Università di Pisa.
Dipartimento di Biologia.
Laurea magistrale in biologia applicata alla biomedicina.
Studi sugli effetti degli estratti di Azadirachta indica sul
modello murino della malaria.
Relatore interno: Aldo Paolicchi
Relatori esterni: Fabrizio Bruscchi
Annette Habluetzel
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Indice
Riassunto. ... 1
1. Introduzione ... 4
1.1 Generalità sulla malaria. ... 4
1.2 Ciclo vitale del parassita. ... 5
1.3 Caratteristiche cliniche, patogenesi e diagnosi della malaria. ... 8
1.4 Trattamenti di casi della malaria. ... 11
1.5 Chemioprofilassi della malaria nelle zone endemiche. ... 12
1.6 Controllo del vettore. ... 12
1.7 Sviluppo di nuovi farmaci per il controllo della malaria. ... 16
1.8 Contributo delle piante medicinali nel controllo della malaria. ... 16
1.9 Nota sull'Azadirachta indica. ... 17
1.10 Uso tradizionale per il controllo della malaria. ... 18
2. Scopo della tesi. ... 21
3. Materiali e metodi ... 23
3.1 Racolta del materiale della pianta Azadirachta indica ... 23
3.2 Preparazione degli estratti ... 23
3.3 Composizione chimica degli estratti. ... 25
3.4 Frazioni del frutto acerbo (verde). ... 26
3.5 Frazioni del frutto maturo (giallo). ... 27
3.6 Procedura di solubilizzazione. ... 28
3.7 Ceppo parassita e mantenimento del ciclo. ... 29
3.8 Animali ... 30
3.9 Four days suppression test ... 31
3.10 Dosaggio della pro-MMP-9 ... 32
ii
3.12 Analisi statistica. ... 32
4. Risultati. ... 34
4.1. Confronto nell'andamento della parassitemia in topi C57BL6 e BALB/c. ... 34
4.2. Risultati 4 days suppression test. ... 35
4.3. Dosaggio della pro-metalloproteasi 9. ... 36
4.4. Dosaggio del fattore di necrosi tumorale alfa ... 37
5. Discussione. ... 38
6. Conclusione. ... 40
Riassunto
La malaria chiamata anche paludismo, è una malattia parassitaria ancora oggi causa di alta mortalità infantile soprattutto nei paesi Africani. La malaria viene trasmessa dalla puntura da zanzara femmina del genere Anopheles. I parassiti protozoi appartengono al Genere Plasmodium, Phylum Apicomplexa. Tra le varie specie di Plasmodium, quattro colpiscono l’uomo e sono Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae. Di queste, la specie con maggiore patogenicità è P. falciparum che causa il più alto tasso di mortalità tra i soggetti infettati. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità è necessaria un uso combinato di strumenti (zanzariere impregnate con insetticida, limitazione del numero di vettori, utilizzo di antimalarici appropriati) per arrivare a controllare la malaria. L'uso diffuso di farmaci basati su artemisinina e derivati (artemisin combination therapy) in combinazione con la primachina dovrebbe ridurre la trasmissione della malaria nelle aree endemiche. In oltre, questa strategia è indicata per contrastare lo sviluppo di resistenza ai farmaci nelle zone endemiche. Lo scopo della mia tesi è stato quello di testare l'efficacia di estratti dei frutti di neem (Azadirachta indica, Meliaceae) nell’inibire la riproduzione del parassita nella sua fase eritrocitaria utilizzando il modello della malaria murina Plasmodium berghei / topo. L'infuso delle foglie veniva usato già dagli antichi (tradizionalmente in India) per curare la febbre malarica. È noto che il frutto maturo rispetto al frutto non maturo contiene un' alta concentrazione di
Azadirachtina A, un composto limonoide che in precedenti studi è risultata capace di
interferire con diversi stadi di Plasmodium . Inoltre s'intendeva studiare le eventuali modificazioni indotte dai vari trattamenti sui livelli plasmatici di metalloproteasi di matrice, per studiare l'effetto sui processi infiammatori da parte di questi diversi estratti. Come esperimento preliminare, è stato confrontato l’andamento della parassitemia durante le prime tre settimane di infezione tra due ceppi di topi, BALB/c e C57BL6 infettati sperimentalmente con un milione di globuli rossi infetti con P. berghei (ceppo Anka) per
via intraperitoneale, con l’obiettivo di verificare possibili differenze di suscettibilità riferibili a fattori genetici. Inoltre sui due gruppi di animali infetti è stato valutato anche lo sviluppo di anemia determinando i valori di ematocrito. Di seguito è stato condotto un Peter's 4 days test per valutare l'attività “curativa” degli estratti. Sono stati infettati 8 gruppi di 7 topi (4 gruppi di ciascun ceppo) e trattati oralmente per 4 giorni nei seguenti modi: i) artesunato come farmaco antimalarico di riferimento alla concentrazione di 10 mg/kg topo sciolto in acqua distillata contenente 5% DMSO, 5% TWEEN 80; ii) controllo solvente (acqua distillata contenente DMSO al 10% e TWEEN 80 al 5%); iii) estratto di frutti di A.
indica maturi a un dosaggio di 150 mg/kg sciolti in acqua distillata contenente 5% DMSO,
TWEEN 80 5%; e iv) estratto di frutti di A. indica verdi 150 mg/kg sciolti in acqua distillata contenente 10% DMSO, 5% TWEEN 80.
I risultati ottenuti preliminarmente hanno mostrato che i topi BALB/c mostrano un andamento della parassitemia sostanzialmente simile a quello dei topi C57BL6, con un 50% di globuli rossi infetti tra il giorno 9 e 14 . Per quanto riguarda gli analisi preliminare dello sperimento di trattamento si evince che l'artesunato somministrato a 10 mg/kg per 4 giorni come atteso ha ridotto la parassitemia del circa 50% confrontato con il gruppo controllo solvente, cioè del 45% nel ceppo C57BL6 e 60% nel ceppo BALB/c. La parassitemia media nel gruppo di controllo solvente ammontava a circa 6% e 7% nei topi BALB/c e C57BL6 rispettivamente. Nei gruppi trattati con gli estratti di frutti di neem gialli (maturi) o verdi (non maturi) la parassitemia nei topi BALB/c era molto simile ai controlli, mentre nei topi C57BL6 era del 5%, cioè leggermente più bassa a confronto con i controlli. Un analisi statistica permetterà di verificare se le differenze dei valori di parassitemia osservate nei topi C57BL6 fra trattamenti e controllo fossero significative. Inoltre gli estratti del frutto verde mostravano effetti tossici (arricciamento del pelo, riduzione dell'attività motoria) in particolare nei topi BALB/c. Sul plasma prelevato dagli
animali dei diversi gruppi sperimentali sono in corso gli studi sulla valutazione della metalloproteasi-9, mediante tecnica ELISA.
1.Introduzione
1.1. Generalità sulla malaria
La malaria chiamata anche paludismo è una malattia parassitaria causata da un parassita del genere Plasmodium che si trasmette con la puntura di alcune specie di zanzare
Anopheles. Tra le varie specie di Plasmodium quattro sono le più diffuse e sono Plasmodium falciparum, Plasmodium ovale, Plasmodium vivax e Plasmodium malariae.
