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RIASSUNTO I
1. INTRODUZIONE 1
1.1. Funzioni del PDGF 1 1.2. Caratteristiche e sistema di segnalazione del PDGF-B 3
1.3. Ruolo del PDGF nello sviluppo embrionale 7 1.4. Ruolo del PDGF nello sviluppo del SNC 10 1.5. Ruolo del PDGF-B nei gliomi 12 1.6. La cresta neurale cranica e il ruolo del PDGF 18 1.7. Xenopus laevis come sistema modello 22
2. SCOPO DELLA TESI 23
3. MATERIALI E METODI 24
3.1. Clonaggio genico in vettori plasmidici 24
3.1.1. Amplificazione genica mediante
“Reverse transcriptase-polymerase chain reaction” (RT-PCR) 24 3.1.2. “Ligation” di DNA in vettori plasmidici 26 3.1.3. Trasformazione di cellule di E. coli 30 3.1.4. Inoculo ed estrazione di DNA plasmidico 31
3.2. Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione 31 3.3. Purificazione del DNA 32
3.3.1. Estrazione fenolica 32 3.3.2. Precipitazione alcolica 33
3.4. Elettroforesi su gel di agarosio 34 3.5. Embrioni di Xenopus laevis 35 3.6. Microiniezione 37
3.6.1. Microiniezione in embrioni di Xenopus laevis 37 3.6.2. Sintesi in vitro dei trascritti da microiniettare 38 3.6.3 Trascritti microiniettati 39
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3.7 Reazione cromogenica per la 4-galattosidasi 40 3.8. Trattamento farmacologico 41 3.9. Ibridazione in situ 423.9.1. Preparazione della sonda 42 3.9.2. Cloni usati per l’ibridazione in situ 43 3.9.3. Ibridazione in situ “whole mount” 44 3.9.4. Depigmentazione (“bleaching”) 47
4. RISULTATI 49
4.1. Clonaggio di XPDGF-B in pCS2+ 49 4.2. Clonaggio di hPDGF-B in pCS2+ 51 4.3. Analisi funzionale del gene PDGF-B 52
4.3.1. Analisi delle alterazioni a livello delle creste neurali craniche in
embrioni di Xenopus laevis microiniettati con il gene XPDGF-B 54 4.3.2. Analisi delle alterazioni a livello delle creste neurali craniche in
embrioni di Xenopus laevis microiniettati con il gene hPDGF-B 58 4.3.3. Trattamento farmacologico con hPDGF-B di embrioni
di Xenopus laevis 70
5. DISCUSSIONE 71
5.1. Premessa 71 5.2. Analisi funzionale del gene PDGF-B sullo sviluppo
delle cellule della cresta neurale 72 5.3. Analisi funzionale del gene PDGF-B su specifici geni
che regolano la segmentazione delle NCC 73 5.4. Confronto tra il fenotipo di embrioni micro iniettati
con il PDGF-B umano e di Xenopus 74
6. CONCLUSIONI 76
BIBLIOGRAFIA 77
