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UNIVERSITÀ DI PISA
Dipartimento di Farmacia
Corso di Laurea Specialistica in Farmacia
TESI DI LAUREA
Il coinvolgimento del recettore Liver X nell’omeostasi dei lipidi e dei
fluidi del sistema nervoso centrale nella malattia di Alzheimer.
Strategie terapeutiche.
Relatore:
Candidata:
Prof. Vincenzo Calderone
Florinda Di Ianni
2
INDICE
1. Malattia di Alzheimer Pag. 03
1.1 Fisiopatologia Pag. 03
1.1.1 Eziologia Pag. 05
1.1.2 Epidemiologia Pag. 06
2. Recettore Liver X Pag. 09
2.1 Ossisteroli Pag. 11
2.1.1 Mielinizzazione Pag. 17
2.1.2 Omeostasi lipidica Pag. 18
2.1.3 ApoE, Lrp1 Pag. 22
2.2 Omeostasi Fluida Pag. 25
2.2.1 Plessi corioidei Pag. 27
2.2.2 Acquaporina 1 Pag. 27
2.2.3 Acquaporina 4 Pag. 28
2.2.4 Acquaporina 9 Pag. 28
3. Strategie terapeutiche Pag. 30
3.1 GW3965 Pag. 30
3.2 Composti sperimentali Pag. 38
4. Conclusioni Pag. 51
3
INTRODUZIONE:
1
Malattia di Alzheimer
La malattia di Alzheimer è un disordine neurodegenerativo cronico che di solito inizia lentamente e peggiora con il tempo[1][2]. Il sintomo precoce è la difficoltà nel
ricordare eventi recenti (perdita di memoria a breve termine). Con l’avanzare della malattia compaiono sintomi come disorientamento, problemi del linguaggio e comportamentali, perdita di motivazione [1]. Spesso il soggetto s’isola dalla società e
dalla famiglia[1].
1.1 Fisiopatologia
La malattia di Alzheimer è caratterizzata da perdita dei neuroni e sinapsi nella corteccia cerebrale e alcune regioni sottocorticali. Questa perdita si traduce in una grossa atrofia nelle regioni colpite tra cui la degenerazione del lobo temporale e parietale e parti prefrontali della corteccia e del giro del cingolo [3]. La degenerazione
è presente anche nei nuclei del tronco cerebrale come il locus coeruleus [4]. Studi
eseguiti con la risonanza magnetica e PET hanno documentato una riduzione nelle dimensioni di regioni specifiche del cervello in pazienti con Alzheimer nel decorso della malattia da moderata a grave comparando le immagini con soggetti adulti sani [5][6] (come mostrato in figura 1);
4 Fig. 1
inoltre nel tessuto cerebrale esaminato al microscopiosono visibili placche amiloidi e groviglineurofibrillari [7]. L’età di esordio è in genere verso i 65 anni, anche se circa
il 5% dei casi è ad esordio precoce. [8]
La caratteristica della malattia è la formazione di due tipi di proteine aggregate: le placche amiloidi extracellulari e grovigli neurofibrillari intracellulari che sono composti principalmente da tau iperfosforilata [9]. Circa lo 0,1% dei casi sono forme
familiari a ereditarietà autosomica dominante non collegate al sesso, che hanno un esordio prima dei 65 anni. [10]
Questa forma di malattia è conosciuta come forma familiare ad esordio precoce (FAD) ed è determinata dalla mutazione di tre geni che sono localizzati sui cromosomi 21, 14, 1. Al cromosoma 21 è associato il gene che causa un’alterata proteina precursore dell’amiloide; al cromosoma 14 è associato un gene che causa un’anomala presenilina 1; infine al cromosoma 1 è associato un gene che causa un’alterata presenilina 2.
5 Ognuna di queste mutazioni porta alla formazione delle caratteristiche placche amiloidi[11]. La maggior parte dei casi di Alzheimer è ad esordio tardivo e i primi
sintomi compaiono intorno ai 60 anni. Le cause non sono del tutto comprese, includono una serie di combinazioni genetiche, fattori ambientali e stili di vita.
Per ora il maggior fattore di rischio è associato all’allele ɛ4 dell’apolipoproteina E.
[12] Negli eterozigoti l’allele ɛ4 aumenta il rischio d’incidenza di sviluppare la
malattia pari a 3 volte, mentre negli omozigoti aumenta di circa 15 volte[10].
1.1.1 Eziologia
Varie ipotesi sono state formulate; quella colinergica che propone una ridotta sintesi del neurotrasmettitore acetilcolina [13].
Tale ipotesi non ha avuto grande sostegno dovuto in parte all’inefficacia dei farmaci destinati a trattare la carenza di acetilcolina. [14]
Ipotesi amiloide [15] [16] supportata dal fatto che il gene che codifica per la proteina
precursore dell’amiloide è collocato nel cromosoma 21 e persone con trisomia del cromosoma 21 (sindrome di Down), aventi una copia in più del gene manifestano i sintomi della patologia di Alzheimer intorno ai 40 anni [17] [18].
Ipotesi tau, in questo modello la proteina tau forma filamenti che si legano tra loro, alla fine si formano grovigli neurofibrillari all’interno dei corpi delle cellule
nervose [19].
In questo modo i microtubuli si disintegrano distruggendo la struttura del citoscheletro [20].
6
1.1.2
Epidemiologia
Le persone con demenza, oggi sono 40 milioni in tutto il mondo (fig. 2); questo numero è destinato a crescere 131,5 milioni stimati in tutto mondo nel 2050. La demenza ha anche un forte impatto economico, i costi stimati oggi in tutto il mondo
sono di 818 milioni di dollari.
La prevalenza della demenza aumenta in modo esponenziale con l’avanzare dell’età Un effetto statisticamente significativo è stato osservato in cinque regioni: Asia dell’est e del sud, Caraibi, Europa occidentale e America latina, dove è stata riscontrata nei maschi una prevalenza tra il 14% e il 32% inferiore rispetto alle donne.
7 La tab.1 sintetizza in una popolazione sopra i 60 anni, il numero di soggetti con demenza in ogni regione stimato in base ai dati del GBD (Global Impact of Dementia, l’osservatorio globale per l’età e la cura della demenza) e le stime future sono effettuate in proporzione all’aumento della popolazione sopra i 60 anni e all’incidenza della malattia.[21]. La tab. 2 esamina il numero di persone con demenza
espresso in milioni in funzione del reddito (dati stilati dalla banca mondiale).
Tab. 1
Popolazione totale sopra i 60 anni. Stime approssimative della prevalenza della demenza (2015), e numero delle persone stimate con demenza (2015, 2030 e 2050) e incremento proporzionale (2015-2030 e 2015-2050) per GBD World Region
8 Tab. 2 Persone affette da demenza (per milione) secondo la
9
2
Recettore LIVER X
I Liver X sono recettori appartenenti alla superfamiglia dei recettori nucleari per i fattori di trascrizione ligando-attivati [22]. A questo gruppo appartiene anche il
recettore retinoide (RXR), farnesoide (FXR), il recettore attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPAR), il recettore pregnane (PXR) e recettore costitutivo androstane (CAR); ognuno di loro forma complessi dimerici obbligati con il recettore retinoide
[23,24] .