La più pericolosa è P. falciparum con il più alto tasso di mortalità tra i soggetti infesttati. Recentemente è stato identificata una quinta specie di Plasmodium che causa la malaria negli esseri umani, il Plasmodium knowlesi il quale abitualmente infetta le scimmie nel Sud Est dell'Asia. (1)
Al livello mondiale secondo l'OMS si stima che 3.3 miliardi di persone sono a rischio di essere infettati con la malaria e di sviluppare la malattia e 1,2 milliardi sono in alto rischio di contrarre l'infezione. Secondo le ultime stime 198 milioni di casi di malaria si sono verificati al livello globale nel 2013 (intervallo di incertezza 124-283 milioni) e la malattia ha causato 584000 casi fatali (range di incertezza 367000-755000). (2a) Negli anni 1990 si stimava che la malaria causasse tra 700.000 e 2.7 milioni di morti (2). Si stima che il numero di casi della malaria sia salito da 226 milioni nel 2000 a 244 milioni nel 2005, tuttavia nel 2012 si è ridotto a 207 milioni. Il numero di morti dovuto alla malaria è diminuito da 881.000 nel 2000 a 627.000 nel 2012 (OMS). La maggior parte delle vittime sono bambini di meno di 5 anni e donne in gravidanza che sono particolarmente vulnerabili in quanto la placenta facilita l'accumulo dei parassiti. Ottantasei per cento pari a 212 (152-287) milioni di casi si sono verificati in Africa. L'ottanta per cento dei casi in 13 paesi Africani la metà dei quali si è osservata in Nigeria, Repubblica democratica del Congo, Etiopia, Repubblica unita della Tanzania e il Kenya. Tra i casi fuori dall'Africa, l'ottanta
per cento dei casi si sono verificati in India, Sudan, Myanmar, Bangladesh, Indonesia, Papua nuova Guinea e Pakistan. ( OMS 2008 )
Distribuzione geografica
1.2. Ciclo vitale del parassita
Il vettore del parassita è la zanzara femmina del genere Anopheles. Le giovani zanzare ingeriscono il parassita per la prima volta quando prendono un pasto di sangue (necessario per la produzione delle uova) da un essere umano infettato. Una volta ingeriti, i gametociti del Plasmodium si differenziano in gameti maschi e femmine che s'uniscono per dar luogo allo zigote mobile chiamato ookinete il quale invade la parete dello stomaco della zanzara per diventare un oocisti sferica il cui nucleo andrà a dividersi numerose volte per dar luogo alla fine agli sporozoiti. La durata di questa maturazione è strettamente correllata con la temperatura esterna. Per esempio per il P. falciparum: non c'è maturazione al di sotto dei 18°C ed al di sopra dei 35°C. Quando si rompe l'oocisti essa rilascia gli sporozoiti che migrano nel corpo della zanzara fino alle ghiandole salivari, da cui possono durante un
Lo sporozoita inoculato all'uomo durante il pasto di sangue da una zanzara femmina del genere Anopheles infetta, circola rapidamente ( meno di una mezz'ora ) nel sangue fino al fegato nel quale è sequestrato in gran parte grazie alle proteine di adesione con cui il parassita aderisce alla superficie dell'epatocita ed inizia il processo di internalizzazione nella cellula stessa. Questa fase dura dai 7-15 giorni per P. falciparum, dai 15 giorni ai 9 mesi per P. vivax, dai 15 giorni ai 10 mesi per il P. ovale e circa 3 settimane per P.
malariae. Questo periodo serve al parassita per proseguire il suo ciclo. Gli sporozoiti che
non raggiungono il fegato verranno eliminati dai fagociti. Una volta nell'epatocita, lo sporozoita si trasforma in trofozoita che dopo due settimane darà luogo ad uno schizonte che contiene migliaia di merozoiti, in seguito alla divisione asessuata schizogonica. È questa la fase epatica o pre-eritrocitaria del ciclo.Tuttavia alcuni merozoiti di P. ovale oppure P. vivax possono rimanere nel fegato per periodi molto lunghi anche anni, dopodiché il parassita può entrare nuovamente in circolo. Nel caso di P. malariae questi merozoiti possono rimanere silenti anche per tutta la vita dell'ospite. Questa fase del parassita è chiamata <<fase dormiente>> o ipnozoita (il Plasmodium non si replica ma dorme, dal greco antico hypnos dio del sonno).
Durante la fase erotrocitaria, i merozoiti aderiscono ai globuli rossi quindi li invadono e si sviluppano in trofozoiti che poi maturano a schizonti in cui avviene la riproduzione schizogonica che porta alla produzione dei merozoiti.
Ad un certo punto, lo schizonte non potendo più contenere i merozoiti che possono arrivare fino a 32, va incontro a rottura provocando la lisi del globulo rosso. Queste rotture improvise e sincrone sono all'origine della comparsa della febbre perché con la lisi dell'emazia si libera emozoina, il prodotto di catabolismo del gruppo eme dell'emoglobina che entrando in circolo andrà a stimolare le cellule macrofagiche del sistema reticolo-endoteliale, che produrranno prostaglandine che agiranno sui centri termoregolatori dell'ipotalamo. Il tempo che intercorre tra l'ingresso di un parassita nel globulo rosso e la
rottura di quest'ultimo è assai costante ed è nell'uomo di 48 ore per il P. vivax, P.
falciparum, P. ovale e di 72 ore per P. malariae. Per P. knowlesi, l'ultimo ad essere
scoperto, la fase eritrocitaria dura 24 ore.
La distruzione dei globuli rossi è uno dei fattori che causano anemia che può diventare anche grave con valori di emoglobina < ai 5g/dL.
La rottura degli schinzonti maturi termina con il primo ciclo schizogonico eritrocitario rilasciando nel sangue residui del metabolismo del plasmodium (pigmenti e residui dei globuli rossi), una nuova generazione di plasmodium i merozoiti << eritrocitari >> sono capaci di rinfettare altri globuli rossi. Alcune forme parassitarie si differenziano nel torrente circolatorio e prendono la
strada dello stadio sessuato (gametociti).I parassiti in questa fase non possono sopravvivere nell'essere umano, rimangono vivi per circa tre settimane dopodiché si ritrovano più perchè possono continuare il loro ciclo solo nella zanzara femmina del genere
Anopheles. I gametociti maschio (microgametocita) e femmina (macrogametocita),
vengono ingeriti dalla zanzara femmina durante il pasto di sangue infettando l'insetto e quindi completando il ciclo.
Ciclo vitale del Plasmodium spp.
CDC di atlanta (Centers for Disease Control and Prevention).
1.3. Caratteristiche cliniche, patogenesi e diagnosi della malaria
Nelle zone tropicali la malaria è una causa di febbre molto comune.
La malattia si manifesta con sintomi non specifici come malessere, mal di testa, fatica, dolori addominali e dolori ai muscoli seguiti da febbre. Nausea, vomito, ipotensione ortostatica sono spesso comuni. (5). Le infezioni progressive che portano al pericolo di vita dovuto al P. falciparum presentano sintomi come: anemia grave, acidosi, disturbi respiratori, shock, coagulopatia intravascolare disseminata, insufficienza renale, edema polmonare e patologia cerebrale seguito da convulsioni e coma. A differenza dei bambini Africani, l'insufficienza d'organo è una caratteristica della malaria in adulti Asiatici e Sud-Americani.(6) . Il tasso di mortalità dei bambini Africani è dovuto alla malaria cerebrale e molto meno all'anemia causato dal P. falciparum.(7) . Il parossismo della febbre del
bambino è legato alla rottura dei globuli rossi , il rilascio dei merozoiti e la produzione dei parassiti nel circolo sanguigno. Questi sintomi sono mediati da elevati livelli di citochine, come prova, è stato dimostrato che gli anticorpi anti- TNF riducono la febbre malarica. (8)
La malaria grave è causata principalmente dal P. falciparum si presume che si sviluppa come il risultato di una combinazione di fattori specifici del parassita il quale include l'adesione e il sequestro dei globuli rossi che ostruiscono i vasi sanguigni cerebrali insieme alla risposta immunitaria dell'ospite. (9)
Una diagnosi precoce ed esatta della malaria è cruciale per una buona presa in carico e una sorveglianza efficace per la malattia. L'OMS raccomanda di diagnosticare la malattia senza ritardo usando un microscopio ottico oppure un test diagnostico rapido in tutti i pazienti in cui si sospetta la malaria prima di somministrare i farmaci per il trattamento. I test diagnostici permettono di distinguere soggetti con la febbre causata dalla malaria da quelli la cui febbre è di altra natura e contribuiscono a limitare la comparsa o la propagazione della resistenza ai farmaci.
