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Caratterizzazione Spettroscopica
47 Caratteristiche spettroscopiche del ligando irreversibile
fluorescente
Il composto 27 è stato caratterizzato anche per quanto riguarda le sue proprietà spettroscopiche. In particolare lo spettro di assorbimento ultravioletto e lo spettro di emissione sono stati misurati in modo da valutare l’influenza delle
proprietà chimico-fisiche dell’ambiente sulle proprietà
spettroscopiche del ligando. Una soluzione madre del prodotto 27 in dimetilsolfossido (DMSO) viene utilizzata per preparare diverse soluzioni saggio, variabili dall’acquoso (100% tampone fosfato PBS) al 60% v/v diossano-PBS, in modo che la concentrazione finale di 27 sia sempre 10 µM e che la percentuale di DMSO non ecceda l’1% del volume finale della soluzione.
La Figura 11 mostra lo spettro di assorbimento del composto 27. In soluzione acquosa, lo spettro è caratterizzato da due massimi di assorbimento a 331 nm e 482 nm, con coefficienti di estinzione molare rispettivamente di ε = 7963 M-1 cm-M-1e ε = 4078 M-M-1 cm-M-1. Sebbene la lunghezza d’onda di assorbimento massimo rimanga costante quando il composto 27 viene disciolto in una soluzione PBS contenente il 20% di diossano, lo spettro è caratterizzato da un incremento di entrambi i valori dei coefficienti di estinzione molare; questo effetto risulta ancora più evidente a lunghezze d’onda maggiori. Un incremento ulteriore di idrofobicità (40% PBS-60% diossano) causa un piccolo spostamento ipsocromico di entrambi i massimi di assorbimento che passano da valori di 331 nm e 482 nm in soluzione acquosa, a valori di 327 nm e 473 nm in presenza del 60% di diossano, rispettivamente. Questo shift ipsocromico è accompagnato da una diminuzione dei
Caratterizzazione Spettroscopica
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coefficienti di estinzione molare ad entrambi i massimi di assorbimento, anche se questi rimangono comunque più alti rispetto a quelli osservati in soluzione acquosa.
UV 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 300 350 400 450 500 550 600 nm A PBS PBS/Diossano=80/20 PBS/Diossano=60/40 PBS/Diossano=40/60
Figura 11: Spettro di assorbimento del composto 27 in concentrazione 10 µM in varie soluzioni contenenti 100% PBS fino ad un 60% di diossano-PBS (v/v).
La Figura 12 mostra lo spettro di emissione del composto 27. Come era atteso, la diminuzione della polarità del mezzo (da acquoso a 60% diossano in PBS) determina un aumento della resa quantica di fluorescenza di circa 30-volte.
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 500 550 600 650 700 750 nm R F U PBS/Diossano=40/60 PBS/Diossano=60/40 PBS/Diossano=80/20 solo PBS
Figura 12. L’influenza della polarità del mezzo sulla fluorescenza del composto 27 è stata studiata attraverso l’addizione di diossano (indicata come % v/v) in PBS misurata alla lunghezza d’onda di 470 nm.
