IV. Discussione
Gli esperimenti descritti in questa mia tesi sono la continuazione del lavoro svolto dal laboratorio durante questi anni sulla plasticità sinaptica in corteccia visiva e sui diversi meccanismi che la controllano e determinano.
È ormai un dato consolidato che l’esperienza visiva, durante il periodo critico, è in grado di indurre delle modificazioni a lungo termine nella struttura delle connessioni fra neuroni della corteccia visiva.
Numerosi studi, fra cui ricordiamo lo studio di Cancedda e collaboratori (Cancedda et al., 2003), individuano nella via di ERK la via di segnale attivata dall’esperienza visiva e nella trascrizione genica, mediata dall’attivazione del CREB, uno dei risultati dell’attivazione di tale via. Inoltre il blocco della chinasi ERK nella corteccia visiva durante il periodo critico inibisce i fenomeni di plasticità osservati sia in vivo che in fettina di corteccia (Di Cristo et al., 2001).
Il rapporto di causalità fra l’attivazione della via della MAP chinasi e la trascrizione genica è dimostrata da esperimenti in cui il blocco farmacologia dell’attività di ERK previene l’attivazione dell’espressione genica mediata dal fattore di trascrizione CREB (Cancedda et al., 2003).
Ulteriori studi dimostrano inoltre come la chinasi nucleare MSK, a valle nella via di ERK, possa rappresentare il collegamento molecolare fra la MAP chinasi e il CREB.
Infine appare avere una certa rilevanza, ai fini della trascrizione genica, la fosforilazione duratura degli istoni, in particolare dell’istone H3, in grado di alterare la struttura cromatinica e di favorire la trascrizione dei geni.
La base di partenza del mio lavoro è l’osservazione che individui adulti, ampiamente al di fuori del periodo critico e quindi meno plastici, presentano livelli di attivazione del CREB e dell’espressione di geni sotto il controllo del CREB indotti dall’esperienza visiva notevolmente inferiori rispetto a quanto riscontrato in individui che si trovino nel periodo critico, a fronte di una non diminuita attivazione delle chinasi della via di ERK (Cancedda et al., 2003). Gli stessi individui presentano anche una fosforilazione transiente e non più duratura dell’istone H3.
Per cercare di comprendere quali modificazioni occorrono nell’adulto, tali da giustificare una riduzione dell’attivazione di alcune molecole e, più in generale, una diminuzione della capacità degli individui di rispondere, con modificazioni a lungo termine, alla stimolazione visiva, il primo passo è stato verificare lo stato dell’acetilazione degli istoni nell’adulto e durante il periodo critico.
Numerosi studi infatti (Levenson and Sweatt, 2005; Crosio et al.,2003; Nowak and Corces, 2004;
Levenson et al., 2004a), hanno dimostrato la grande rilevanza delle modificazioni epigenetiche, e in
particolare dell’acetilazione degli istoni, nei fenomeni di plasticità in cui è necessaria la trascrizione genica.
Dai nostri studi risulta che, in seguito a stimolazione visiva, si verifica l’incremento dell’acetilazione dell’istone H3 nella corteccia visiva del piccolo ma non in quella dell’adulto; inoltre, l’aumento dell’acetilazione degli H3 si dimostra dipendente dalla via di ERK.
Ci siamo chiesti se la riduzione del livello di acetilazione degli istoni e il conseguente impacchettamento della cromatina in una struttura non permissiva della trascrizione genica, potesse essere l’elemento chiave nel determinare il contesto molecolare che rende le strutture corticali degli individui adulti poco sensibili alle variazioni degli stimoli ambientali e scarsamente modificabili dall’esperienza, in una parola, poco plastici.
Per cercare di dare risposta al nostro quesito abbiamo testato l’effetto della tricostatina A, inibitore dell’istone deacetilasi, sull’induzione dell’espressione genica esperienza-dipendente in corteccia visiva di topo adulto.
In primis, i nostri risultati certificano il potenziamento dell’acetilazione di H3 come effetto farmacologico della TSA; in secondo luogo, la tricostatina si dimostra sufficiente a ripristinare i livelli d’espressione genica CREB-dipendente, misurati attraverso l’utilizzo di topi transgenici CRE-LacZ adulti.