I metodi convenzionali per la diagnosi di laboratorio della malaria sono costituiti dallo striscio di sangue sottile e dalla goccia spessa mediante le quali è possibile rispettivamente effettuare una diagnosi di specie e valutare la parassitemia.
L'osservazione al microscopio ottico dello striscio sottile permette d' identificare i differenti parassiti all'origine della malaria (P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae), i diversi stadi del parassita principalmente i gametociti e la valutazione della parassitemia, espressa come % di emazie parassitate, un parametro utile per seguire a una risposta del trattamento. L'esame microscopico ottico è un metodo di referenza usato fino ad oggi per la diagnosi della malaria. (OMS 2013).
Ci sono numerosi test rapidi per la diagnosi diretta della malaria, che si basano sulla ricerca mediante metodo immunocromatografico di antigeni circolanti del Plasmodium. (10)
I test diagnostici rapidi (TDR) sono di esecuzione ed interpretazione relativamente facili, forniscono rapidamente risultati, necessitano di una formazione limitata e permettono di diagnosticare la malaria al livello comunitario.
I TDR permettono di rilevare antigeni specifici (proteine) prodotti dal Plasmodium presente nel sangue del paziente infetto. Alcuni TDR rilevano infezioni monospecifiche (sia P. falciparum, sia P. vivax), alcuni rilevano infezioni miste (P. falciparum, P. vivax, P.
ovale, P. malariae), mentre alcuni rilevano infezioni dovuti a P. falciparum e altri non
infezioni da P. falciparum oppure specie specifiche. Il sangue di solito viene prelevato dal polpastrello ed i risultati sono disponibili tra quindici e trenta minuti. Esistono più di un centinaio di TDR sul mercato e il principio d'uso è simile (11) includono la storia del paziente e l'esame fisico principalmente la presenza della febbre poi l'uso del microscopio ottico per esaminare lo striscio di sangue (presenza oppure no dei parassiti del Plasmodium nei globuli rossi). Test di amplificazione di acidi nucleici limitato per la ricerca nei laboratori che non vengono usati come test diagnosti di routine per la malaria. Ci sono un numero di test rapidi per la diagnosi della malaria distribuiti nei paesi endemici per la malaria. (12)
La diagnosi della malaria basata sulla tecnica della PCR viene usata soppratutto nei laboratori di ricerca. Questa metodica è nettamente più sensibile del microscopio ottico e del TDR nell'identificazione d'infezioni submicroscopiche specialmente con specie meno diffuse (P. malariae, P. ovale, P. knowlesi), rileva inoltre infezioni miste e infine infezioni a bassa parassitemia. (OMS, 2012). Una revisione sistematica di 42 articoli in cui sono stati impiegati metodi diagnostici ha paragonato la prevalenza di P. falciparum ottenuta con l'esame microscopico e con la PCR. La prevalenza di infezione ottenuta con l'esame
microscopico era circa a metà (50,8%) di quella evidenziata dalla PCR mentre la rilevazione dei gametociti era gravemente sottostimata. (13)
1.4. Trattamenti di casi della malaria.
La diagnosi precoce e il trattamento di casi acuti della malaria sono l'approcio primario per ridurre la morbidità e la mortalità. (OMS 2011). Il trattamento dei casi acuti della malaria riduce la morbidità e la mortalità, riduce anche la trasmissione e previene l'insorgenza e la diffusione della farmaco-resistenza antimalarica. (14)
L'OMS raccomanda interventi per la gestione della malaria basati sulla gravità della malattia e la specie del parassita.
La malaria grave è causata dal P. falciparum. Il trattamento antimalarico dato sia per via parenterale oppure rettale durante la malaria grave include alcaloidi (chinino e chinidina) e derivati di artemisinina (artesunato, artemeter e artemotil). Una revisione sistematica di otto lavori ha fatto dei studi comparativi sulla somministrazione parenterale dell'artesunato e del chinino nella malaria grave e ha concluso che l'artesunato riduce la mortalità e mostra un'efficacia superiore rispetto al trattamento parenterale del chinino per la malaria grave sia negli adulti che nei bambini in differenti regioni del mondo. (15) Gomes e i suoi colleghi hanno dimostrato che singoli dosi di artesunato per via rettale come pre-trattamento, riduce il rischio di morte oppure l'invalidità permanente. (16)
La clorochina è il primo farmaco usato per il trattamento della malaria causato da P.
vivax, P. ovale e P. malariae ( OMS 2010 ). La resistenza alla clorochina è stato
identificata nel P. vivax e vari paesi hanno riportato il fallimento del trattamento con la clorochina. (17) A causa degli ipnozoiti, le infezioni da P. vivax e P. ovale richiedono la primachina per la cura radicale (18)
La co-infezione con specie multiple di parassita è un fenomeno comune in soggetti residenti in zone endemiche. (19) Come terapia per il trattamento malarico farmaci usati in
combinazione con artemisinina e derivati sono efficaci contro il Plasmodium, (20) si può sciegliere trattamenti basati sulla combinazione dei farmaci antimalarici per la gestione di co-infezioni. Se la co-infezione è con P. vivax oppure P. ovale, il trattamento radicale con la primachina è richiesta. (OMS 2010).
1.5. Chemioprofilassi della malaria nelle zone endemiche
La malaria causa la malattia in individui che vivono nelle zone endemiche. La strategia di dare farmaci antimalarici a intervalli regolari (profilassi oppure trattamenti intermittenti) è stata presa in considerazione per i bambini in età pre-scolastica. La profilassi ed i trattamenti intermittenti con farmaci antimalarici riducono la malaria clinicamente manifesta e l'anemia grave in bambini in età pre-scolastica. (21) La chemioprofilassi è efficace per la prevenzione dei casi fatali e la morbidità causati dalla malaria ma, è difficile sostenerla per periodi protratti e sarà facilitata dallo sviluppo e la diffusione di farmaci per ceppi resistenti se applicato a una intera comunutà. (22)
1.6. Controllo del vettore
Il controllo del vettore è una componente essenziale d'intervento teso a ridurre la trasmissione della malaria. Gli sforzi del Programma di Eradicazione della Malaria (1955-1969) hanno significativamente ridotto il carico della malaria, particolarmente in Asia, America Latina, e Africa del Sud. (OMS 2006). Il programma di eradicazione era basato sulla polverizzazione d'insetticidi con effetti permanenti all'interno delle abitazioni ed è stato approvato dall'OMS nella conferenza di Kampala del 1950. Nonostante la sua diffusione iniziale, i brillanti risultati ottenuti non potevano essere sostenuti nel tempo e l'uso diminuiva più o meno a causa in parte della mancanza d'impegno del governo e in parte dell'aumento dei timori degli effetti nocivi dell'insetticida sull'ambiente e sulla salute umana. (23)
Era un modo efficace per ridurre rapidamente la trasmissione della malaria. Per ottenere un risultato efficace, bisognava spruzzare almeno 80% del prodotto nelle abitazioni. L'insetticida più usato era il DDT ( Dicloro difenil tricloroetano ) che ha avuto successo in tante regioni e con questa tecnica è stato possibile eradicare completamente la malaria in alcuni paesi. Purtroppo l'uso del prodotto si è rivelato tossico e fu classificato dall'OMS come un inquinante organico persistente. Per sostituire il DDT che si è rivelato tossico, altri metodi per eradicare il vettore erano costituiti da:
• asciugare pozze d'acqua stagnanti dove la zanzara femmina poteva deporre le uova
• usare predatori di Anopheles ad esempio il pipistrello (24) • utilizzo delle zanzariere impregnate nelle abitazioni.
