Capitolo 4
Risultati Sperimentali
4.1 Prototipazione rapida del dispositivo
Come descritto nel Paragrafo 3.1 dopo aver realizzato il modello 3D del dispositivo mediante il software CAD si è passati alla stampa 3D. In Figura 4.1a è illustrato il prototipo assemblato in una delle sue possibili configurazioni, con all'interno due contact electrode realizzati in resina; in Figura 4.1b sono mostrate le singole componenti dell'intero sistema: il contact electrode (Figura 4.1b.1), il no contact electrode (Figura 4.1b.2), il supporto per lo scaffold (Figura 4.1b.3), le sezioni componibili il guscio esterno (Figura 4.1b.4) ed la base (Figura 4.1b.5). Il no contact electrode e il contact electrode sono stati realizzati sia in materiale plastico che in metallo (vedi Appendice A).
Figura 4.1. Rappresentazione del prototipo e dei singoli componenti. In a) viene illustrato il montaggio di una
possibile configurazione degli elettrodi che si può realizzare con il dispositivo. In b) sono riportati i singoli elementi compresi gli elettrodi realizzati in metallo; in c) è illustrato il montaggio parziale dei singoli elementi con la base removibile non assemblata.
78 In Figura 4.1c, invece, sono mostrate due sezioni del guscio: in Figura 4.1c.1 l'elettrodo di contatto è assemblato e fissato in una delle due aperture del guscio esterno, inoltre si può notare la vite che regola l'altezza del vero e proprio elettrodo di contatto; in Figura 4.1c.2 è mostrato il montaggio del no contact electrode.
4.2 Risultati delle simulazioni
La geometria importata in COMSOL Multiphysics® presenta due approssimazioni non influenti sulla fisica del problema; tant'è vero che al posto del guscio esterno del prototipo è stato aggiunto un semplice cilindro esterno che rappresenta il mezzo di coltura e la geometria degli elettrodi ha caratteristiche dimensionali simili ai prototipi. Le approssimazioni geometriche derivano dal fatto che sono state apportate migliorie al prototipo durante la fase di realizzazione.
La configurazione degli elettrodi scelta per l'electroadsorption delle proteine prevede un elettrodo posto a contatto con il substrato conduttivo e un elettrodo di riferimento che non interagisce direttamente con il substrato conduttivo ma è semplicemente immerso nel mezzo di coltura (Figura 4.2).
Figura 4.2. Illustrazione della geometria e delle condizioni impostate al sistema simulato.
Dalla simulazione è emerso che la tensione sullo scaffold risulta uniforme, con valore medio di 0,99 V su tutta la superficie. In Figura 4.3 sono illustrati i risultati ottenuti dalla simulazione, grazie ai quali si possono dedurre degli ottimi presupposti per ottenere un adsorbimento uniforme di proteine sulla superficie dello scaffold.
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Figura 4.3. Screenshot dei risultati ottenuti dalle simulazioni. A sinistra è illustrata la distribuzione della tensione
nell'intero sistema e le linee bianche indicano l'andamento della densità di corrente.; a destra è mostrato nel dettaglio il risultato della simulazione sullo scaffold. Le colorbar indicano i valori di tensione che si distribuiscono quando viene applicata una tensione di 1 V al working electrode.
4.3 Scaffold conduttivi microcorrugati: caratterizzazione
topografica
Come descritto dettagliatamente nel Paragrafo 3.4 l'analisi delle immagini ha avuto lo scopo di ricavare le periodicità λ0 da immagini SEM e le ampiezze A da immagini
AFM, per studiare e caratterizzare una nuova topografia superficiale ottenuta per effetto del surface wrinkling tra una foundation di PolyShrink e una skin costituita da Au e PEDOT:PSS.
La caratterizzazione ha previsto variazioni di diversi parametri di fabbricazione dei substrati per ottenere pattern micrometrici noti per la stimolazione della crescita cellulare lungo una direzione ben definita.