Nello specifico si dimostra che il trattamento differenziale delle cortecce di uno stesso animale (solo un emisfero viene iniettato con TSA) causa l’attivazione asimmetrica dell’espressione del gene reporter, che risulta essere maggiore nella corteccia trattata.
Questo dato è confermato anche dall’analisi dello stato dell’acetilazione di H3 in una regione corticale non visiva, non interessata dagli eventuali effetti dell’esperienza visiva sull’attivazione della trascrizione genica; anche in questo caso la corteccia ipsilaterale rispetto al sito di diffusione della TSA presenta una maggiore induzione del gene reporter rispetto alla controlaterale. Questi risultati indicano che la modulazione dei livelli di acetilazione degli istoni rappresenta un punto di regolazione negativa della trascrizione genica mediata dal CREB nella corteccia cerebrale adulta.
Lo studio dei fenomeni di plasticità in corteccia visiva è innanzitutto lo studio dello sviluppo dell’animale durante il periodo critico. La completa maturazione degli elementi costitutivi le vie visive e il pieno raggiungimento delle facoltà visive viene infatti raggiunto attraverso un percorso di crescita che si snoda essenzialmente all’interno di quella particolarissima finestra temporale che chiamiamo, appunto, periodo critico.
Al di fuori di questa tappa fondamentale dello sviluppo, l’individuo, o meglio le strutture che lo compongono, appare decisamente meno plastico ovvero meno capace di modificarsi al variare delle condizioni dell’ambiente.
Nel nostro particolare caso, risulta compromessa la capacità di tradurre in modificazioni a lungo termine
le variazioni indotte dall’esperienza sull’attività delle vie visive stesse; perché tali modificazioni abbiano luogo, nell’individuo in sviluppo, è necessaria l’attivazione di vie di segnale che portino all’induzione dell’espressione genica.
Come i nostri studi dimostrano, è esattamente il passaggio finale, ovvero l’attivazione della trascrizione genica, che appare venire meno nell’adulto; la via di ERK viene infatti attivata dall’esperienza visiva in maniera non dissimile da quanto accada negli individui in periodo critico (Cancedda et al., 2003), così come la chinasi MSK, responsabile della fosforilazione del CREB; quest’ultimo non viene però attivato in eguale misura nell’adulto e durante il periodo critico, e questo potrebbe di per sé giustificare la bassa espressione dei geni sotto il controllo di questo specifico fattore di trascrizione.
Tuttavia, abbiamo deciso di concentrare la nostra attenzione sull’analisi di un altro elemento in grado di determinare la promozione o l’inibizione della trascrizione genica, l’acetilazione degli istoni.
Numerosi studi individuano nel reclutamento del coattivatore CBP da parte del CREB fosforilato uno dei passaggi più importanti per l’induzione dell’espressione genica nei fenomeni di plasticità (Alarcon et al., 2004; Korzus et al., 2004).
Il CBP ricopre un duplice ruolo, recluta elementi del macchinario per la trascrizione e, quel che più conta per i nostri studi, possiede un’attività HAT intrinseca; nello specifico, l’acetilazione degli istoni mediata dal CBP è fondamentale perché vi sia trascrizione genica e abbiano luogo le modificazioni a lungo termine proprie dei fenomeni di plasticità (Alarcon et al., 2004; Korzus et al., 2004).
L’effetto, con maggiori conseguenze sull’espressione genica, della ridotta fosforilazione del CREB potrebbe dunque essere la mancata acetilazione degli istoni mediata dal CBP e, di conseguenza, il mantenimento della struttura non permissiva della cromatina.
Le modificazioni epigenetiche del DNA e delle proteine istoniche vengono ormai considerate uno dei meccanismi più importanti nei processi di modulazione degli effetti dell’esperienza sul fenotipo nei fenomeni di plasticità del sistema nervoso (Colvis et al., 2005; Hsieh and Gage, 2005).
Considerate nel loro insieme, tali modificazioni assumono una grande rilevanza soprattutto in quei contesti in cui la trascrizioni di nuovi geni risulta essere l’elemento che determina e costituisce l’evento plastico. Si può affermare infatti che il controllo dell’espressione genica sia la funzione ultima delle modificazioni epigenetiche e l’elemento che le distingue e caratterizza.
