1 Esami coagulativi

(1)

47

RISULTATI

1 Esami coagulativi

1.1

Dosaggio del Fg secondo Clauss e Tempo di trombina TT

a)I risultati degli esami ematologici eseguiti dal pz in esame (P.L), dai 20 controlli con malattia (MM) e dai 4 controlli sani sono riportati nella TAB 1A sottostante. Gli esami coagulativi eseguiti dal pz in studio (P.L) presso la nostra UO mostravano un’alterazione del TT e del Fg coagulabile (esami del 06/04), che risultavano entrambi incoagulabili. A seguito di trattamento con desametasone (20+20 mg/die dal 7/5 al 10/5 e dal 26/5 al29/5) i successivi esami (04/06) evidenziavano un miglioramento del quadro coagulativo con valori ridotti di TT, sebbene mai rientrati nel range di normalità (<16.6 sec) e un aumento dei livelli di Fg coagulativo, che rientrava nella norma (295mg/dl). Il Fg coagulabile tuttavia andava progressivamente riducendosi nei mesi successivi alla terapia. b)Come si può notare dai risultati riportati in TAB 1A 4 dei pz con MM del gruppo di controllo, indipendentemente dal tipo di MM, mostravano un allungamento del TT a fronte di valori normali di Fg coagulativo. Questi pz saranno oggetto di ulteriori indagini riguardo il profilo coagulativo. c) I controlli sani presentano tutti valori di TT e Fg coagulativo nel range di normalità.

Numero PAZIENTE STATO DI SALUTE TT (sec) FIBRINOGENO

mg/dl

1 O.M MM 14.8 386

2 F.P MM 13.6 349

3 C.C.J MM 30.3 272

4 P.I MM 16.2 231

5 B.A MM 14.9 335

6 L.R MM 14.6 202

7 D.S.A MM 17.1 252

8 G.A. MM 17.9 369

9 B.E MM 14.6 292

10 G.S MM 16.3 397

11 C.L. MM 16.6 244

12 D.R MM 13.9 359

13 B.R MM 14.7 771

14 B.P.G MM 15.9 292

15 M.A. MM 13.6 327

16 O.C MM 16 403

17 M.R MM 16 285

18 Z.I. MM 15.2 443

19 L.G. MM 12.5 603

20 B.A MM 16.2 310

P.L (06-04) Inc inc

P.L (04-06) 20 295

P.L. (19/06) 18.8 174

P.L (08/07) 21,3 133

P.L (06/08) 21,3 142

P.L (23/08) Inc 116

P.L (10/09) Inc 88

Controllo sano 15.3 218

TAB 1A Dosaggi

TT e Fg

coagulativo secondo Clauss V.N.

TT: 10.3-16.6 sec V.N.

FIBRINOGENO:

150/400 mg/dl

(2)

48

1.2

Dosaggi del fibrinogeno del paziente P.L. in un mixing test 1:1 con aggiunta di pool di plasma normale (PPN) a tempi diversi e temperature diverse.

Abbiamo analizzato il plasma/siero del paziente, raccolto in date diverse; i risultati ottenuti ci permettono di porre alcune considerazioni:

-06/04/2013:il paziente (prima della tp con desametasone) presentava un fibrinogeno incoagulabile; la miscela 1:1 con pool non induce alcun incremento dei valori di fibrinogeno (t0); l’incubazione a 37°c per 1 e 2 ore ( t1 e t2) non apportava modifiche al risultato di partenza.

-04/06/2013: il paziente (dopo terapia con Desametasone) mostra incremento dei valori del fibrinogeno (295). Al t0 la miscela 1:1 mostra un valore di Fg vicino al teorico atteso (318 vs 306).

Ugualmente non si riscontrano differenze dopo 1 e 2 ore di incubazione a 37°C.

- 08/07/2013: dopo circa 45 giorni dal termine della terapia si rileva nuova riduzione dei valori di Fg in P.L. ma il mixing test (al t0, dopo incubazione di 1 e 2 h a 37°C) non mostra discordanze significative dei valori rispetto a quelli attesi.