I recettori LXR sono stati identificati nel 1994 e consistono di due isoforme α e β, che sono altamente correlate e condividono il 78 % di omologia nella sequenza di taglio dei loro amminoacidi sia nel DNA sia nel dominio di legame per il ligando [25].
Il LXRα è abbondantemente espresso nei tessuti ad attività metabolica come fegato, polmoni, ghiandola surrenale, intestino e macrofagi [26]; mentre il LXRβ è
ubiquitariamente espresso in tutti i tessuti a basse concentrazioni [22,26][27-29], ad
eccezione del sistema nervoso centrale dove è più abbondante [30].
L’isoforma Liver Xα è stata identificata in due gruppi chiamati RLD-1 [27] e LXR[31];
mentre per l’isoforma LXRβ sono stati identificati quattro gruppi chiamati UR [28],
NER [32], OR-1[33] e RIP-15[34].
Il gene umano LXRα è localizzato nel cromosoma 11 p11.2, mentre il LXRβ è situato nel cromosoma 19 q13.3.
I geni target Liver X sono rappresentati in tab.3 [35] e sono implicati nella regolazione
10 Gene La principale funzione dei prodotti genici nell’omeostasi del
colesterolo
Risposta dei geni d’espressione
all’attivazione dei LXR
ABCA1 Le ABCA1 mediano l’efflusso intracellulare del colesterolo delle apoliproteine HDL povere di lipidi.
↑ ABCG1 Le ABCG1 mediano l’efflusso intracellulare del colesterolo principalmente
dalle particelle accettori ricche di lipidi.
↑ ABCG5/8 Le ABCG5/8 impediscono l’assorbimento intestinale dell’eccesso del
colesterolo alimentare e iniziano l’efflusso del colesterolo dagli epatociti nella bile.
↑
NPC1 Le NPC1 regolano il trasporto del colesterolo dal compartimento finale endosomi/lisosomi ad altri compartimenti.
↑ NPC2 Le NPC2 legano e trasporta sia il colesterolo che steroli in vescicole
fosfolipidiche.
↑ NPC1L1 Le NPC1L1 promuovono l’assorbimento del colesterolo intestinale. ↓ ApoA1 Le ApoA1promuovono l’efflusso del colesterolo e forme mature di HDL. ↓/↑ ApoE Le ApoE mediano lo smaltimento dei chilomicroni e VLDL dal flusso
ematico.
↑
ApoM Le ApoM promuovono la formazione della pre-βHDL. ↓/↑
LDLR Le LDLR mediano il recupero endocitico del colesterolo LDL. ↑ SR-B1 Le SR-B1facilitano il flusso bidirezionale del colesterolo libero tra cellule
e lipoproteine e mediano la secrezione del colesterolo biliare.
↑ Cyp7A1 Cyp7A1è un enzima che determina la velocità di sintesi degli acidi biliari
dal colesterolo.
↑ Cyp7B1 I Cyp7B1 catalizzano la sintesi degli acidi biliari di molti ossisteroli
differenti.
↓ HMGCR HMGCR è l’enzima quantità limitante per la sintesi del colesterolo. ↓/↑ HMGS Le HMGS catalizzano la condensazione dell’aceto-acetil CoA e acetil Coa
dalla HMG-CoA.
↓ PLTP Le PLTP mediano il trasferimento dei fosfolipidi dalle lipoproteine ricche
di trigliceridi a HDL e giocano un ruolo critico nel metabolismo dell’HDL. ↑ CETP Le CETP facilitano il trasferimento degli esteri del colesterolo e trigliceridi
tra HDL e particelle lipoproteiche contenenti ApoB.
↑
11
2.1
Ossisteroli
I primi ligandi naturali identificati che possono attivare i recettori LXRs a concentrazioni fisiologiche sono gli ossisteroli, in particolare il 24 (s) OH- sterolo, 24(s) e 25 epossi sterolo, il 27 (OH)-sterolo [36] e i suoi metaboliti acidi colestonici [37], 22(R) OH-sterolo (come mostrato in fig. 3). È stato dimostrato che il D-glucosio
e il glucosio 6-fosfato sono agonisti endogeni dei recettori LXRs con un’efficacia comparabile agli ossisteroli [38]. Gli agonisti sintetici più comunemente usati negli
studi sperimentali sono il T0901317 e il GW3965 [39,40].
In contrasto agli ossisteroli che stimolano l’attività trascrizionale dei LXR, il geranyl-geranyl, un altro intermedio della biosintesi del colesterolo, inibisce le isoforme LXRs antagonizzando la loro interazione con il coattivatore [41,42].
12
13 I LXRs regolano la trascrizione dei geni attraverso due meccanismi: diretta attivazione (Fig. 4 pannello superiore) e trans espressione (Fig. 4 pannello inferiore). Nel primo meccanismo i recettori LXRs formano un obbligato eterodimero con RXR il recettore 9- cis trans retinoico e legano l’elemento responsivo LXREs che consiste di una diretta ripetizione di una sequenza nucleo 5¹- AGGTCA-3¹ separata da 4 nucleotidi (DR4) [43] nel DNA dei geni target (come mostrato in fig.5).
Invertendo la ripetizione della stessa sequenza consenso senza la regione spazio (IR-0) o con 1bp (base pair) spazio (IR-1) possono anche mediare la trans attivazione
[44,45]. In assenza di ligando i recettori LXRs sono in uno stato inattivo, leganti l’affine
elemento responsivo LXREs nel complesso con il corepressore come ad esempio il recettore Nucleare Corepressore ( NCoR) o il mediatore del silenziamento dell’acido retinoico e il recettore per l’ormone tiroideo SMRT [46,47]. Il legame con il ligando
induce un cambiamento conformazionale dei recettori LXRs che sono abilitati al rilascio del corepressore, reclutando il coattivatore [48] e a sua volta la diretta
attivazione dei geni di trascrizione. Parecchi coattivatori sono stati descritti ed includono:
PPARγ;
(PGC-1α) coattivatore-1α [49];
Coattivatore dei recettori steroidei-1 (SRC-1) [50];
Cointegratore 2 attivatore del segnale (ASC-2) [51].
Il secondo meccanismo di azione gioca un ruolo chiave nella regolazione dei geni pro-infiammatori [52]. Il recettore LXR β esercita una forte inibizione della
14 trascrizione dei geni pro infiammatori regolati da Nf-κβ [53] che perde il diretto
legame con il sito per i LXRs. Dopo il legame con il ligando LXRβ subisce una sumoilazione da SUMO-2/3 che promuove un’interazione con GPS2 una subunità del complesso N-CoR (nucleare recettore corepressore). In questo contesto la dissociazione tra il complesso N-CoR con Nf-κβ è impedita e la trascrizione dei geni pro infiammatori viene bloccata [52].