• L'applicazione sul corpo dei prodotti repellenti contro le punture da zanzare femmine è una misura preventiva personale. Angelo celli, alla fine del dicianovesimo secolo, dimostrò che la gente poteva proteggersi dalla malaria con il 96% di efficacia usando questa tecnica nelle loro case contro le zanzare. (25) Da allora la malaria è stata controllata in tanti paesi usando questa pratica. L'applicazione sulla pelle dei repellenti contro le zanzare potrebbe aiutare a ridurre il pesante fardello connesso all'insorgenza di malattia dovuta a questi ultimi. (26) La protezione dalla puntura della zanzara può raggiungere con i repellenti fino a 6-8 ore. Citronella (con il 5% di vaniglia), Citriodiol (Paramentano-diolo) e DEET (di-etil 3 metilbenzammide). (27) Gli effetti collaterali di questi agenti sono blandi e si limitano alle dermatiti ed alle allergie. (28) L'uso dei repellenti contro le zanzare durante il pomeriggio migliorava l'efficacia delle zanzariere trattate con insetticida a lunga durata nella prevenzione della malaria. Uno studio doppio cieco placebo randomizzato controllato da studi clinici nei Boliviani dell'Amazona hanno mostrato l'efficacia della combinazione di piante aventi effetti repellenti con
deltametrina impregnata nelle zanzariere. L'effetto era la riduzione di episodi di P.
vivax e di febbre. (29) Allo stesso modo, Deressa e colleghi (2014) in Etiopia
confermava l'ulteriore vantaggio dell'uso d'insetticida repellenti nel miglioramento della capacità protettiva delle zanzariere trattate con insetticidi di lunga durata contro il P. falciparum in un gruppo randomizzato di studi. (30) La protezione raccomandata dall'OMS per le persone a rischio per la malaria grave è l'uso di zanzariere impregnate con piretroidi, di bassa tossicità per i mammiferi e molto attivi per le zanzare.
I piretroidi sono gli anologhi sintetici delle piretrine. Agiscono sul sistema nervoso gangliare pochi minuti dopo l'applicazione l'insetto è paralizzato. Sono meno fotolabili delle piretrine e molto più persistenti nell'ambiente. Fanno parte dei piretroidi di prima generazione una serie di esteri ottenuti dall'acido crisantemico e da diversi alcooli superiori. I più importanti sono Alletrina (sintetizzata nel 1949 da Milton S. Schechter), Bioalletrina (sintetizzata nel1967 Lhoste) si ottengono con l'introduzione nell'acido crisantemico di un gruppo allilico al posto del gruppo butenilico, ecc...
Il primo piretroide di sintesi, il fenvalerate, fu immesso nel mercato nel 1978 e oggi la classe consta di 42 principi attivi. I progressi in ambito di manipulazione delle formule di struttura, hanno riguardato la modificazione della catena laterale dell'acido crisantemico, l'aggiunta di alogeni (Br Cl) nella struttura molecolare e la sostituzione, nella parte alcoolica, dell'anello furilico con un secondo anello benzenico (permetrina, 1973 Elliot). Si è dato così origine ai piretroidi di seconda generazione, che hanno come capostipite la permetrina. Differisce dai composti della prima generazione per il fatto che nella struttura acida è stata introdotta una funzione di-cloro-vinilica, e il gruppo alcoolico (benzilfulirico) è diventato 3-fenossi-benzil-alcool. La permetrina è molto più efficace, ma soprattutto molto più stabile alla luce e all'ossigeno, rispetto ai piretroidi di prima generazione.
La terza generazione comprende i ciano derivati-della Permetrina: Cipermetrina, Deltametrina, Fenvalerato. Questi piretroidi sono molto più attivi e stabili delle due categorie precedenti. La stabilità e la permanenza di questi piretroidi è dovuta alla presenza, nella parte acida, del gruppo diclorovinilico. I cianoderivati, in condizioni standard sono da 2 a 7 volte più potenti rispetto alla Bioresmetrina sulla mosca domestica e sugli insetti striscianti. La tossicità può essere aumentata nelle composizioni Piperonyl-Butoxide che protege i piretroidi da degradazione enzimatica, allungandone la durata nell'ambiente, ed aiutando la penetrazione del piretroide all'interno del corpo degli artropodi. Questa sostanza a sua volta è considerata dannosa per gli ambienti e gli organismi acquatici. Poiché gli insetticidi organofosforici inibiscono l'attività delle esterasi plasmatiche, la simultanea esposizione a questi agenti può rendere la tossicità da piretrine o piretroidi più probabile o più grave.(31)
L'Istituto Superiore di Sanità consiglia l'impiego di piretroidi e piretrine nel trattamento della vegetazione arbustiva, dove nelle città si annida buona parte della biodiversità residua. Lo scherma generale in caso di emergenza prevede almeno tre giorni consecutivi di trattamenti spaziali mattutini dell'area circonscritta, mentre solo i primi due giorni si effettuerà anche un secondo trattamento serale al tramonto. Ulteriori cicli di trattamenti possono essere effettuati in base all'andamento del dato epidemiologico e alle indicazioni del sistema di monitoraggio, con cadenza settimanale fino al cessato allarme. Il trattamento della vegetazione viene effettuata due volte nella prima settimana e una volta per le 2- 3 settimane seguenti. (32)
Sfortunatamente, l'uso eccessivo e inadeguato di questa famiglia di piretroidi, soprattutto nell'agricoltura ha indotto un aumento di popolazioni resistenti di zanzare. Le zanzariere trattate con piretroidi stanno perdendo la loro efficacia in molte zone dell'Africa (Dabiré...). É pertanto essenziale ideare nuove strategie di controllo contro questi vettori della malaria che sono resistenti a questi insetticidi.
1.7. Sviluppo di nuovi farmaci per il controllo della malaria
La fiducia sul controllo del vettore è stata una strategia importante per il successo della riduzione della malaria. Le zanzariere impregnate con insetticidi a lunga durata nelle abitazioni possono diminuire il tasso di esposizione alla malaria nel punto dove sforzi precedenti sono stati adottati per ridurre il reservoir d'infezione. Controllare il vettore può inoltre contribuire a ridurre il tasso dove le infezioni sono diffusi e quindi l'interruzione della trasmissione. (33)
L'interruzione della trasmissione della malaria può essere raggiunta da strumenti diretti contro il Plasmodium oppure l'attacco al vettore. (34) Questi strumenti possono includere per esempio un farmaco oppure un vaccino con proprietà di blocco alla trasmissione della malattia. Farmaci antimalarici con proprietà di blocco alla trasmissione i quali colpiscono lo stadio sessuale del parassita nell'ospite umano (attività gametocidica) oppure lo sviluppo del parassita nella zanzara (attività sporogonica) possono potentemente contribuire a interrompere la trasmissione. (35)
A causa della parziale efficacia dell'artesiminina contro i gametociti, soggetti trattati con l'artesiminina possono ancora trasmettere la malaria. (36) Così ulteriori farmaci più efficaci contro lo stadio del gametocita sono richiesti per impedire completamente la trasmissione. Attualmente, il farmaco approvato che può prevenire la trasmissione del
Plasmodium falciparum è la primachina. (37)
1.8. Contributo delle piante medicinali nel controllo della malaria.
Il forte legame tra piante medicinali e farmaci antimalarici risale al 1820, epoca d'isolamento della quinina da Pelletier e Caventou. (38) Dopo mezzo secolo, scienzati Cinesi isolarono qunghaosu conosciuto oggi come Artemisinina dal qing haosu “Artemisia annua”.(39) L'estratto di tutte e due le piante erano usate tradizionalmente per la gestione della malaria. Tante ricerche sono state fatte nell'esplorazione di piante medicinali svolte a
tenere sotto controllo la malaria come ad esempio la messa a punto di repellenti contro gli insetti per contollare i vettori “zanzare”. (40) Secondo Willcox e Bodeker, i potenziali vantaggi per l'uso di piante medicinali antimalariche sono:
• il basso costo e la facile disponibilità soprattutto se la coltivano loro stessi ( paesi con alto tasso della malattia )
• non vi è alcuna traccia di resistenza dell'estratto, possibilmente dovuto all'azione sinergica di tante componenti
• è possibile che la fitoterapia produce meno effetti avversi che la chemioterapia perchè ci sono tanti agenti attivi, ciascuno a piccolissime dosi.