Fg pool (PPN)318

TAB 1B PRIMA PROVA a 37 °C

Data prelievo Materiale Dosaggio Fg 1:1 NPP/pz T 0 1:1 NPP/pz T +1 h 37°C 1:1 NPP/pz T+ 2 h 37°C Valori attesi

06/04/2013 citrato inc inc Inc Inc 159

04/06/2013 citrato 295 318 310 299 306

siero 151

136 (precipitato nella

provetta) 140

08/07/2013 citrato 133 252 227 229 225

(3)

49 TAB 1C SECONDA PROVA a 4°C

Data prelievo Materiale Dosaggio Fg 1:1 NPP/pz T 0 1:1 NPP/pz T +1 h 4°C 1:1 NPP/pz T+ 2 h 4°C

06/04/2013 Citrato Inc inc Inc inc

04/06/2013 Citrato 295 303 295 292

08/07/2013 Citrato 133 231 231 241

Non conoscendo l’ ipotetico sito di legame della catena leggera sulla molecola del fibrinogeno abbiamo effettuato la prova anche a 4°C, in quanto, se il legame fosse in corrispondenza di un gruppo glucidico, a questa temperatura la catena leggera si staccherebbe più facilmente dal fibrinogeno.

Il fibrinogeno del paziente P.L., sui campioni del 06/04/2013, rimane indosabile. I valori dei campioni del 4/6/2013 e dell’8/7/2013 non si discostano da quelli ottenuti a 37°C.

Calcolo dei valori attesi: (X/2)+(Y/2) dove X:PPN (318) e Y:plasma del pz

1.3

Prove di mixing dopo purificazione del Fg

1.3.1 Prove di mixing su Fg purificato PPN (Fg 292) e Fg purificato P.L. su prelievo del 6/4 (Fg non dosabile) a diverse diluizioni

TAB 1D

DILUIZIONE VOLUME l Fg PZ VOLUME l Fg PPN

Fg (mg/dl) Valore Fg atteso del PPN dopo mix (mg/dl)

1/10 30 270 239 263

1/5 40 160 216 234

½ 100 100 173 146

5/1 160 40 125 58

10/1 270 30 121 29

15/1 186.7 13.3 125 19

(4)

50

Prove di mixing con fibrinogeno purificato PPN e Fg purificato P.L. (campione del 6/4: fibrinogeno coagulativo non determinabile). Rispetto al Fg atteso si osserva una progressiva riduzione dello stesso, con massima caduta alla diluizione 1:2. A partire dalla diluizione 5:1 i valori del Fg rimangono pressoché costanti. Si potrebbe ipotizzare interferenza della catene leggere legate al fibrinogeno di P.L. che però sembrerebbero raggiungere un punto di “saturazione” senza ulteriori cadute, nonostante il progressivo incremento della concentrazione del Fg di P.L.

I valori attesi del Fg , a varie diluizioni, venivano calcolati secondo le seguenti formule (medie ponderate):

Fg atteso alla diluizione x/y = Fg purificato PPN x (y-x) DENOMINATORE(y)

1.3.2

Prove di mix su plasma P.L. del 6/4 (Fg inc) con fibrinogeno purificato PPN (Fg = 292 mg/dl) TAB 1E

Diluzione Volume l Fg PPN Volumelpl pz Fg mg/dl Fg atteso mix

1/5 40 160 inc 58

½ 100 100 43 146

5/1 160 40 214 234

Il test successivo è stato eseguito utilizzando diluizioni scalari tra plasma di P.L. e fibrinogeno purificato PPN. Nella miscela 1:2 possiamo riscontrare una ripresa della funzionalità coagulativa del Fg di P.L., assente nella diluizione 1:5. Nonostante l’incremento della quota di Fg purificato PPN, non si raggiunge mai il valore teorico atteso del Fg della mix.

I valori attesi, a varie diluizioni, venivano calcolati secondo le seguenti formule (medie ponderate):

(5)

51

1.3.3

Prove di mixing tra Fg purificato PPN e Fg purificato dei 4 campioni patologici di controllo

Sono state effettuate prove di mixing con Fg purificato dei 4 campioni risultati patologici, evidenziati fra il gruppo dei 20, in quanto avevano un tempo di trombina allungato: controlli 3, 7, 8 e 11 . Sono state fatte diluizioni scalari con il Fg purificato dei controlli ed il Fg purificato di un Pool di Plasma Normali (PPN).