Gli ossisteroli sono i ligandi fisiologici dei recettori LXRs il 24-(s) OH-sterolo è anche chiamato cerebrosol ed è abbondantissimo nel cervello, esso è catalizzato da un enzima microsomiale il Cyp 46A1 [54], il 27 OH-sterolo è un intermedio della sintesi
degli acidi biliari ed è catalizzato dall’enzima mitocondriale Cyp27A1, esso si trova principalmente nella circolazione il 25 OH-sterolo è sintetizzato da un enzima localizzato nel reticolo endoplasmatico e nel Golgi e si trova in basse quantità in molti tessuti [55], il 20(s)OH-sterolo e il 22(R)OH-sterolo sono biosintetizzati
dall’enzima Cyp11A1 [56]. Questi ultimi due steroli sono composti intermedi nella
steroidogenesi e la loro sintesi avviene nelle ghiandole surrenali [56].
La sovraespressione della sulfotrasferasi (SULT2B1) determina un alterato segnale dei LXR sia in vitro che in vivo [57]. Il 25OH-sterolo 3-solfato [58] o gli altri steroli
solfati come il 5α, 6α-epossisterolo3-solfato e il 7-ketosterolo3-solfato sono ligandi antagonisti dei recettori Liver X [59].
15 Fig. 4
16 Fig. 5 Meccanismo di regolazione trascrizionale mediato dai LXRs. Recettore
17
2.1.1 Mielinizzazione
L’attivazione dei recettori LXRs conduce ad un incremento dell’efflusso di colesterolo e del suo metabolismo abbassando i livelli del colesterolo nelle cellule [58].
I LXRs sono espressi in cellule di Schwann e oligodentrociti [61,62].
Il doppio topo transgenico knock out dei LXRs presenta un’alterazione omeostatica nel cervello, risultante in perdita di neuroni, proliferazione degli astrociti, disorganizzazione della guaina mielinica [63] e accumulo di lipidi in una specifica
regione del cervello. La guaina mielinica è essenziale per l’efficiente conduzione del potenziale di azione [64, 65].
Recentemente è stato dimostrato che l’isofoma liver Xβ è essenziale nel processo di mielinizzazione e rimielinizzazione del cervelletto [66]. Da notare che i recettori LXRs
influenzano in modo differente i geni di espressione della mielina nel SNC e SNP [67].
Nel SNC i recettori LXR attivano i geni della mielina in oligodentrociti [66]: Proteo
lipid protein e Mielyn Basic Protein.
In cellule di Schwann attivano i geni della mielina: Protein Zero (MPZ) e Peripheral Myelin Protein 22KDa [68].
Nel topo Wild Type l’attivazione dei recettori LXRs nel nervo ottico con T0901317 conduce a un decremento dei geni della mielina così come nel midollo spinale e di conseguenza dei livelli di m-RNA.
In queste due regioni la modulazione del segnale LXRs disturba i geni della mielina; inoltre il nervo ottico e il midollo spinale mostrano un’alta quantità di trascritti dei RXRs partners dei LXRs. In aggiunta il nervo ottico è la struttura che esprime i più
18 alti livelli di entrambe le isoforme e potrebbe spiegare l’esacerbazione dell’influenza del segnale LXR sui geni della mielina.
L’assenza della sola isoforma beta in questi tessuti non influenza significativamente i livelli di mRNA suggerendo che questi ultimi dipendono più dall’isoforma alfa anziché dalla beta. Nel midollo spinale la presenza della sola isoforma alfa riesce a compensare l’assenza del LXRβ. Nel corpo calloso del topo adulto le due isoforme dei recettori LXRs sembrano esercitare effetti opposti; in questa regione il LXR β modula in senso negativo i geni di espressione della mielina.
Il cervelletto, che è una regione ricca di mielina, contiene la più bassa concentrazione dei maggiori ligandi dei LXRs, infatti, la concentrazione del 24(s) OH-sterolo nel cervelletto è 7-9 volte minore rispetto a midollo spinale e cervello[69-72].
Tale osservazione potrebbe essere spiegata con il fatto che in questa regione i LXRs non siano saturati dai ligandi endogeni.
2.1.2 Omeostasi lipidica
L’iper colesterolemia è emersa in molti studi come un importante fattore di rischio nei pazienti con malattia di Azheimer [73]. Studi condotti sui tessuti cerebrali umani e
animali, usando la cromatografia liquida e spettrometria di massa per misurare il contenuto dei lipidi, hanno rilevato elevati livelli di sfingomielina ed esteri del colesterolo, sia nei pazienti con Alzheimer sporadico sia nei topi transgenici con malattia familiare di Alzheimer [74].
19 A supporto della tesi dell’ipercolesterolemia come fattore di rischio, molti studi hanno riportato che pazienti sottoposti a trattamento farmacologico con statine mostravano una più bassa incidenza di sviluppare la malattia [75, 76].
I livelli del 24(s)OH-sterolo sono alti negli stati precoci della malattia e si abbassano negli stati avanzati, come evidenziato da studi di comparazione con il controllo dovuto alla perdita dei neuroni [77]. Il cervello non può degradare il colesterolo e
l’eccesso è metabolizzato principalmente in ossisteroli, che sono prodotti dell’ossidazione del colesterolo. Il 24 (S)OH- sterolo è sintetizzato dai neuroni, è riversato nel circolo sanguigno, attraversa la barriera emato-encefalica e finalmente arriva al fegato per essere eliminato dall’organismo.
Una piccola quantità di 24 (S)OH-sterolo è assorbita dagli astrociti che attivano i recettori LXRs, in tal modo sovraregolano l’espressione di ApoE, ABCA1, ABCAG1. I neuroni sintetizzano una bassa quantità di 27-OH sterolo, la maggior parte proviene dalla periferia e circa 5 mg al giorno entrano nel cervello; tuttavia i livelli di tale sterolo dipendono principalmente dall’integrità della barriera emato-encefalica, se quest’ultima è difettosa, grandi quantità penetrano nel cervello tramite la circolazione ematica. Numerosi studi sperimentali hanno dimostrato che gli ossisteroli influenzano la produzione di beta amiloide. La quantità di proteina precursore dell’amiloide nelle membrane, i livelli di BACE1 e beta amiloide, incrementano nelle cellule in coltura di neuroblastoma SH-SY5Y trattate con 27(OH)-sterolo.
20 Invece le cellule trattate con 24(S)OH-sterolo incrementano soprattutto i livelli di sAPPα, ma non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di beta amiloide evidenziando che tale sterolo promuove l’idrolisi dell’APP attraverso la via non amiloidogenica [78].
Nei pazienti con Alzheimer i livelli di 24(S)OH-sterolo diminuiscono, mentre aumentano quelli del 27 OH-sterolo. Il suddetto decremento potrebbe essere dovuto alla perdita neuronale e alla corrispondente riduzione del CYP46A1, mentre l’elevata quantità del 27 OH-sterolo potrebbe essere causata da un’alterazione della barriera emato-encefalica dovuta a ipercolesterolemia [79].
Nel cervello adulto i neuroni maturi dipendono dall’approvvigionamento del colesterolo dagli astrociti. L’enzima HMG CoA reduttasi sintetizza nuove molecole di colesterolo che sono trasportate da ApoE, passano attraverso la via ABCA1 ATP-binding cassette e sono secrete nello spazio extracellulare.