1.9. Nota sull'Azadirachta indica
L'Azadirachta indica A è un limonoide abbondantemente presente in semi dell'albero della famiglia Meliaceae ed è conosciuta con diversi nomi in tutto il mondo. Il suo nome scientifico è Azadirachta indica Linn derivato dal Persiano “azad darakht i hindi” che significa “albero libero d'India”. In India, l'albero è chiamato neem ( dal Sanskrit nimba sinonimo con arishta, che significa “alleviare la malattia”. Gli Spagnoli e i portoghesi lo chiamano “margosa” e in Swahili in Est Africa è conosciuta come “mwarobaini”, che significa “dei 40” riflettendo le credenze popolari che la pianta può curare 40 malattie. (41) L'esatta origine di Azadiracta indica conosciuta anche come neem è incerta e alcuni autori suggeriscono che è nativa della foresta secca del Sud e Sud-Est Asia includendo il Pakistan, Sri Lanka, Tailandia, Malesia e Indonesia. (42) In questi paesi, il neem è stato e viene sempre usato per diversi scopi curativi e preventivi, per esempio; i ramoscelli come spazzolino da denti, infuso di foglia come tonico e foglie fresche come repellenti per insetti.
1.10. Uso tradizionale per il controllo della malaria
Il neem è ampiamente usato come pianta medicinale. Un'indagine condotta in Niger dimostra che l'uso predominante del neem era a scopo medicinale. (43) Così pure, uno studio recente dell'agenzia dello sviluppo estero Tedesco GZT (Gesellschaft fuer Technische Zusammenarbeit ). Lo stesso sondaggio indicava che le foglie erano la parte della pianta comunemente usate. Uno dei più comuni usi del neem è il trattamento della febbre malarica, dove l'infuso delle foglie viene bevuto. L'utilizzo come antimalarico risale al 1500 avanti Cristo come risulta dal testo Ayurvedic di Charaka, inoltre era spesso adottato nelle colonie Britaniche in India. Veniva preparato macerando 100 grammi della corteccia grattugiata in un litro a 45% in alcool ed era dato a dose comprese tra 1.8 a 3.6 mL. Questo era usato da alcuni medici coloniali in India come alternativo alla chinina. (44) Varie miscele di neem sono state usate: Nadkarmi (1976) riportava che il decotto della corteccia veniva miscelato con un po' di pepe nero (pepe nigrum) e chiretta (Swertia chirata) come medicina popolare contro la febbre. Singh Huidrom (1997) riportava che la polvere della corteccia del neem veniva miscelata con il succo dell' Asparago racemosus e succo di foglie di Oldenlandia corymbosa, e miele e questo veniva somministrato tre volte al giorno. Singh e Anwar Ali (1994) indagarono in cinque stati Indiani e riportarono che le foglie, corteccia, giovane radice e frutti di neem venivano miscelati con zenzero essiccato e con polvere di frutti essiccati di Terminalia bellerica, Terminalia chebula ed Emblica
officinalis, in acqua tiepida per il trattamento della malaria.
L'uso del neem è anche diffuso in paesi Asiatici. In Malesia, la linfa del neem viene bollita insieme a giovani foglie rosse di Vitis spp e legno resinoso di Aquilaria spp. per la cura dello stato febbrile; al paziente viene consigliato di fare il bagno con questa miscela e di berlo per tre giorni. (45)
In Africa, il neem è stato integrato nella medicina locale. La pianta è ampiamente conosciuta e comunemente usata dal popolo e consigliata dai guaritori tradizionali. (46)
Julvez et al. (1995) intervistarono 114 famiglie in zone urbane e rurali del Niger, il 56% segnalava di usare il decotto del neem per il trattamento della malaria. Hirt e Lindsey (2000) raccomandavano un'infusione ottenuta versando un litro d'acqua bollente sopra 15 grammi di foglia di neem e di bere 250 mL di questo 4 volte al giorno. Tuttavia gli estratti con acqua calda e alcool sono quelli principalmente usati in zone urbane (47) , mentre la medicina tradizionale è a favore dell'estratto con acqua fredda. Le foglie (e spesso corteccia e radici) vengono lasciate macerare in acqua fredda fino a diverse settimane. Quest'infuso è poi dato freddo in una dose di circa 100mL due a tre volte al giorno per due o tre giorni. (48)
Anche se miscele complesse del neem con altre piante non sono comuni in Africa come in India, Ahorlu et al. (1997) riportavano che altri ingredienti erano spesso aggiunti, come: limone, zenzero e canfora, mentre Hirt e Lindsey (2000) raccomandavano di bere il neem con la citronella.
Comunemente, le foglie di neem vengono bollite in acqua, e il paziente si siede accanto alla ciotola, si copre con una coperta, inala i vapori fino ad andare incontro ad una profusa sudorazione ; successivamente il paziente beve un po' del decotto. A volte il paziente può anche lavarsi con lo stesso decotto (49) che può anche essere bevuto come profilassi una volta al mese. (50)
Il neem è spesso usato tradizionalmente come repellente per insetti. In Sri Lanka, il 69% di famiglie brucia semi e foglie di neem in vasi di terra cotta per respingere le zanzare nel pomeriggio. (51) In India, si ritiene che i fumi di foglie secche di neem aiutino a prevenire la febbre malarica (52); questo può avvenire attraverso la loro azione repellente per zanzare. In Kenia, Snow et al. (1992) rilevarono che il 3% di famiglie bruciavano le foglie di neem per respingere le zanzare. Anche se non vi è nessuna traccia che l'uso del neem uccida la fase larvale della zanzara, esso è tradizionalmente usato per proteggere cereali immagazzinati e persino libri da insetti nocivi.(53)
Immagini della pianta Azadirachta indica con frutti in maturazione.
2. Scopo della tesi.
Nel lavoro svolto, abbiamo testato l'efficacia degli estratti di frutti di neem (Azadirachta
indica, Meliaceae ), sia verdi che maturi nell’inibire la riproduzione del parassita nella sua
fase eritrocitaria utilizzando il modello della malaria murina Plasmodium berghei, al fine di identificare prodotti della pianta che possano essere ulteriormente studiati come antimalarici naturali. Inoltre, mediante la valutazione dei livelli della pro-metalloproteasi 9 e di quelli del fattore di necrosi tumorale alfa (TNFα) si è voluto verificare l'effetto di questi prodotti sulla risposta infiammatoria che caratterizza l'infezione da Plasmodium. La fagocitosi del pigmento malarico (emozoina) induce l'aumento dell'attività della metalloproteasi 9 di matrice (MMP-9) un endopeptidasi coinvolto nella regolazione delle citochine. (54) La metalloproteasi 9 è un enzima chiave coinvolto sia nella degradazione proteolitica della matrice extracellulare sia in una grande varietà di processi fisiologici che patologici. La sua funzione primaria è la degradazione di proteine nella matrice extracellulare.