TAB 1F: Paziente di controllo n 3 Fg= 120 mg/dl; Fg PPN= 108 mg/dl DILUIZIONE VOLUME ul Fg

controlli

VOLUME ul Fg PPN

Fg (mg/dl) Valore Fg atteso del PPN dopo mix con Fg controlli (mg/dl)

1/10 30 270 98 109,2

1/5 40 160 107 110,4

½ 100 100 117 114,0

5/1 160 40 117 117,6

10/1 270 30 111 118,8

15/1 186.7 13.3 111 119,2

TAB 1G: Paziente di controllo n 7 Fg= 102 mg/dl; Fg PPN= 97 DILUIZIONE VOLUME ul fg

PZ

VOLUME ul Fg PPN

Fg (mg/dl) Valore Fg atteso del PPN

dopo mix

(mg/dl)

1/10 30 270 104 97,5

1/5 40 160 104 98,0

½ 100 100 99 99,5

5/1 160 40 100 101,0

10/1 270 30 87 101,5

15/1 186.7 13.3 95 101,6

TAB 1H: Paziente di controllo n 8= 117 mg/dl; Fg PPn = 97 mg/dl

DILUIZIONE VOLUME ul fg PZ

VOLUME ul Fg PPN

Fg (mg/dl)

Valore Fg atteso del PPN

dopo mix

(mg/dl)

1/10 30 270 102 99

1/5 40 160 103 101

½ 100 100 110 107

5/1 160 40 111 113

10/1 270 30 108 115

15/1 186.7 13.3 134 115,6

(6)

52

TAB 1I : paziente di controllo n 11 Fg= 74 mg/dl; Fg PPN= 97 mg/dl DILUIZIONE VOLUME ul fg

PZ

VOLUME ul Fg PPN

Fg (mg/dl) Valore Fg atteso del PPN

dopo mix

(mg/dl)

1/10 30 270 91 103,7

1/5 40 160 117 100,4

½ 100 100 98 90,5

5/1 160 40 84 80,6

10/1 270 30 80 77,3

15/1 186.7 13.3 78 76,2

I valori di Fg rilevati, dopo mixing test a diverse diluizioni, non si discostano dai valori attesi.

I valori attesi, a varie diluizioni, venivano calcolati secondo le seguenti formule (medie ponderate):

(7)

53

2 Studio morfologico del midollo

2.1

Aspirato midollare

Lo studio morfologico del midollo mostrava nel paziente:

“Elevata cellularità dei preparati. Linee emopoietiche vivacemente rappresentate, ognuna con progressione maturativa conservata. Modica diseritropoiesi. Linfociti nei limiti. Plasmacellule 4-5%, in genere di piccola taglia.”(vedi Fig2.1)

FIG2.1: Il preparato mostra la presenza di una plasmacellula binucleata (freccia)

(8)

54

FIG 2.2: Midollo tendenzialmente ipercellulato con una plasmacellula contenete un corpo di Russel (freccia) I corpi di Russel sono vacuoli ialini di dimensioni e grandezza variabili, rappresentanti accumuli di mucopolisaccaridi e immunoglobuline nel lume di sacculi dilatati del reticolo endoplasmatico.

(9)

55

2.2

Biopsia osteomidollare

Referto BOM del19/7/2013: “Prelievo adeguato con cellularità del 65%. Linee emopoietiche normorappresentate, normomaturanti. Sono presenti un 8% di piccoli linfociti interstiziali a prevalente immunofenotipo T ed un 4% di plasmacellule politipiche. Colorazione con il Perls per emosiderina negativa;

trama reticolinica focalmente infittita in modo lieve. Colorazione con il Rosso Congo per la ricerca di amiloide negativa.

Non evidenza id infiltrazione sostitutiva.”