In seguito il complesso ApoE–colesterolo si andrà a legare al recettore LDLR localizzato sulle membrane dei neuroni e internalizzato, promuovendo in tal modo la crescita dendritica e la formazione delle sinapsi. Una parte del colesterolo passa attraverso l’esterificazione e sarà stoccata in gocce lipidiche nel citoplasma.
Il colesterolo esterificato, può essere idrolizzato da idrolisi enzimatica e successivamente metabolizzato da enzimi come il Cyp46A1 o Cyp27A1 che danno origine ai rispettivi metaboliti del colesterolo che servono per le necessità delle cellule nel SNC. La maggior parte del 24 (S) OH-sterolo che è sintetizzato attraversa la barriera emato-encefalica e tramite circolazione ematica arriva al fegato dove viene
21 metabolizzato. Un’altra parte viene recuperato dagli astrociti che attivano i recettori LXRs e sovraregolano i livelli di espressione di ApoE e ABCA1.
I neuroni sintetizzano soltanto una piccola concentrazione del 27 OH-sterolo, la maggior parte arriva dalla periferia. Sotto condizioni d’ipercolesterolemia la permeabilità della barriera emato-encefalica cambia e tramite il flusso ematico il colesterolo entra nel cervello attraversando la barriera danneggiata.
Una vasta quantità di acidi grassi polinsaturi e di lipoproteine a bassa e bassissima densità entra nel cervello conducendo ad una serie di disordini metabolici (come mostrato in fig.6).
22
2.1.3 ApoE e LRP
Il più importante fattore di rischio nella patologia sporadica di Alzheimer ad esordio tardivo è rappresentato dal genotipo ApoE [80]. Quest’ultima è la maggiore
apolipoproteina del SNC che consiste di 299 amminoacidi ed è principalmente prodotta dagli astrociti. ApoE interagisce con il recettore neuronale LDLR come un ligando.
Con LDLR, ApoE trasporta il colesterolo e altri componenti lipidici all’interno dei neuroni per il metabolismo neuronale e la sinaptogenesi.
Tre comuni isoforme esistono nell’uomo chiamate ApoE2, ApoE3, ApoE4, le quali sono rispettivamente codificate dagli alleli ɛ2, ɛ3, ɛ4, sul braccio lungo del cromosoma 19th. Queste isoforme differiscono principalmente per i loro residui amminoacidici nelle posizioni 112th e 158th: ApoE2 (Cys112-Cys158), ApoE3 (Cys112- Arg158) e ApoE4 (Arg112-Arg158).
La differenza di amminoacidi nelle stesse posizioni rende la struttura tridimensionale dell’apolipoproteina differente e di conseguenza le 3 isoforme manifestano diversa abilità nel legarsi con i liposomi, recettori e beta amiloide [81].
ApoE2 e ApoE3 sono più abili a legare efficacemente le lipoproteine ad alta densità (HDL), mentre ApoE4 lega, preferibilmente, le VLDL. Numerosi studi hanno confermato che l’allele Apoɛ4 promuove l’aggregazione lipidica e la formazione di fibre [82].
Inoltre, studi di comparazione hanno dimostrato che il genotipo ApoE3 incrementa i livelli di fosfoinositolo difosfato (PIP2), attraverso la promozione dell’mRNA syn1
23 degradazione e sovraespressione, mentre ApoE4 ha una bassa abilità nel regolare l’mRNA syn1 degradazione ed espressione di proteine, in tal modo ApoE4 riduce i livelli di PIP2 nel cervello. La sovraespressione di syn1 conduce ad un incremento
della beta amiloide, genotipo ApoE4 associato [83].
LRP1 è il più multifunzionale recettore appartenente alla famiglia dei LDLR che legano LDL. Questa famiglia di recettori è molto vasta e sono espressi sulla superficie cellulare e partecipano al metabolismo del colesterolo, trasporto intracellulare e segnale di trasduzione, LRP1 può riconoscere ligandi multipli come l’aggregata LDL [84], ApoE, APP e Aβ.
LRP1 è altamente espressa nel fegato, polmone, cervello e specialmente in cellule gliali e neuroni.[85]. Il recupero della beta amiloide nel cervello avviene per mezzo del
recettore LRP1 di neuroni, astrociti e cellule della muscolatura liscia cerebrovascolare e degradata nei lisosomi; quando il recupero eccede rispetto alla capacità dei lisosomi nel degradare la beta amiloide nei neuroni, quest’ultima si deposita sui lisosomi producendo danno alle cellule [86]. LRP1 può essere idrolizzata
da una α e β secretasi ed è rilasciata la forma solubile LRP1 (LRP1s). Quest’ultima in periferia lega il 70%-90% di beta amiloide libera. È stato dimostrato che i pazienti con Alzheimer presentano bassi livelli ematici di LRP1s comparati con la popolazione normale e alti livelli di beta amiloide nella circolazione sanguigna; questo comporta un elevato flusso della proteina dalla periferia al cervello [87].
È stato riscontrato che un deficit nello smaltimento della beta amiloide alla periferia determina la sua deposizione nel cervello.
24 Questo risultato indica che con l’età il recupero della proteina da parte del fegato è ridotto. LRP1 nel fluido interstiziale cerebrale lega la beta amiloide e inizia la transcitosi attraverso la barriera emato-encefalica.
L’ossidazione di LRP1 sia solubile che legata alle membrane non permette il legame con la beta amiloide. Quest’ultima accumulandosi produce neuroinfiammazione che risulta essere elevata nella malattia di Alzheimer [88].
Esposizione della microglia alla fibrillare beta amiloide induce una distinta forma di fagocitosi mediata da beta1-integrina processo dipendente; tuttavia questo meccanismo è soppresso dalla presenza di citochine infiammatorie che rendono l’attività fagocitica della microglia inattiva [88]. Studi hannomostrato chela microglia
lega le fibrille amiloidi a un complesso recettore sulla superficie cellulare che attiva delle tirosin chinasi e attraverso la cascata di segnali intracellulari conduce alla trascrizione dei geni pro infiammatori mediati da Nf-κβ[89]. Le citochine
pro-infiammatorie rilevate sono TNFα, IL-1b, IL6, chemochine e specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto[90, 91].
È stato dimostrato che agonisti dei recettori LXRs come T0901317 e GW3965 sono potenti inibitoriCOX2, Mcp1, i-Nos [92].
25
2.2
Omeostasi fluida
I dati mostrano che i recettori LXR sono regolatori del fluido cerebro-spinale sia nei plessi corioidei che negli astrociti e loro terminazioni finali. L’isoforma LXRβ ha mostrato avere maggiori effetti nella regolazione delle acquoporine, mentre LXRα ha mostrato marcati effetti sul metabolismo del colesterolo [93]. Nei malati di Alzheimer
il liquido cerebro spinale è significativamente ridotto, e questo potrebbe influire sullo smaltimento della beta amiloide [94].
Anomalie nella sintesi del liquido cerebro spinale potrebbero condurre a cambiamenti nel pH, elettroliti nell’ambiente cerebrale e midollo spinale e portare a riduzione nello smaltimento dei prodotti di rifiuto che possono danneggiare i neuroni [95, 96].