La MMP-9 digerisce mediante reazione proteolitica decorina, elastina, fibrillina, laminina, gelatina (collagene denaturato) e collageni di tipo: IV, V, XI e XVI e anche fattori di crescita attivati come pro-TFGbeta e pro-TNFalfa. (55) Il TNFα è prodotto dai fagociti mononucleati, cellule endoteliali e altre cellule in seguito a stimoli infiammatori.
Oltre a regolare l'aumento dell'attività delle MMP-9 esso è in grado anche di:
• favorire il reclutamento dei neutrofili e dei monociti nei focolai di infezione inducendo l'espressione delle molecole di adesione (selectine e i ligandi delle integrine) sulle cellule endoteliali.
• Stimolare la produzione di IL-1, IL-6 e chemochine. • Attivare le funzioni microbicide dei neutrofili e macrofagi. • Indurre la febbre (pirogeno endogeno)
I livelli della MMP-9 sono risultati aumentati nel modello murino della malaria cerebrale nei topi C57BL6 infettati con il Plasmodium berghei ceppo Anka, contrariamente ai topi BALB/c infettati con lo stesso parassita. L'attivazione della MMP-9 inoltre è stata osservata nel cervello dei topi con la malaria cerebrale ma non nel cervello dei topi infettati che non sviluppavano la malaria cerebrale. Alla luce di ciò abbiamo voluto verificare degli estratti dei frutti verdi e gialli di A. indica anche sui livelli di questi due fattori che svolgono un ruolo chiave nella patogenesi della malaria cerebrale.
3. Materiali e metodi.
3.1. Raccolta del materiale della pianta Azadirachta indica
Sono stati raccolti campioni di frutti di Azadirachta indica da collaboratori del Institut de Recherche en Sciences de la Santé a Bobo Dioulasso Burkina Faso che poi sono stati essicati e macerati in luogo e spediti in Italia. I frutti sono stati raccolti in due fasi della loro maturazione: frutti verdi e frutti maturi nell'albero.
3.2. Preparazione degli estratti
Per una resa del 5%, sono stati pesati 50 mg di polvere di frutti verdi, e 50 mg di frutti maturi i quali sono stati aggiunti 100 mL di metanolo assoluto, dopodiché sono stati lasciati in agitazione per 24 ore. Al termine gli estratti sono stati filtrati con la carta da filtro (Whatman no. 1). La procedura è stata ripetuta tre volte sullo stesso campione di partenza. Il metanolo è stato rimosso usando il rotar vapor a 40° sotto pressione ridotta. Il prodotto finale ottenuto dopo la completa evaporazione, era una sostanza oleosa con colore diverso; l'estratto dei frutti verdi con colorazione verde vivace mentre l'estratto dei frutti maturi con colorazione verde scuro- marrone.
Frutto verde: estrazione metanolica
Macchina usata per l'estrazione delle sostanze: Rotavapor
3.3. Composizione chimica degli estratti.
La caratterizzazione chimica è stata effettuata da Taglialatela Scafati e collaboratori dell'università di Napoli Federico II.
In breve il NA è stato sottoposto a cromatografia preparativa mediante colonna di silice utilizzando una serie di combinazione di n-esano, etilacetato e metanolo. Quattordici frazioni sono state raccolte utilizzando un gradiente di eluenti di polarità da n-esano/etilacetato (EtOAc) 8:2 a EtOAc e infine a EtOAc/metanolo 1:1. Le frazioni ottenute sono state preparate per la NMR spettroscopia sciogliendo piccole quantità di frazioni in 600uL di CDCL3 (deuterocloroformio) (Sigma, USA) e trasferite nei tubi per la NMR. La composizione delle frazioni è stata registrata in una lunghezza d'onda di 400 Mhz con strumenti di NMR E MS. Il tetrametilsilano è stato usato come standard interno per la
NMR.
Per la preparazione della colonna di silice (Sigma, USA) sono stati usati pori di dimensioni di 60 Angström, maglia 70-230. Il deuterocloroformio (CDCL3) (Sigma,USA) è stato usato come solvente per la preparazione di ogni framento finale per la NMR spettroscopia. Il tetrametilsilano (TMS), (Sigma, USA) è stato usato come standard interno per la NMR spettroscopia.
3.4. Frazioni del frutto acerbo (semi)
Frazioni frutto acerbo A.indica
(semi) Descrizione preliminare
1 a 6 Acidi grassi
6 Acidi grassi + limonoidi
7 Acidi grassi + limonoidi
8 Acidi grassi + aldeidi
9 Acidi grassi + limonoidi
10 Deacetilnimbina
11 Deacetilnimbina, tracce di nimbin
12 Deacetilnimbina 13 Deacetilnimbina + limonoidi 14 Deacetilnimbina + salannin 15 Salannin 16 Salannin e altro 17 Azadirachtina 18 Azadirachtina 19 Azadirachtina 20 Azadirachtina 21 Azadirachtina 22 Azadirachtina
23 Azadirachtina + altri componenti. 24 a 28 Componenti polari.
3.5. Frazioni del frutto maturo (semi)
• Da 1 a 9: Acidi grassi, trigliceridi, mentre nelle frazioni 8 e 9 ci sono tracce di limonoidi.
• Frazione 10= frazione 11 è una miscela di limonoidi simplici uguale alla frazione 10 del frutto acerbo.
• Frazione 12= frazione 13 miscela di limonoidi diversa dalla precedente. • Frazione 14 Nimbina pulita ( questa frazione è abbondante ed è uno degli aspetti che caratterizza il frutto maturo da quello acerbo.
• Frazione 15 Deacetilnimbina (quantitavamente inferiore rispetto a quello presente nel frutto acerbo).
• Frazione 16 Salannin pulita (si tratta di un limonoide simile alla Nimbina se ci fosse una differenza di attività sarebbe interessante)
• Frazione 17= frazione 18 Miscela di limonoidi. • Frazione 19= 20 Azadirachtina A pressochè pura. • Frazione 21 Miscela di tutte le Azadirachtine.
• Frazione 22, 23 Miscela di prodotti polari quasi priva di limonoidi ma contenente glicosidi o zuccheri puri.
3.6. Procedura di solubilizzazione
Frutto verde Frutto maturo Prima estrazione: 500 mg + 2420 uL
DMSO (1)
500 mg + 1210 uL DMSO Seconda + terza estrazione: 500 mg +
2420 uL DMSO (2) 100 uL + 100 uL Tween80 + 1800 uL acqua. Totale 2000 uL 126 uL (1) + 74 uL (2) = 200 uL 200 uL/topo = 3.3 mg 200 uL + 100 uL Tween80 + 1700 uL acqua. Totale 2000 uL 200 uL/topo = 3.3mg
Controllo artesunato Controllo solvente 4 mg + 100 ul DMSO + 100 uL Tween80
+ 3800 uL acqua 3400 uL acqua400 uL DMSO + 200 uL Tween80 +
200 uL/topo 200 uL/topo
3.7. Ceppo parassita e mantenimento del ciclo.
E' stato usato il ceppo Anka di Plasmodim berghei che ben si adatta al topo per testare l'attività anti-Plasmodium in vivo dell'estratto metanolico dei frutti.