FIG 2.3Colorazione ematossilina/eosina

(10)

56 FIG 2.4Immunoistochimica con CD138

(11)

57 FIG 2.5Colorazione per catene leggere k

FIG 2.6 Colorazione per catene leggere λ

(12)

58

2.3

Studio citofluorimetrico del midollo

La citofluorimetria su sangue midollare mostrava: “una popolazione plasmacellulare costituita in prevalenza (80%) da elementi con fenotipo anomalo CD19-,CD45-,CD27- e con restrizione per le catene leggere intracitoplasmaticheK. Marcatori addizionali indagati: CD117-,CD20-,CD56-. La rimanente popolazione plasmacellulare appare policlonale, con rapporto K/lambda pari a 2:1.”

FIG2.7

(P1) : popolazione mononucleata del midollo

FIG 2.8

Da P1 deriva P2> popolazione rappresentata dalle plasmacellule (CD138+-CD38+ in simultanea)

(13)

59

Test di clonalità eseguiti separatamente sulle due popolazioni P3 e P4 Q4 catene k intracitoplasmatiche, Q1 lambda intracitoplasmatiche. Il rapporto (35.3/29.1) ci dà il rapporto k/lambda della popolazione normale.

Il rapporto Q4-1/Q1-1 ci dà il rapporto k/lambda del clone patologico, nettamente a favore del k. I quadranti residui contengono artefatti.

Analisi di biologia molecolare: PCR per riarrangiamento IgH risultava positiva.

FIG 2.9

Collegate a P2 derivano 2 popolazioni distinte : P3 in verde, plasmacellule con fenotipo normale (CD19+); la popolazione P4 fucsia: plasmacellule CD19-, quindi potenzialmente patologiche

FIG 2.10

FIG 2.11

FIG 2.12

(14)

60

3 Elettroforesi delle proteine e immunofissazione

3.1

Immunofissazione proteine pz. P.L su siero, urine, plasma in date diverse

FIG 3.1 Immunofissazione su siero in data

05/04/2013. È presente una lieve banda

monoclonale a livello delle catene κ.

FIG 3.2 Immunofissazione su urine in data 05/04/2013. Assenza di componenti monoclonali

(15)

61

ELP G A M K L

FIG 3.3 Immunofissazione su siero in data 04/06/2013. Assenza di componenti monoclonali.

ELP G A M K L

FIG 3.4 Immunofissazione su plasma in data 04/06/2013. Presenza di una debole banda visibile tra le catene leggere di tipo K all’ altezza della banda del fibrinogeno. L’immonofissazione su plasma ci permette di osservare la banda di migrazione del Fg assente nel siero.

FIG 3.5 I dati densitometrici ricavati dalla corsa elettroforetica vengono convertiti in tracciato grafico (protidogramma). Si distingue l’albumina dalle globuline, a loro volta classificate in α1-globuline (α1-antitripsina, α1-GP acida), α2-globuline (α2-macroglobulina, aptoglobina), β1 e β2- globuline (transferrina, C3, β-lipoproteina, IgA), γ-globuline (Fg, IgG, IgM)

Fg

(16)

62

FIG 3.6 Immunofissazione su siero in data 26/06/2013. Assenza di banda monoclonale, si apprezza una marcato incremento delle proteine (distribuite in modo diffuso) in zona κ rispetto alle catene λ.

(17)

63

ELP G A M K L

FIG 3.8 Immunofissazione su siero in data 08/07/2013.Assenza di componenti monoclonali.

FIG 3.7 Immunofissazione su plasma in data 08/07/2013. L’ immunofissazione su plasma rivela la presenza di una debole banda visibile tra le catene leggere di tipo Kappa.

ELP G A M K L

(18)

64

3.2

Immunofissazione proteine dei campioni di controllo con TT allungato su siero e su plasma Pz n° 3

ELP G A M K ^L

FIG 3.9 Immunofissazione su siero del 3°

controllo TT 30.3 sec, corrispondente alla data 30/08/2013. Si nota CM IgGλ.

ELP G A M K ^L

FIG 3.10 Immunofissazione su plasma del 3°

controllo TT 30.3 sec, corrispondente alla data 30/08/2013. Si nota CM IgGλ.