Gli studi hanno rilevato un importante ruolo dei recettori LXRs nella funzione dei plessi corioidei, nelle terminazioni finali degli astrociti e anche nel volume e composizione del liquido cerebro spinale.
Il topo “knock out” di entrambe le isoforme recettoriali manifestava perdita di integrità strutturale dei plessi corioidei determinando perdita totale di E-caderina, P-caderina e B-catenina (come mostrato in figura 7).
E-caderina era assente [97] in tessuti come la colecisti che esprime soltanto l’isoforma
26 Fig. 7 Espressione dei LXRαβ nell’epitelio dei plessi coroidei ed in ependima del topo WT e nel topo LXRαβ KO. Nel topo WT di 3 mesi LXRα è espresso nei nuclei dell’epitelio dei plessi coroidei (a) e in ependima (c) mentre LXRβ (e-g) è espresso maggiormente sia nel citoplasma e sia nei nuclei. (b-d- f- h) LXRαβ del topo KO che non esprime né LXRα né LXRβ. Le frecce indicano in (b-f) cellule epiteliali che si spargono nel ventricolo laterale del topo LXRαβ KO (scala bars in a-h, 100 µm).
27
2.2.1 Plessi corioidei
Il plesso corioideo è composto da un letto capillare sul quale poggia uno strato di epitelio cuboidale mobile dei ventricoli laterali, 3° e 4° ventricolo.
L’endotelio dei capillari non è formato da giunzioni strette, ma è poroso per permettere il flusso dell’acqua dentro l’epitelio. La superficie apicale dell’epitelio che si affaccia verso il liquido cerebro spinale è formata da giunzioni serrate.
Il trasporto dell’acqua attraverso l’epitelio nel liquido cerebro spinale è mediato da acquaporina 1[98].
Acquaporina 4 non è espressa nei plessi corioidei, ma solo sugli astrociti pericapillari e loro terminazioni finali al confine tra sangue e liquido cerebro spinale del parenchima cerebrale.
2.2.2 Acquaporina 1
Nel topo knock out di acquaporina 1 si evidenzia una minima riduzione della produzione del liquido cefalo spinale pari al 30% [99], mentre nel topo knock out per
acquaporina 4 si evidenzia una massiccia riduzione del liquido cerebrospinale supportando l’ipotesi che il movimento dell’acqua avvenga entro lo spazio pericapillare piuttosto che nei plessi corioidei e villi aracnoidei, essenziale per il volume e l’omeostasi del liquido cerebro spinale.
28
2.2.3 Acquaporina 4
L’espressione di acquaporina 4 nel topo knock out per i recettori LXRs risulta incrementata a livello della materia bianca che circonda i ventricoli, ma non nei neuroni del topo.
Questo suggerisce che i recettori LXRs hanno una funzione di sovrapposizione nel regolare acquaporina 4, in ependima e astrociti. Da studi sul topo è emerso che i ligandi che attivano LXRs possono sovraregolare acquaporina 1 e sottoregolare acquaporina 4, suggerendo che può essere regolato il bilancio omeostatico nella produzione del liquido cefalo spinale nei plessi corioidei e nelle terminazioni finali degli astrociti. L’acquaporina 4 è il più abbondante canale dell’acqua in contatto con il compartimento vascolare cerebrale [100, 101].
2.2.4 Acquaporina 9
Il topo knock out dei recettori LXRs, mostra un incremento dell’espressione acquaporina 9 nel parenchima che circonda i ventricoli laterali, accumuli microgliali e un aumento delle proteine Heat Shock (HsP25) [102] nei plessi corioidei e
nell’ependima, evidenziando che quest’area del cervello risponde allo stress.
Acquaporina 9 ha importanti ruoli nel cervello, essendo una glicero-porina facilita la diffusione di acqua, urea, glicerolo e monocarbossilati [103], ed è presente negli
29 Essa è costituita da due isoforme, una di 26 kDa sulle membrane del mitocondrio e una di 30 kDa sulle membrane cellulari [107].
L’acquaporina 9 è sottoregolata da incremento nella circolazione ematica dei livelli d’insulina [108] e favorisce lo smaltimento del lattato dallo spazio extracellulare [109].
È stato evidenziato anche, che recettori LXRs regolano l’anidrasi carbonica IX un enzima contenente zinco e che catalizza l’interconversione tra CO2 e HCO3̅
.
In aggiunta al suo coinvolgimento nella regolazione del pH, l’anidrasi carbonica ha un importante ruolo nella produzione del liquido cerebro spinale [110].
È stato suggerito che la stimolazione dell’anidrasi carbonica IX potrebbe essere presa in considerazione come trattamento farmacologico nella patologia di Alzheimer [111],
il razionale incremento del liquido cefalo spinale potrebbe migliorare lo smaltimento di tossine dal CSF.
Gli antidepressivi inibitori del recupero della serotonina, come fluoxetina, citalopram e sertralina sono potenti attivatori dell’anidrasi carbonica IX e questa loro proprietà potrebbe risultare benefica nei pazienti con Alzheimer [112].
30
3
Strategie terapeutiche
3.1
GW3965
GW3965 è un agonista diretto dei recettori LXRs, studiato per verificare nuovi potenziali meccanismi che entrano in gioco nel migliorare le facoltà cognitive.
Il farmaco è stato somministrato per 12 settimane in un topo di 12 mesi triplo transgenico 3xTg AD, un topo che somiglia più da vicino alla caratteristica patologia umana di Alzheimer con placche amiloidi, patologia tau e disfunzione precoce delle sinapsi [113-115].
I topi femmine e maschi sono stati randomizzati e ugualmente distribuiti, e trattati ogni giorno con una dose orale di 33mg/kg di GW3965 o con veicolo.
La memoria ippocampo-dipendente è stata valutata usando il metodo “Water Morris Maze” [116], studiando le abilità tra i 3xtg AD trattati e non trattati, Wild Type trattati
e non trattati. [117]
Studi di comparazione dimostrano che il trattamento con GW3965 nel 3xtg AD migliora l’orientamento ippocampo dipendente e il deficit cognitivo.
Il trattamento incrementa i livelli di espressione delle proteine ApoE e ABCA1 valutate attraverso analisi Western Blotting dell’ippocampo e tessuto corticale di vari gruppi di animali Wild type e 3xtg AD trattati e non trattati con GW3965.
Nella corteccia cerebrale l’espressione di ABCA1 incrementa di 6 volte nei topi trattati wild type comparati con i non trattati wild type, mentre incrementa di circa 3 volte nei topi 3xtg AD trattati comparati con i non trattati wild type e 3xtgAD.
31 Nella corteccia cerebrale l’espressione di ApoE non subisce cambiamenti, mentre nell’ippocampo dei topi 3xtgAD trattati con GW3965, si misura un incremento pari a 2 volte quando comparati con i Wild Type e 3xtgAD non trattati (fig.8).
FIG. 8 I livelli di proteine ApoE e ABCA1 nel cervello sono stati sovraregolati dal trattamento con l’agonista LXR.
(A) I livelli nel cervello dei geni target LXR valutati con analisi Western Blot nell’ippocampo e nella corteccia.