Ciclo vitale del Plasmodium spp. Il ciclo inizia dopo l'inoculo degli sporozoiti nell'ospite umano dalla zanzara femmina infetta durante il pasto di sangue. Il ciclo viene avviato a seguito dell'invasione dei merozoiti negli eritrociti, questi ultimi vanno incontro alla divisione nucleare di 3-4 nuclei che generano circa 10 a 30 nuovi merozoiti; il ciclo dura tipicamente circa 24 ore, 48 ore, e 72 ore per le specie che infettano l'uomo e il topo. Alcuni parassiti negli eritrociti si transformano in gametociti maschi e femmine che saranno ingeriti dalla zanzara. I gametociti escono dagli eritrociti, si attivano in gameti e si uniscono nel lume intestinale della zanzara. Lo zigote formato chiamato okinete attraversa l'epitelio intestinale e si transforma in ocisti in cui migliaia di sporozoiti si sviluppano. Gli
sporozoiti sono rilasciati nel corpo della zanzara e più tardi passano attraverso le ghiande salivari per entrare nel dotto salivare. (56)
3.8. Animali.
Sono stati impiegati topi BALB/c e C57BL6 di peso compreso tra 18 e 25 grammi, e di età compresa tra 7 e 10 settimane. Sono stati allevati e alimentati nello stabulario dell' università di Camerino (24°C, ciclo di 14 ore di luce/ 10 ore buoi e 70% di umidità relativa. (57)
L'infezione dei topi si effettuava usando capillari ripieni di sangue proveniente da topi infettati con il P. berghei ceppo Anka conservati in azoto liquido nel laboratorio dell'Università di camerino.
Al giorno 0 3 topi BALB/c venivano innoculati intraperitonealmente parassiti
Plasmodium berghei ceppo Anka contenuti nei capillari conservati in azoto liquido. (I
capillari contenenti i parassiti venivano rotti e miscelati rapidamente in 250uL di PBS 1X PH 7.2,infine 200uL venivano prelevati per la somministrazione intraperitoneale ai topi.).
Il giorno 4 cioè venerdì; si fa il passaggio aciclico.
Prima cosa da fare prepare la soluzione di Giemsa al 10%, con PBS 1X PH 7.2 poi Vetrini per lo striscio (il sangue veniva prelevato dalla coda dei topi per lo striscio quando si asciugavano gli stricci si aggiungeva il metanolo per fissare i globuli rossi.)
Quando si asciugavano i vetrini dopo aver aggiunto il metanolo si poteva ora mettere la soluzione di Giemsa per la colorazione e aspettare almeno 45 minuti per la lettura al microscopio ottico per la valutazione della parassitemia di ciascun topo (per il calcolo della parassitemia si fa: globuli rossi infetti : globuli rossi totali = X : 100 dopo di che determino la X cioè la parassitemia. Scegliamo un buon campo per la conta dei GR (gobuli rossi) e contiamo il numero di globuli rossi infettati (conto solo le forme ad anello: trofozoiti un minimo di 500 globuli rossi totali dovrebbe essere contato) rispetto ai globuli rossi totali
per scegliere il miglior topo donatore (la parassitemia ottimale è compresa tra 5% e 10%). Infine metto una goccia di olio ad immersione sulla sorgente luminosa ed analizzo il vetrino usando un microscopio ottico con un obbiettivo 100X.
Poi si valuta l'ematocrito: contiamo il numero totale di globuli rossi/uL di sangue. In due eppendorf da 1,5mL: nel primo metto 245uL e nel secondo 495uL di PBS 1X PH 7.2 aggiungo nel primo eppendorf 5uL di sangue prelevato dalla coda del topo donatore (diliuzione 1:50). Poi prendo altri 5uL da quest'ultimo e aggiungo nel secondo eppendorf per aver una diliuzione finale 1:5000.
Poi prendo la camera di Neubauer e aggiungo 7uL della diliuzione finale e vado a contare al microscopio ottico il numero totale dei globuli rossi osservando 4 grandi quadranti e facendo poi la media. Utilizzo un Obbiettivo: 40X; oppure 10X. Dalla media ottenuta dalla conta dell'ematocrito moltiplico per 10 poi per 5000 e ottengo XGR/uL.
Per sapere quanto sangue dovrei prelevare al topo donotare per avere 10000000 globuli rossi infetti faccio: parassitemia:100 = X:GR/uL da cui determino il valore di X e so quanto sangue dovrei prelevare dal topo per l'infezione dei topi per il passaggio aciclico.
3.9. Four day suppression test.
È stato fatto per prima cosa l'infezione di 3 topi BALB/c con Plasmodium berghei ceppo Anka presi da capillari conservati in azoto liquido al giorno 0. Il 4° giorno veniva fatto il passaggio aciclico ai vari gruppi di topi per lo sperimento cioè 4 gruppi di 7 topi per ciascun ceppo di topo. La scelta del topo per cui si fa il prelievo del sangue per infettare i gruppi di topi viene valutato mediante parassitemia ed ematocrito.
500 mg di estratto oleosa di frutti verdi e frutti maturi sono stati sciolti ciascuno in 1210 microlitri di dimethyl sulfoxide ( DMSO Sigma Aldrich ) per la preparazione della soluzione stock. Poi dalla soluzione stock sono stati presi 100 microlitri di ogni estratto in cui sono stati aggiunti in ciascuno 1800 microlitri di acqua distillata, e 100 microlitri di
TWEEN 80 ( Sigma Aldrich ). Per un volume totale di 2000 microlitri, 200 microlitri della soluzione contiene 150 mg/kg di ogni estratto ed è stato somministrato per via orale ai topi infettati con Plasmodium berghei ceppo Anka.
3.10. Dosaggio della pro-metalloproteasi 9.
I livelli della proteina sono stati valutati con un kit commerciale (Raybiotech, Norcross, Georgia U.S.A.) che faceva uso di un sistema ELISA a sandwich con l'impiego di un anticorpo monoclonale specifico per la forma pro della MMP-9 di topo, sia per il coating della piastra che per la rivelazione della proteina dosata, in questo caso dopo biotinilazione. L'aggiunta di perossidasi di rafano marcata con streptavidina ha permesso di valutare la densità ottica del prodotto di transformazione di perossidasi di idrogeno in presenza di un cromogeno quale la tetrametilbenzidina (TMB). La lettura è stata effettuata con un lettore per micro piastre Victor® alla lunghezza d'onda di 450 nm. Il livello di sensibilità del kit era di 50 pg/ml
3.11. Dosaggio del fattore di necrosi tumorale alfa.
I livelli della citochina sono stati valutati con un kit commerciale (eBioscience Inc., San Diego, Ca, U.S.A.) che faceva uso di un sistema ELISA a sandwich con l'impiego di un anticorpo monoclonale specifico per il TNF alfa di topo, utilizzando una procedura simile a quella esposta per il dosaggio della pro- MMP-9. Il livello di sensibilità era di 8 pg/ml
3.12. Analisi statistica.
L'analisi statistica è stata condotta mediante il metodo ANOVA a due vie, i valori riportati sono stati calcolati come media + o - deviazione standard di esperimenti indipendenti condotti su due differenti ceppi di topo (C57BL/6 e BALB/c n=7). *p<0,05
rispetto al gruppo artesunato BALB/c
Per quanto riguarda il trattamento con i frutti di A. indica . Per i livelli plasmatici di marker di infiammazione, dall'analisi della varianza a due vie sembra che per quanto riguarda la MMP-9 la fonte di variabilità sia dovuta sia alla specie che al trattamento mentre per il TNF-a la fonte di variabilità è legata alla specie non al trattamento.
4. Risultati.
4.1. Confronto dell'andamento della parassitemia in topi C57BL6 e
BALB/c.
Figura 1.
I topi BALB/c contrariamente ai topi C57BL/6 al giorno 12 hanno una parassitemia media inferiore al 30% e soppravvivono fino al giorno 21 dove poi sviluppano una parassitemia oltre il 70% e poi vanno incontro a morte.
Figura 2.
