SEZIONE II - PARTE SPERIMENTALE

SEZIONE II - PARTE SPERIMENTALE

II.1 MATERIALI:

1. Desametasone (DMS)(Sigma)

2. 2-dietilamminoetil cloruro (DEAE-Cl) cloridrato (Sigma)

3. Estere dell’acido 3-(2-piridilditio) propionico con N-idrossisuccinimmide (Sigma)

4. Pentothal sodico, Farmaceutici Gellini, Aprilia, Italia

5. Chitosano (minimum 90% deacetilato) ottenuto dal guscio del gambero (Ch) (Chito-clear FG90, Primex, Drammen, Norway). Il Ch commerciale ha un peso molecolare medio viscometrico di 590 kDa. Il grado di acetilazione determinato con IR o NMR è 90 o 82%, rispettivamente 6. Sali e solventi (Carlo Erba)

II.2

SINTESI

E

CARATTERIZZAZIONE

DEI

DERIVATI

MULTIFUNZIONALI DEL CHIOSANO (N

-Ch-SH)

La dietilamminoalchilazione del chitosano è stata effettuata come descritto in un precedente lavoro (Zambito et al. 2008). Due grammi di Ch commerciale in polvere sono stati disciolti in 80 ml di acido cloridrico 0.11 M (pH 4.7)(8.7 ml di HCl 1 N portati a volume di 80 ml in un cilindro da 100 ml con acqua deionizzata). Per la reazione, 5 g di DEAE-Cl HCl, e 11 ml di idrossido di sodio 15% p/v sono stati aggiunti in sequenza alla soluzione di chitosano sotto energica agitazione, a 60-65°C. Il rapporto molare tra DEAE-Cl e l’unità di ripetizione di Ch è 4:1. Dopo aver aggiunto la soluzione di idrossido di sodio, si è formata una mucillagine, che si è sciolta in circa 5 min. L’agitazione ed il riscaldamento vengono mantenute per un totale di 2 ore durante le quali il pH è stato mantenuto a 8, aggiungendo una soluzione concentrata di idrossido di sodio.

filtro sotto vuoto e successivamente è stata purificata per dialisi (Spectra/Por®, cut-off 3500 Da, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) per due giorni contro acqua deionizzata. La dialisi è continuata fino all’assenza di cloruro nella fase esterna, la soluzione interna è stata poi liofilizzata. Secondo l'analisi NMR (10 mg/ml in D2O, Varian spectrometer 600 MHz, a 250.1 °C), il derivato ottenuto ha un grado di sostituzione del 59.2±4.5% e una media di 1.7±0.1 gruppi ammonici quaternari per catena laterale (sigla, N+(60)-Ch).

Per la tiolazione è stato seguito lo schema di sintesi riportato in Fig. 1. A 50 ml di una soluzione acquosa di N+(60)-Ch (0.5 % p/v) sono stati aggiunti goccia a goccia 20 ml di una soluzione etanolica dell’estere dell’acido 3-(2-piridilditio) propionico con N-idrossisuccinimmide (0.46% p/v). La miscela di reazione è stata posta in agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Una porzione di tale miscela è stata purificata per dialisi come descritto sopra e successivamente liofilizzata. Il prodotto ottenuto da questo I step di sintesi è stato caratterizzato per spettroscopia NMR come descritto sopra. La porzione rimanente della miscela di reazione è stata sottoposta al II step di sintesi aggiungendovi 1.5 ml di una soluzione acquosa di NaBH4 al 5% p/v. Dopo un’ora di agitazione l’eccesso di NaBH4 è stato distrutto con HCl concentrato, che ha portato la miscela a pH 3. La miscela è stata purificata per dialisi utilizzando la stessa membrana descritta sopra una volta contro HCl 5 mM, due volte contro HCl 5 mM contenente 1% di NaCl ed infine contro HCl 1 mM. La miscela così purificata è stata liofilizzata.

Il polimero ottenuto è stato caratterizzato per NMR come descritto sopra, nella Fig. 2 sono riportati gli spettri dei prodotti del I e del II step di reazione. Il grado di sostituzione con gruppi tiolici è stato determinato per titolazione iodometrica del gruppo –SH. Sei mg del coniugato sono stati sciolti in 2 ml di acqua, poi il pH è stato aggiustato a 2-3 con HCl 1M ed è stato aggiunto un ml di una soluzione di amido 1% p/v. Il campione è stato titolato con iodio acquoso 1 mM fino a persistente colorazione della soluzione. La percentuale di unità di ripetizione del chitosano sostituite con gruppi tiolici era 5% per questo al polimero è stata assegnata la sigla N+(60)-Ch-SH(5).

stata mai osservata una riduzione significativa dei gruppi tiolici. Il derivato ammonico quaternario tiolato del Ch è stato conservato a 4°C.

II.3 MISURE DI PERMEAZIONE ATTRAVERSO CORNEA DI

CONIGLIO ISOLATA

Sono stati utilizzati conigli albini maschi, New Zealand, di peso compreso tra 4.5 e 5.0 kg. Questi conigli sono stati trattati come previsto nella "Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio" (NIH Publication No. 92-93, riveduto 1985). Tutti gli esperimenti sono stati effettuati sotto la supervisione di un veterinario, ed i protocolli sono stati approvati dal Comitato etico scientifico dell'Università. I conigli sono stati sacrificati con un’iniezione endovenosa di pentobarbital.