Immagine rappresentativa di ApoE, ABCA1 e β-actina rilevate con Western Blot nella corteccia e nell’ippocampo del topo WT o 3xTg-AD trattato con veicolo o GW3965. (B) saggi di quantificazione densiometrica di ApoE e ABCA1 Western Blot nei lisati della corteccia cerebrale e dell’ippocampo dei topi WT e 3xTg-AD trattati con veicolo o GW3965. I campioni di ogni topo sono stati normalizzati con actina. Il dato è espresso come media ± S.E.M. analisi statistica effettuata con ANOVA unidirezionale test di comparazione multipla di Tukey, n = 5 per gruppo. ***: p < 0.001; *: p < 0.05 confrontato con WT; #: p < 0.05; ##: p < 0.01 confrontato con non trattati 3Tg-AD.
Nei granuli dello strato cellulare del giro del cingolo e nel giro dentato dei topi 3xtg AD trattati si rileva un’elevata espressione di ApoE quando comparati con quelli non trattati Wild Type e 3xtgAD (fig.9); inoltre si evidenzia con immunofluorescenza una
32 larga area di GFAP (proteine acide fibrillari della glia) immunoreattiva nel 3xtg AD in accordo con le altre recensioni [118] (fig.10).
Fig. 9 Incrementata ApoE con particolare immunofluorescenza nel topo 3xTg-AD trattato con l’agonista LXR.
(A) Micrografia rappresentativa di ApoE (Verde) con immunofluorescenza usando microscopia
con focale in differenti regioni analizzate: Ippocampo (DG, CA3 e CA1) Corteccia entorinale (Ent Cx) e Neocorteccia bei topi trattati-non trattati WT e 3xTg-AD. (B) Analisi comparativa tra i gruppi trattai e non trattati dell’area immunoreattiva occupata da ApoE, dato espresso come media ± S.E.M. Analisi statistica effettuata da ANOVA unidirezionale seguita da Bonferroni post test.*: p<0.05, **: p<0.01. n = 4 per gruppo.
33 Fig. 10 L’attivazione di LXR riduce l’astrogliosi nei topi trattati 3xTg-AD.
(A) Microfotografia rappresentativa di GFAP (Rosso) immunoistochimica e Hoechst e la didascalia mostra ApoE (Verde) dello strato granulare. GFAP (Rosso) e Hoechst (Blu) usando microscopia confocale su una sezione nel DG dell’ippocampo. Sono indicati: nella figura in alto a sinistra è rappresentata la sezione del cervello del topo WT trattato con (DMSO) con immunoreattività di riferimento. Nella figura in alto a destra è rappresentata la sezione del cervello del topo trattato con GW e non è evidenziato un cambiamento significativo in seguito al trattamento. Nelle figure in basso sono rappresentate le sezioni del cervello nel gruppo dei topi controllo 3xTg-AD e trattati con GW3965, indicando una riduzione significativa della GFAP immunoreattiva in seguito al trattamento GW. Due differenti popolazioni di cellule sono state identificate: (a) cellule esprimenti ApoE e (b) cellule esprimenti ApoE and GFAP. Sono anche rappresentate in ingrandimento le regioni dello strato molecolare, che sono incluse in alto a destra di tutte le immagini, per apprezzare il cambiamento nella morfologia degli astrociti in 3xTg-AD trattati con GW3965.
(B) Analisi quantitativa dei dati presentati in A, indica cambiamenti significativi nei topi 3xTg-AD trattati con
GW3965 prodotti nelle aree GFAP positive. Si noti che i topi 3xTg-AD, i quali rappresentano il controllo, hanno un significativo aumento dell’area GFAP, indicante astrogliosi ;essa si riduce dopo il trattamento con GW. Analisi statistica effettuata da unidirezionale ANOVA seguita da Bonferroni post-test.
(C) Rappresentazioni di ingrandimento con microscopia confocale (60X) e micrografie ad immunofluorescenza di GFAP (Rosso), ApoE (Verde) Hoechst (Blue) dello strato granulare DG dei topi trattati 3xTg-AD. La soglia di collocazione indicata in bianco mostra una piccola popolazione di cellule con incrementata espressione di ApoE. I dati sono espressi come media ± S.E.M., le differenze sono confrontati con i WT: *: p<0.05, **: p<0.01; n = 4 per gruppo.
L’attivazione dei LXRs con GW3965 riduce l’area immunoreattiva del 3xtgAD rispetto al controllo. Questo risultato è in linea con altri report che attribuiscono ai recettori LXRs un’azione anti infiammatoria [119].
34 Nel topo 3xtgAD il trattamento con GW3965 mostra un significativo aumento di ApoE sia nel giro del cingolo che nello strato granulare senza mostrare astrogliosi. Nel topo 3xtgAD trattato con GW3965, si osserva un aumento dell’espressione di cellule staminali e un incremento della proliferazione rispetto ai topi 3xtgAD non trattati.
Nei topi trattati con il farmaco, si individua una piccola popolazione di cellule sovraesprimente ApoE e gliosi soprattutto nella zona sub-granulare (fig.11).
35 Fig. 11 GW3965 aumenta l’immunoreattività della nestina e il numero di
cellule proliferanti nell'ippocampo dei topi 3xTg-AD.
(A) Micrografie rappresentative di immunofluorescenza multipla di ApoE (verde) più nestina (rosso) affiancate solo con nestina (Rosso) immunofluorescenza in DG usando la microscopia confocale per topi WT e 3xTg-AD trattati e non trattati. (B) La quantificazione di immunofluorescenza della nestina positiva nel SGZ del DG. (C) Micrografie Rappresentative di ApoE (verde) e nestina (Rosso) immunofluorescenza (60X), la soglia di colocalizzazione di ApoE e nestina indica che è presente una popolazione di cellule con un aumento dell'espressione ApoE. (D) Micrografie rappresentative del DG dei topi WT e 3xTg-AD trattati e non trattati che mostrano l'immunofluorescenza di ApoE, affiancato con il fosfo-istone H3 (Ser10) (Rosso) più Hoechst (blu). (E) Quantificazione del numero di nuclei-positivi etichettati con pHH3 (rosso) e Hoechst (blu). (F) Micrografie rappresentative di ApoE (verde) e fosfo-H3 (rosso) immunofluorescenza e nuclei Hoechst (blu, 60X), dimostrano la presenza di cellule proliferanti con aumento nell'espressione di ApoE. I dati sono espressi come media ± S.E.M. analisi statistica effettuata da ANOVA unidirezionale seguita da Bonferroni post test.*: p<0.05, **: p<0.01. n = 4 per gruppo.
36 GW3965 incrementa i livelli di LRP1 in cellule neuron-like con un parziale miglioramento della morfologia microvascolare determinata dalla riduzione della tortuosità e incremento nella lunghezza. Questi cambiamenti sono associati con un decremento della beta amiloide nei vasi sanguigni [120] (come mostrato in fig.12).
