN-KO. PI3K WT LF WT HF PTN LF PTN HF 0 5 10 15 u .a .
40 L’analisi dell’espressione delle due proteine della cascata di segnalazione dell’insulina ha permesso solo di individuare una minore espressione del recettore dell’insulina nei topi PTN-KO a 6 mesi di età rispetto a topi WT. Il fatto che non abbiamo riscontrato differenze nelle fasi iniziali della segnalazione per effetto dell’eliminazione della pleiotrofina o della somministrazione di una dieta ricca di grassi non ci permette di escludere che gli animali presentino un’alterata risposta epatica all’insulina epatica giacchè la trasduzione del segnale potrebbe essere alterato in punti a valle nella cascata di segnalazione
In questo senso, potrebbe essere importante continuare il presente lavoro analizzando l’espressione di altre proteine implicate nelle tappe a valle della trasduzione del segnale dell’insulina. Così come, sarebbe necessario valutare il grado di fosforilazione del recettore dell’insulina, dei substrati del recettore dell’insulina e di altre chinasi implicate nella trasduzione del segnale.
41 CONCLUSIONI
1. Nei topi PTN-KO il peso del fegato è sensibilmente ridotto rispetto ai topi WT mettendo in evidenza il ruolo mitogenico della pleiotrofina nello sviluppo di questo tessuto.
2. L’eliminazione della pleiotrofina induce un aumento dell’attività della malato deidrogenasi e dell’espressione della glicerolo chinasi epatiche che potrebbero essere reponsabili di un aumento della gluconeogenesi epatica in questi animali.
3. La somministrazione di una dieta ricca di grassi produce un aumento del peso del fegato nei topi WT. Questo cambiamento potrebbe essere dovuto da un maggiore deposito di lipidi negli epatociti.
4. La somministrazione di una dieta ricca di grassi potrebbe far aumentare l’attività gluconeogenica epatica tanto nei topi WT come nei PTN-KO. Nei topi WT la sintesi di glucosio potrebbe aumentare a partire da lattato e dal glicerolo come conseguenza di un aumento dell’attività/espressione della lattato deidrogenasi e dell’espressione della glicerolo chinasi. Mentre nei topi PTN-KO trattati con una dieta ricca di grassi, l’attività della lattato deidrogenasi non aumenta mentre l’espressione della glicerolo chinasi epatica subisce un ulteriore incremento significativo.
5. Nei topi WT, l’analisi dell’espressione del recettore dell’insulina e della PI3K non permette di concludere che la somministrazione di una dieta ricca di grassi o la delezione della pleiotrofina siano responsabili dell’induzione della resistenza epatica all’insulina. C’è da notare che nei topi PTN-KO l’espressione del recettore dell’insulina nel fegato è significativamente ridotta. Comunque sono necessarie ulteriori analisi dell’espressione e dell’attività delle varie chinasi a valle del recettore dell’insulina per chiarire un possibile ruolo di un’alterazione di questa cascata di segnalazione nel promuovere la resistenza epatica all’insulina.
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