Le cornee sono state asportate dagli occhi lasciando un anello di sclera di 2 mm e montate nelle celle di perfusione. La superficie della cornea disponibile per la diffusione è di 0,78 cm2. Le celle sono state mantenute a 35 ± 1°C.

Nelle celle sono state aggiunte la fase donatrice (1.0 ml) e la fase ricevente (3.0 ml) costituite da un tampone Ringer pH 6.8 contenente glutatione (sigla, TR). Per garantire l’ossigenazione e l’agitazione, si è fatto gorgogliare in ogni compartimento una miscela di O2-CO2 (95:5) ad una velocità di 3-4 bolle/s. Dopo 10 minuti di stabilizzazione, la soluzione donatrice è stata sostituita con 1.0 ml di una sospensione della sostanza in esame (DMS) 0,3% p/v in TR (controllo), o in TR contenente l'1% p/v del polimero allo studio. A intervalli di tempo regolari (ogni 30 min), sono stati prelevati per l’analisi 100 µl dalla fase ricevente e sostituiti con un uguale volume di tampone fresco. Ogni esperimento è durato 4 ore ed è stato ripetuto almeno 6 volte.

II.4 TRATTAMENTO DEI DATI DI PERMEAZIONE

Per ciascun esperimento di permeazione è stato calcolato un valore di permeabilità apparente, P*app, del DMS attraverso la cornea secondo la

seguente equazione, assumendo un trasporto passivo in condizioni di stato stazionario:

P*app= dM/dt 1/AC0 Eq. 1

dove: dM/dt 1/A, è il flusso, rappresentato dalla pendenza della porzione lineare del grafico della quantità cumulativa permeata per unità di superficie vs tempo,

C0 è la concentrazione iniziale, che nel caso di DMS, che è presente nella fase

donatrice in forma di sospensione, è teoricamente uguale alla solubilità del farmaco in tale fase in assenza del polimero (0.12 mg/ml).

Per ciascun grafico è stata effettuata una regressione lineare della serie di dati che dava il miglior fitting sulla base del valore di r2. Inoltre per ciascun grafico è stato calcolato il lag time, L*, che è l’intercetta della regressione lineare con l’asse del tempo. I singoli valori di P*

app e L* sono stati mediati per calcolare

il valore di permeabilità apparente media, Papp ed il valore medio di lag time, L

(n=6).

La quantità media cumulativa permeata per unità di superficie calcolata per ogni punto del grafico è stata utilizzata per determinare T4h, i.e., il trasporto cumulativo durante l’intera durata dell’esperimento. La significatività delle differenze tra due valori di Papp, o L, o T4h è stata determinata sulla base del test

del t di Student (P < 0.05).

Per i derivati del chitosano che producono un aumento significativo della

Papp, questo è stato misurato attraverso il calcolo del fattore di promozione, FP,

definito come il rapporto tra due valori di Papp ottenuti in presenza e in assenza

II.5

VALUTAZIONE

GRAVIMETRICA

DEI

LIVELLI

DI

IDRATAZIONE CORNEALE

Alla fine di ogni permeazione le cornee sono state rimosse dagli apparecchi di perfusione, e la percentuale del livello di idratazione corneale è stata valutata misurando la quantità totale d'acqua nella cornea.

Dopo un’attenta rimozione della sclera, le cornee sono state lavate delicatamente con tampone Ringer ed altrettanto delicatamente asciugate rimuovendo il tampone in eccesso. A questo punto è stato determinato il peso di ciascuna cornea idratata (Pi) (10-5 g).

Il campione è stato poi essiccato in stufa a 100°C per 6 ore, fino al raggiungimento di un peso costante (peso cornea essiccata, Pe). Il livello di idratazione corneale (LI%) è stato calcolato come [1 - (Pe/Pi)] 100.

II.6 PREPARAZIONE DI GOCCE OFTALMICHE

Per le prove in vivo sono state preparate le seguenti gocce oftalmiche:  0.3% p/v DMS, in tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con

NaCl (sigla, TF);

 0.3% p/v DMS, 1% p/v N+

(60)-Ch, in TF;  0.3% p/v DMS, 1% w/v N+

(60)-Ch-SH(5) in TF.

Le particelle di farmaco (<1.5 µm) sono state ottenute per spray-drying di una soluzione di DMS (0.1 mg/ml) (Mini Spray Dryer Büchi B-191, temperature aria d’ingresso e d’uscita 150 e 60°C, rispettivamente; diametro ugello, 0.7 mm; portata, 8 ml/min).

L'osmolalità delle gocce, misurata con un microosmometro (Hermann Roebling, Berlino) era compresa tra 380 e 394 mOsm/kg.

I reogrammi delle gocce sono stati registrati a 35°C con reometro Haake RS1 dotato di cilindri coassiali Z40 (rotore) e Z41 (statore). I dati sono stati acquisiti e analizzati utilizzando Rheo Win Pro software (Haake).