Fig. 12 Modello per il meccanismo d’azione nel trattamento a breve termine ad alte dosi di GW3965 in topi anziani 3xTg AD. Nella figura a sinistra: il topo 3xTg AD prima del trattamento mostra diversi cambiamenti patologici, come accumulo di placche amiloidi, astrogliosi, microglia attivata, riduzione della lunghezza endoteliale e tortuosità dei vasi sanguigni che possiedono depositi di Aβ. Tutti questi cambiamenti sono associati con il declino cognitivo come riportato prima. La figura a destra: dopo 6 giorni di trattamento con GW3965 (50mg/Kg/giorno), c’è una riduzione di astrogliosi, parziale attivazione della microglia che può essere coinvolta nella riparazione della BEE la quale è associata con una ristorazione della morfologia dei vasi sanguigni, un incremento nella lunghezza endoteliale e una diminuzione nella deposizione della Aβ nel microcircolo vascolare. Questi cambiamenti protettivi nella BEE possono contribuire al miglioramento cognitivo osservato.
37 L’agonista GW3965 dei recettori LXRs dimostra con successo di poter modulare la neuroinfiammazione e il metabolismo lipidico, questo in parte è dovuto alla maggiore espressione dei livelli ApoE e ad una maggiore mobilità delle cellule progenitrici endoteliali. In conclusione l’agonista GW3965 dei recettori LXRs incrementa i livelli di espressione di ABCA1 nella corteccia e nell’ippocampo; inoltre promuove neurogenesi in vitro da cellule staminali embrionali umane e nel mesencefalo durante lo sviluppo [121-123].
GW3965 migliora la trasmissione sinaptica e la sintesi proteica in modo sintesi dipendente. Il fatto che l’attività ribosomiale sia richiesta per osservare l’effetto del GW3965 sulla funzione sinaptica, significa che i recettori LXRs regolano rapidamente la sintesi proteica relativa alla funzione sinaptica.
Il trattamento a lungo termine con GW3965 riduce l’astrogliosi e determina il recupero della funzione di neurogenesi; nel trattamento a breve termine si evidenziano miglioramenti nell’architettura microvascolare [120] nel topo 3xtgAD,
38
3.2
Composti sperimentali
Numerosi composti agonisti non selettivi dei recettori LXRs sono stati riportati in letteratura. Gli agonisti GW3965 e TO901317 (fig.13) sono stati quelli maggiormente studiati che hanno mostrato nel topo la capacità di ridurre le placche aterosclerotiche, ma l’attività lipogenica e gli eventi avversi ne hanno limitato lo sviluppo [39,124].
Fig. 13
39 Il composto 9 (fig.14) è un agonista puro del recettore LXRβ e solo parzialmente agonista dell’isoforma α.
In aggiunta alle favorevoli proprietà fisiche per la penetrazione nel sistema nervoso centrale (cervello di ratto/plasma ratio=0,62), il composto 9 ha esibito un buon profilo farmacocinetico con una risposta non significativa < 10μM in un “panel” di 36 enzimi e recettori così come in un “panel” di 18 recettori ormonali nucleari; sebbene la quantità eliminata in vivo nel ratto fosse alta (rat Cl=87 ml/min/kg; t½=2,9h; Vdss=8,8 L/kg; %F=71, rat PBB=98,2%), per gli studi di farmacodinamica
(in cui bisognava ottenere concentrazioni plasmatiche sufficienti), il farmaco è stato somministrato per via sottocutanea.
La PK del topo era comparabile con quella di ratto, con delle oscillazioni lievemente superiore osservate con livelli di dosaggio simili.
Lo smaltimento del composto 9 era basso nella scimmia rhesus (Cl=18ml/min/kg; t½=2,0h; Vdss=2,7 L/kg; %F=77%; PPB=99,3%), sottoposta a un dosaggio con somministrazioni giornaliere multiple al fine di consentire lo studio.
Precedenti studi hanno dimostrato che gli agonisti dei recettori LXRs, compreso i ligandi naturali, inducono cambiamento conformazionale dell’elica 12 e del dominio AF2 richiesti per l’attivazione del recettore [125].
Due amminoacidi conservati nel dominio legame ligando His435 e Trp457 (numerazione LXRβ), interagiscono nella tasca con l’agonista, supponendo il funzionamento come interruttori, tali da condurre a un cambiamento conformazionale del dominio AF2 (Fig. 15 e 16).
40 Gli effetti del composto 9 sono stati valutati in un modello pre-clinico, dove è stata riscontrata una moderata selettività come agonista β con accettabili capacità di penetrazione nel cervello e proprietà farmacodinamiche.
Il saggio della trans-attivazione in linee cellulari umane derivate da colture di neuroglioma H4 per LXRβ e colture di neuroblastoma HepG2 per LXRα, ha evidenziato un’omologia di specie con i paraloghi LXR, riscontrando nel dominio del DNA legame-ligando un’alta conservazione [126] tra il ratto e l’uomo portando a
41 Fig. 15
42 Gli studi sul topo servono principalmente a prendere confidenza sul profilo di efficacia e sicurezza verso studi di ricerca intensivi rivolti al primate non umano. I saggi preliminari con il composto 9 nel ratto con dosi sottocutanee somministrate per 4 giorni hanno mostrato una favorevole risposta farmacodinamica determinata da incrementi dei livelli di ApoE e beta amiloide misurati nel liquido cefalo spinale; inoltre non sono stati osservati cambiamenti dei trigliceridi nel fegato o nel plasma, confermando il migliorato profilo del margine di sicurezza lipidica comparato con quello degli agonisti non selettivi.
Tuttavia per la completa valutazione del potenziale lipogenico è stato necessario somministrare il composto 9 a lungo termine alle concentrazioni sub croniche, anche per confermare meglio il profilo del margine di sicurezza lipidica. Per questo studio è stato impiegato un topo transgenico amiloidogenico, il tg2576, sovraesprimente sia il peptide beta amiloide che la presenza di placche senili, simili a quelle riscontrate nella malattia di Alzheimer.
Il topo tg2576 di 12 mesi è stato trattato con dosi sottocutanee per 3 settimane, al dosaggio di (10mg/kg) con il composto 1 o con il composto 9 al dosaggio di (50mg/kg).
L’efficacia del composto 9 nel cervello è stata confermata da un notevole aumento nei livelli delle proteine dei geni target LXR ABCA1 e della solubile ApoE (Fig.17)
43 Fig. 17 Efficacia nel topo: livelli dei biomarcatori LXRβ nel cervello. (a) aumento livelli ABCA1 nel cervello. (b) incremento della proteina ApoE solubile nel cervello di topo, la linea tratteggiata rappresenta i livelli del controllo con veicolo. (c) diminuzione dei livelli Aβ del cervello nella DEA-solubile
inoltre, è stata rilevata una riduzione di DEA solubile nei livelli di beta amiloide, mentre la tendenza verso il basso a causa della variabilità non ha raggiunto il livello di significato statistico per l’analisi ANOVA.
Il composto 9 non ha causato nessun cambiamento considerevole dei livelli di trigliceridi nel plasma e nel fegato quando confrontato con il veicolo, a differenza dei topi trattati con l’agonista non selettivo 1 che mostravano livelli significativamente elevati (fig.18).