I topi C57BL/6 al giorno 12 sviluppano una parassitemia oltre il 70% e vanno incontro a morte per la maggior parte mentre alcuni al giorno 5 e 8 non soppravvivono.
4.2. Risultati 4 day suppression test.
Figura 3.
I topi C57BL6 parassitati e trattati con l'artesunato avevano in media un decremento della parassitemia del 45%. Gli animali C57BL6 parassitati e trattati con il frutto verde avevano un decremento della parassitemia del 25% mentre quelli trattati con il frutto giallo avevano un decremento del 40%. I topi BALB/c parassitati e trattati con l'artesunato avevano in media un decremento della parassitemia del 60%, rispetto agli animali BALB/c parassitati e trattati con il frutto verde un decremento della parassitemia del 8% ed infine quelli parassitati e trattati con il frutto giallo un decremento della parassitemia del 25%.
La parassitemia del controllo solvente dei topi C57BL6 e BALB/c è del 7,35% e 6,41% rispettivamente.
4.3. Dosaggio della pro-metalloproteasi 9.
Figura 4.
I livelli della pro-metalloproteasi-9 del ceppo C57BL/6 trattato con il frutto verde sono significativamente elevati rispetto al ceppo BALB/c trattato con lo stesso frutto e con il controllo artesunato dello stesso ceppo C57BL/6.
4.4.
Dosaggio del fattore di necrosi tumorale alfa.
Figura 5.
Per quanto riguarda il TNF-a, mentre non c'è nessuna variabilità nei topi BALB/c; i C57BL/6 trattati con il frutto verde hanno livelli significativamente alti rispetto ai gruppi non infetti e ai ceppi BALB/c trattati con il frutto verde. I C57BL/6 del controllo negativo solvente hanno livelli significativamente elevati rispetto al gruppo non infetto.
5. Discussione
Lo scopo principale di questo studio è stato quello di valutare l'efficacia degli estratti di limonoidi prelevati dai frutti acerbi e frutti maturi della pianta A. indica mediante estrazione metanolica per vedere se queste sostanze erano in grado di inibire la riproduzione del parassita nella sua fase eritrocitaria utilizzando il modello della malaria murina P. berghei. Valutando la parassitemia di questi estratti dati per via orale 150 mg/kg dei semi di frutti sia verdi che gialli si sono rivelati inefficaci contrariamente ad esperimenti condotti in letteratura.
Gli estratti del grano dell'Azadirachta indica A contengono una miscela di più di cento composti. (58) Tra i quali l'azadirachtina sarebbe l'uno dei bio-insetticida i più importanti. (59) Tuttavia, la quantità di azadirachtina contenuta nei grani varia considerabilmente a seconda delle condizioni climatiche, delle condizioni del suolo, e del genotipo dell'albero. (60) Dunque da un anno all'altro, un albero può produrre degli estratti che contengono quantità diverse di azadirachtina. Alcuni lavori hanno dimostrato che non solo l'azadirachtina sia responsabile della mortalità degli insetti testati ma ben una miscela di sostanze presente negli estratti. (61)
Bedri e al. nel 2013 riportavano in uno studio che l'estratto etanolico di A. indica proteggeva i neuroni piramidali nei topi (maschi albini Swiss) infettati con ceppo Anka di
P. berghei. Gli animali infettati con i parassiti (un milione) dopo cinque giorni
manifestavano i segni della malattia mentre i segni della malaria cerebrale si manifestavano circa 6 a 7 giorni dopo l'infezione, i sintomi più ricorrenti erano: il pello arruffato, la menomazione locomotoria, comportamento della malattia (anoressia, cachessia, febbre) associati alla perdita del peso. Fecero due controlli positivi in cui a ciascun gruppo degli animali erano somministrati Clorochina 12 mg/kg i.p. Artemeter 1,6 mg/kg i.p.
mg/kg i.p. Il trattamento fu iniziato all'insorgere dei segni della malaria cerebrale e proseguito per cinque giorni dato una volta al giorno. Dopo osservazione i gruppi trattati con la Clorochina oppure Artemeter non presentavano più la febbre e quelli trattati con gli estratti a 500 mg/kg la locomozione e la perdità del peso erano migliorati. La parassitemia era ridotta nei topi trattati con Clorochina e Artemeter ma non significativamente nei topi trattati con gli estratti. L'estratto di Azadirachta indica non protegge i topi infettati e trattati con gli estratti dalla morte come la Clorochina e Artemeter ma ritarda il tempo della morte. Topi non trattati morivano spontaneamente entro 9 e 10 giorni dopo l'infezione mentre topi infettati e trattati con gli estratti in particolare a dose più alta cominciavano a morire al giorno 11 mentre nei gruppi trattati con la Clorochina e Artemeter allo stesso tempo non morivano. L'estratto di A. indica riduce in modo significativo l'edema cerebrale in confronto ai gruppi infetti non trattati a tutte le dose e paragonabile al gruppo trattato con Clorochina e Artemeter. Inoltre l'A. indica riduce significativamente l'espressione di NOS e TNF specialmente dato ad alte dosi 1000 mg/kg. (62)
Inoltre sono stati valutati la pro-metalloproteasi 9 di matrice in quanto la fagocitosi del pigmento malarico (emozoina) induce l'aumento dell'attività della metalloproteasi 9 di matrice (MMP-9) un endopeptidasi coinvolto nella regolazione delle citochine in particolare TNF-alfa. (63) In accordo con la letteratura scientifica i topi C57BL6 in particolare quelli trattati con i frutti verdi mostrano alti livelli significativi della pro-metalloproteasi-9 rispetto al controllo artesunato dello stesso ceppo e ceppi BALB/c, confermando quanto detto in letteratura che i C57BL/6 sono ceppi che manifestano la malaria cerebrale contrariamente ai BALB/c che non mostrano alti livelli della MMP-9 infettati con P. berghei ceppo Anka. Livelli di TNF-a si sono rivelati elevati e significativi nei C57BL6 in particolare il gruppo trattato con il frutto verde rispetto al controllo artesunato, mentre i topi BALB/c non mostrano nessuna variabilità nei vari gruppi di trattamento confermando ancora che i topi C57 BL/6 sono ceppi suscettibili di sviluppare
la malaria cerebrale.
Philippe et al. riportarono in uno studio condotto su due ceppi di topo C57BL/6 e BALB/c infettati con il ceppo Anka di P. berghei dopo analisi degli organi (fegato milza e cervello) che topi C57BL/6 presentano aumenti livelli dell'attività delle MMP-9 e manifestano la malaria cerebrale ma non i topi BALB/c che non la manifestano. I BALB/c presentano alti livelli di TIMP-1 e MMP-3 indicando il ruolo protettivo di questi marker.
Topi C57BL/6 infettati con ceppi NK65 di P. berghei e topi BALB/c infettati con P.
berghei ceppo Aka non manifestano la malaria cerebrale. (64)
6. Conclusioni.
I topi C57BL6 e BALB/c sono ceppi inbred che presentano una diversa cinetica della parassitemia; I trattamenti con gli estratti non hanno significativamente ridotto la parassitemia in confronto all'effetto di riferimento ottenuto con l'artesunato, in entrambi i ceppi di topo; I livelli della MMP-9, sono risultati significativamente aumentati nei topi C57BL6 soltanto con i frutti verdi in confronto ai BALB/c e agli stessi C57BL6 trattati con l'artesunato; per quanto riguarda i livelli plasmatici di TNF-a non sono state osservate differenze significative nei topi BALB/c indipendentemente dal trattamento effettuato mentre quello con frutti verdi nei topi C57BL6 ha determinato un incremento significativo in confronto ai topi dell'altro ceppo. I nostri risultati sono incoraggianti per studiare ulteriormente gli estratti di A. indica per valutarne un possibile impiego nella terapia antimalarica.
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