II.7 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI ELIMINAZIONE DEI

FARMACI DAL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI

Sono stati utilizzati conigli albini maschi, New Zealand, di peso compreso tra 3.5 e 4.0 kg. Questi sono stati trattati come specificato nel paragrafo II.3. Una goccia (50 µl), corrispondente a 0.15 mg di DMS, è stata instillata nel sacco congiuntivale inferiore dell’occhio, avendo cura di evitarne la fuoriuscita. Per determinare la cinetica di scomparsa di DMS dal fluido lacrimale tale fluido è stato prelevato a vari intervalli di tempo dalla rima palpebrale inferiore utilizzando capillari in vetro da 1.0 µl (Microcaps, Drummond scientifico Co., USA), che dopo lo svuotamento venivano sciacquati con 1.0 µl di acqua. Dopo un ulteriore diluizione con 100 µl di acqua, i campioni sono stati direttamente analizzati mediante HPLC come descritto nel paragrafo II.10.

II.8 TRATTAMENTO DEI DATI DI ELIMINAZIONE

I dati di concentrazione nel fluido lacrimale (CFL ) vs. tempo, ottenuti con le gocce oftalmiche preparate come descritto nel paragrafo II.6, sono stati utilizzati per calcolare il tempo medio di residenza di DMS nel fluido lacrimale dei conigli. Tale valore è stato da noi espresso mediante il parametro MRT (Mean Residence Time). Esso risulta dal rapporto tra l’AUMC (Area Under Momentum Curve), che è l’area sotto la curva CFLt vs. t e l’AUC, che è l’area sotto la curva CFL vs. t. AUMC e AUC sono state calcolate con il metodo dei trapezi, tra il tempo 0 e il tempo a cui CFL scende sotto il minimo quantificabile. Per ogni curva di eliminazione determinata in ogni singolo occhio è stato calcolato il rispettivo valore di MRT. Si sono così ottenuti da animali diversi 8 valori di cui si sono calcolati media ed ES. La significatività della differenza tra le medie è stata valutata sulla base del test del t di Student (P<0.05).

Inoltre è stato riportato il tempo di residenza massimo del farmaco nel fluido lacrimale (RTmax) a concentrazioni quantificabili. Questo tempo corrisponde all'ultimo punto del grafico CFL vs. tempo per il farmaco. In questo

CFL ottenuti con i diversi animali. Il valore minimo quantificabile di CFL era 2.5 µg/ml per DMS, considerando la necessità di diluire i campioni prelevati almeno 1:50 v/v.

II.9 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI DMS NELL’UMORE

ACQUEO

Sono stati utilizzati conigli albini maschi, New Zealand, di peso compreso tra 4.5 e 5.0 kg. Essi venivano trattati come specificato nel paragrafo II.3. Una goccia (50 µl), corrispondente a 0.15 mg di DMS, è stata instillata nel sacco congiuntivale inferiore dell’occhio, avendo cura di evitarne la fuoriuscita.

Per misurare la penetrazione transcorneale di DMS, dopo un tempo prestabilito dall’instillazione del collirio (30, 45, 60, 75, 90, 120, 150 e 180 min) si è proceduto ad anestetizzare l’occhio del coniglio e quindi sono stati aspirati dalla camera anteriore circa 60-80 µl di umore acqueo utilizzando una siringa da insulina da 1.0 ml. Sono stati utilizzati almeno sei animali per ciascun intervallo di tempo.

Ogni campione è stato mescolato con un uguale volume di metanolo (50 µl), centrifugato a 13000 gpm per 10 min ed il surnatante è stato analizzato all’HPLC come descritto nel paragrafo II.10.

II.10 METODO HPLC

L’apparecchiatura per HPLC “High Pressure Liquid Cromatography o

High Performance Liquid Cromatography” è costituita da una pompa

Perkin-Elmer Series 200, da un rivelatore UV Perkin-Perkin-Elmer e l’integrazione dei dati è effettuata mediante il programma Turbochrom Navigator HPLC. La valvola di iniezione è una Rheodyne da 20 µl. La colonna è Spheri-5 RP18 250x4.6 mm 5 µm.

La fase mobile è costituita da metanolo/acqua 50:50, il flusso è 1 ml/min, la rivelazione UV è a 241 nm.

Le curve di calibrazione venivano costruite analizzando almeno 5 standards per curva. Le soluzioni standard per l’analisi del fluido lacrimale venivano preparate in acqua, quelle per l’analisi dell’umore acqueo venivano preparate aggiungendo 50 l di soluzione di DMS in metanolo a 50 l di umore acqueo non contenente farmaco, quindi omogeneizzando la miscela al vortex e centrifugando a 13000 gpm per 10 min. Le curve di calibrazione costruite in giorni diversi erano tutte lineari (r2>0.99) nell’intervallo di concentrazione 0-6.4 g/ml (limite di determinazione, 0.5 g/ml). La concentrazione del farmaco in ogni campione analizzato in un certo giorno è stata determinata in riferimento alla curva di calibrazione costruita in quel giorno. Il tempo di ritenzione è 9.1 min.