(19)

65 Pz n°7

FIG 3.11 Immunofissazione su siero del 7°

controllo TT:17.1 sec, corrispondente alla data 30/08/2013. Si nota CM λ (mieloma micromolecolare).

ELP G A M K ^L

_{FIG 3.12}Immunofissazione su plasma del 7° controllo TT 17.1 sec, corrispondente alla data 30/08/2013. Si nota CM λ (mieloma micromolecolare).

(20)

66 Pz n°8

ELP G A M K ^L

FIG 3.13 Immunofissazione su siero del 8° controllo TT 17.9 sec, corrispondente alla data 30/08/2013. Si nota CM IgGλ.

ELP G A M K ^L

FIG 3.14 Immunofissazione su plasma del 8° controllo TT 17.9 sec,

corrispondente alla data 30/08/2013.

Si nota CM IgGλ.

(21)

67 Pz n°11

ELP G A M K ^L

FIG 3.15 Immunofissazione su siero del 11° controllo TT 16.6 sec,

Si nota CM IgGκ.

ELP G A M K ^L

FIG 3.16Immunofissazione su plasma del 11° controllo TT 16.6 sec,

Si nota CM IgGκ.

(22)

68

4 Dosaggio delle catene leggere libere

4.1

Dosaggio FLC pz PL

PLASMA SIERO DATA ESAME FLC κ mg/dl (vn

0,330-1,940)

FLC λ mg/dl (vn 0,571-2,630)

FLC κ/λ ratio (vn 0,26-1,65)

FLC κ

mg/dl (vn 0,330- 1,940)

FLC λ

mg/dl (vn 0,571- 2,630)

FLC κ/λ ratio (vn 0,26-1,65)

5/4 29,800 0,579 51,600

4/6 349,000 0,629 554,000

8/7 203,000 0,532 382,000 24,300 0,604 40,300

30/08 250,000 0,602 415,000 26,900 0,694 38,800

TAB 4A

P.L. presenta valori patologici di FLC con catene k francamente superiori alle catene λ. Il rapporto tra FLCk e FLCλ risulta alterato (indice di espansione monoclonale delle plasmacellule). I valori delle FLC su plasma aumentano dopo tp con corticosteroidi (dati del 5/4 preterapia vs dati del 4/6 dopo terapia). Il dosaggio su siero mostra valori di FLC più bassi rispetto a quelli ottenuti con dosaggio su plasma.

4.2

Dosaggio FLC controlli con MM

TAB 4B (i dosaggi sono stati eseguiti su plasma) CONTROLLI FLC κ mg/dl

(vn 0,330- 1,940)

FLC λ mg/dl (vn 0,571- 2,630)

FLC κ/λ ratio (vn 0,26-1,65)

1 O.M 316,000 2,630 120

2 F.P 1,360 0,559 2,43

3 C.C.J 0.927 61,00 0,015

4 P.I 0.177 0.567 0.312

5 B.A 6,02 0,20 30,1

6 L.R 31,300 0.832 37,62

7 D.S.A 0,0 710 Nd

8 G.A. 0,166 3,56 0,047

9 B.E 25,500 0.038 671,052

10 G.S 0,955 10,6 0,09

11 C.L. 55,6 0,013 4,19

12 D.R 2,01 0,615 2,01

13 B.R - - ND

14 B.P.G 1,48 421 0,004

15 M.A. 15,3 0,55 2,75

16 O.C 2,810 0,005 Nd

17 M.R 5,4 0,088 61,3

18 Z.I. 76,3 1,03 73,8

19 L.G. - - ND

20 B.A 2,19 4,59 0,477

(23)

69 FIG 4.1 E 4.2

0 50 100 150 200 250 300 350

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

FLC k (mg/dl)

Pa zi en ti

FLC k nel gruppo di controllo

0 100 200 300 400 500 600 700 800

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

FLC λ (mg/dl)

Pa zi en ti

FLC λ nel gruppo di controllo

(24)

70 FIG 4.3

0 100 200 300 400 500 600 700 800

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

1 Esami coagulativi

RISULTATI