44 Fig. 18 Lipidi nel Topo: biomarcatori dei lipidi nel fegato.
In aggiunta all’analisi farmacodinamica, nel topo tg2576 è stato anche investigato il potenziale effetto comportamentale conseguente al trattamento al regime di dosaggio. Il topo transgenico ha mostrato un aumento dell’attività locomotoria, quando comparato con il Wild Type controllo, (questo fenotipo è correlato ad un elevato accumulo di beta amiloide nel cervello).
La valutazione dell’attività locomotoria è stata effettuata in campo aperto con i topi sopra citati per 3 settimane di studio e dopo 16 giorni di dosaggio.
Il composto 9 ha dimostrato una capacità nel migliorare il comportamento locomotorio al dosaggio sottocutaneo di (50mg/kg).
45 Studi di efficacia e sicurezza lipidica sulla scimmia rhesus:
Gli studi effettuati sul topo relativi al profilo del margine di sicurezza lipidica hanno mostrato dati incoraggianti, bisogna tuttavia tener presente che esistono delle differenze tra le specie. Per esempio CETP è una proteina non espressa nel topo e nel ratto che facilita il trasporto degli esteri del colesterolo e trigliceridi attraverso le lipoproteine.
Essa gioca un ruolo importante nella distribuzione dei lipidi tra HDL e LDL nell’uomo.
L’espressione di CETP è anche direttamente regolata dai recettori LXRs [128].
Per valutare gli effetti del composto sui lipidi periferici sono state effettuate misurazioni dei livelli di trigliceridi nel siero utilizzando metodi non invasivi come la risonanza magnetica spettroscopica valutando i cambiamenti del contenuto di grasso nel fegato.
Lo studio è stato compiuto comparando il composto 9, per un periodo di 2 settimane, con due agonisti non selettivi dei recettori LXRs, i composti 1 e 5 (fig.19) [129].
Il composto 5 ha mostrato piena restrizione periferica e un aumento significativo dei livelli di trigliceridi nella scimmia cynomolgus al dosaggio ≥ 3 mg/kg.
Per due settimane il dosaggio quotidiano del composto 9 è stato di 10 mg/kg e 20mg/kg, mentre per il composto 1 di 10 mg/kg e per il composto 5 di 5 mg/kg dose. Tre campioni di siero di ogni scimmia sono stati prelevati prima che iniziasse lo studio per valutare il profilo lipidico e il profilo biochimico clinico.
46 Attraverso la risonanza magnetica sono stati valutati i contenuti lipidici nel fegato e prelevato un campione del liquido cerebro spinale da ogni scimmia, mediante puntura lombare.
Le scimmie sono state randomizzate in modo tale da evitare differenze statistiche significative tra i gruppi, per tutti i contenuti medi basali dei lipidi serici, degli enzimi e dei grassi epatici.
I contenuti dei lipidi epatici, i campioni di siero ed il liquido cerebro spinale sono stati valutati l’ultimo giorno di somministrazione.
Fig. 19
Come mostrato in Fig. 20a e 20b nelle 2 settimane di trattamento ad entrambi i dosaggi 10mg/kg e 20mg/kg del composto 9, si è evidenziato un forte effetto farmacodinamico che ha prodotto nel CSF un incremento dei livelli di ApoE pari a 3 volte. È stato notato un sostanziale accumulo del composto 9 al dosaggio di 20 mg/kg nelle due settimane di trattamento, determinando una stimata Cmax di 18μM; questo
47 effetto non è stato osservato al dosaggio di 10mg/kg, in cui la Cmax era approssimativamente di 1μM.
Il composto 9 in entrambi i gruppi di dosaggio ha determinato livelli simili di ApoE, pari a 3-4 volte l’incremento nel liquido cerebro spinale, dovuto probabilmente alla prevista risposta massimale dell’agonista LXR nel SNC.
Fig. 20a
48 A supporto di questa tesi, nelle due settimane di trattamento, il composto 1 agonista non selettivo per le isoforme LXRs ha mostrato una piena penetrazione nel cervello e un incremento nel liquido cerebro spinale di ApoE pari a 4 volte.
Al contrario, il composto 5 non ha raggiunto i centri encefalici, fatto determinato per la maggior parte dall’alto efflusso mediato dalla glicoproteina P (Pgp), e non ha prodotto incrementi dei livelli di ApoE nel liquido cerebro-spinale ma un aumento considerevole nel plasma.
Questi dati indicano che gli aumenti dei livelli di ApoE nel CSF sono dovuti ai composti 1 e 9 che penetrano nel cervello e non al trasporto di ApoE dalla periferia al CFS.
Il trattamento con il composto 1 e 9 ha determinato nella scimmia rhesus anche un incremento del 25% nel CSF, sia della beta amiloide 40 che della beta amiloide 42 (Fig. 21).
Fig. 21
Variazioni della Aβ nel CSF rispetto alla linea base nelle due settimane di studio sulla scimmia rhesus
49 L’incremento della beta amiloide nel fluido spinale è dovuto probabilmente al trasporto fuori dal parenchima cerebrale e in ultimo ad un decremento dei livelli di beta amiloide nel cervello.
Lo studio ha evidenziato che il composto 9 non ha prodotto alterazioni del contenuto dei grassi epatici come misurato dalla risonanza magnetica (Fig. 22),
Fig. 22 I grassi contenuti nel fegato nelle 2 settimane di studio sulla scimmia rhesus.
sottolineando il potenziale vantaggio di utilizzare l’agonista selettivo LXRβ. Le scimmie trattate con il composto 9 al dosaggio di 10mg/kg o 20 mg/kg hanno mostrato una percentuale del contenuto dei grassi nel fegato simile a quelle del veicolo; invece, le scimmie che sono state trattate con dosaggi del composto 1 o 5
50 hanno evidenziato un aumento 4 volte maggiore dei grassi epatici, come misurato da immagini della risonanza.
Da notare che, nonostante il composto 9 non abbia alterato significativamente il colesterolo totale nel fegato e nel siero è stata osservata una Emax di LXRα a concentrazioni plasmatiche superiori in vitro che hanno causato un aumento significativo dei livelli di LDL e una corrispondente diminuzione del rapporto colesterolo HDL/LDL.
Questi cambiamenti nel colesterolo tra HDL e frazione LDL, possono essere attribuiti alla sovraregolazione dei livelli delle proteine CETP (in cui è stato osservato un incremento di 2,8 volte al dosaggio di 20mg/dose).
51
4
Conclusioni
I recettori LXRs rappresentano bersagli molecolari promettenti nel trattamento della patologia di Alzheimer, considerata la loro capacità nel regolare i fattori chiave come ApoE, ABCA1 e LRP1 coinvolti nell’omeostasi del colesterolo, nello smaltimento della beta amiloide dall’ambiente cerebrale, nell’inibire la neuroinfiammazione, nel migliorare le sinapsi e la neurogenesi.
Una miglior comprensione del corretto funzionamento potrebbe aprire le strade per la cura di diverse patologie.
L’aver individuato un agonista dell’isoforma β come strategia terapeutica per il trattamento della malattia di Alzheimer, indirizza la ricerca farmaceutica verso nuove molecole in grado di esplicare maggiori effetti a livello del recettore LXRβ del sistema nervoso centrale, minimizzando gli effetti collaterali a livello periferico.
52
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