Perché una molecola di DNA possa essere raggiunta dai diversi componenti della macchina della trascrizione e possa dare luogo all’espressione degli elementi da cui è costituita, i geni, è necessario che la sua struttura si trovi in uno stato aperto o, per così dire, permissivo.
Gli eventi molecolari modulabili con più facilità che sono stati identificati come responsabili di questo stato permissivo sono, in prima analisi, l’acetilazione e la fosforilazione degli istoni.
Gli istoni, ricordiamo, contribuiscono alla formazione di una particolare organizzazione della molecola di
DNA che prende il nome di cromatina. Quando i geni sono avvolti intorno al nucleosoma e impacchettati nella cromatina risultano essere pressoché irraggiungibili dalle molecole attivatrici della trascrizione genica e, di conseguenza, inespressi.
L’acetilazione degli istoni, ad opera degli enzimi HAT, provoca delle variazioni nel legame fra istoni e DNA e permette il rimodellamento della cromatina nella sua forma permissiva. La deacetilazione degli istoni produce gli effetti contrari. Va anche ricordato che l’acetilazione degli istoni, oltre ad una azione di tipo strutturale sul DNA, potrebbe anche agire da sito di attacco per cofattori della trascrizione genica (Peterson and Laniel 2004).
La trascrizione genica in numerosi fenomeni di plasticità è correlata ad un alto livello di acetilazione degli istoni, ottenuto mediante l’attivazione degli enzimi HAT o il reclutamento del CBP (Levenson et al., 2004a; Kumar et al., 2005; Levine et al., 2005).
La fosforilazione degli istoni, come dimostrano gli studi sulla serina 10 dell’istone H3 (Crosio et al., 2003), è spesso implicata negli stessi fenomeni di plasticità in cui è richiesta l’acetilazione degli istoni e risulta dunque essere ugualmente determinate per l’induzione della trascrizione genica.
Stando ai nostri studi dunque, l’inibizione dell’istone deacetilasi operata dalla tricostatina A, promuove, nell’adulto, l’acetilazione degli istoni e, come conseguenza più evidente, la trascrizioni di geni sotto il controllo esclusivo della sequenza CRE.
A quanto pare la modificazione della struttura della cromatina, promossa dalla TSA, è sufficiente ad indurre, nell’adulto, livelli d’espressione genica paragonabili a quelli presenti durante il periodo critico, stante la ridotta attivazione del fattore di trascrizione responsabile dell’espressione dei geni considerati.
Un’ipotesi potrebbe dunque essere che i bassi livelli di fosforilazione del CREB nell’adulto comportino un reclutamento insufficiente di coattivatore CBP presso i promotori dei geni da trascrivere e, di conseguenza, una ridotta attività acetiltransferasica sugli istoni; in quest’ottica il vero limite nell’espressione dei geni mediata dal CREB nell’adulto sarebbe proprio la mancata acetilazione degli istoni. L’ipotesi è sostenuta dal fatto che la tricostatina A attiva la trascrizione del gene LacZ e quindi la riattivazione dell’acetilazione si dimostrerebbe dunque sufficiente a garantire l’espressione genica.
Tuttavia studi futuri dovranno indagare il livello d’attivazione di CREB in seguito a trattamento con TSA per verificare se questo trattamento riesce ad attivare la trascrizione dei geni controllati da CREB indipendentemente da possibili modificazioni dello stato di fosforilazione del CREB..
Alla ridotta attivazione della trascrizione genica mediata dal CREB in risposta alla stimolazione visiva osservata nella corteccia visiva dell’adulto potrebbero concorrere anche altri meccanismi, ad esempio è possibile che fattori che inibiscono la trascrizione mediata dal CREB, come ad esempio ATF-4 possano avere un’azione aumentata nella corteccia adulta. ATF-4 è l’omologo murino di CREB2 un fattore scoperto nell’Aplysia è noto per la sua azione inibitoria sul CREB (Costa-Mattioli et al., 2005).
Ritengo tuttavia che lo sviluppo di maggior interesse del mio lavoro di tesi è la possibilità di indagare se la tricostatina, o altre sostanze capaci di favorire l’acetilazione degli istoni, possano essere capaci non solo di ripristinare i livelli di attivazione del CREB indotta dalla visione tipici dell’animale giovane, ma anche di avere un azione facilitatoria sulla plasticità corticale dell’adulto permettendole di ritornare ai livelli del periodo critico.