4.3.1 Periodicità lungo il piano x-y
Come accennato nel Paragrafo 2.3.1 in letteratura è stata studiata la topografia di superfici micro e nanocorrugate ottenute per processi di surface wrinkling sia in sistemi costituiti da PolyShrink ed Au sia da sistemi costituiti in PolyShrink e PEDOT:PSS. In particolare, la periodicità lungo la superficie (piano x-y) e la misura delle lunghezze d'onda λ dei sistemi micro- e nanopatternati è fondamentale per capire se le dimensioni a cui le cellule si andranno ad interfacciare sono paragonabili alle loro, così da poter
80 promuovere la loro crescita in direzioni ben definite. In questo lavoro di tesi ci si prefiggeva di ottenere scaffold conduttivi aventi corrugazioni con lunghezze d'onda inferiori ad 1 µm (dimensione paragonabile a quella cellulare). I sistemi bilayer Polyshrink/PEDOT:PSS studiati in precedenza [71], sebbene ottimizzati per l’ottenimento di corrugazioni a questa stessa scala, avevano lo svantaggio di non possedere uno strato metallico per garantire un efficiente contatto elettrico e soprattutto per garantire l’applicazione di una tensione spazialmente uniforme su tutta la superficie dello scaffold quando impiegati in un esperimento di elettroadsorbimento di proteine. Infatti, a causa del peculiare comportamento elettrochimico del PEDOT:PSS (attivazione elettrochimica) le regioni immediatamente adiacenti ai contatti elettrici vengono attivate, variando la propria conducibilità, e dunque instaurando una caduta di tensione tra punti diversi e distanti sullo scaffold stesso (in particolare tra i contatti e la parte terminale dello scaffold). Esperimenti preliminari su tali sistemi avevano evidenziato un funzionamento inefficiente che risultava in un elettroadsorbimento non uniforme (i.e. le proteine testate venivano adsorbite in prossimità degli elettrodi e non sul resto dei campioni). Al fine di provvedere una migliore e uniforme conducibilità dei sistemi studiati su tutta la superficie e ovviare ai problemi esposti, nel presente lavoro di tesi si è optato per la realizzazione di un sistema a tre strati, in cui sul substrato termoretraibile (Polyshrink) vengono depositati un primo layer di Au e un secondo layer di PEDOT:PSS. Tale configurazione, essendo del tutto originale rispetto ai lavori precedentemente pubblicati in materia, ha richiesto una attenta caratterizzazione della topografia superficiale, al fine di ottimizzare il processo per la realizzazione degli scaffold e individuare i parametri più adatti per i successivi esperimenti di electroadsorption di proteine. Tale caratterizzazione è stata condotta effettuando l’analisi delle immagini SEM di campioni uniassiali. In particolare si è studiata la variazione della topografia di tali materiali al variare dello spessore di Au depositato per sputtering su un substrato di PS (6 nm, 12 nm, 40 nm, 60 nm). Tutti i campioni possedevano un ulteriore strato di PEDOT:PSS depositato sul precedente e realizzato per spin coating a velocità 4000 rpm per 60 secondi di PEDOT:PSS. Lo studio è stato volto ad evidenziare effetti determinanti sulle caratteristiche delle corrugazioni dei campioni, a causa della rigidità del film di Au, paragonando i risultati con quanto già noto in letteratura. Per ottenere dei risultati statisticamente significativi dal processing delle immagini, le misure sono state effettuate su tre immagini differenti prese su di uno stesso campione e i dati corrispondenti alle lunghezze d'onda sono stati valutati mediante T-test, confrontando tra loro due gruppi di dati. In Figura 4.4 sono illustrate le immagini SEM relative a campioni uniassiali con quattro diversi spessori di Au di cui vengono analizzati i profili e l'andamento delle lunghezze d'onda in funzione della probabilità (valori della PSDF normalizzati rispetto al valore massimo).
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Figura 4.4. Illustrazione di immagini SEM con FFT, profili e andamento delle lunghezze d'onda (λ) in funzione della probabilità prese a partire dalla PSDF delle immagini importate in Gwyddion® ed elaborate in MatLab®. In a) sono mostrati i risultati per un'immagine SEM (1000x, 5 kV, 21 pA e horizontal field width (HFW)
207 µm) di un campione con 6 nm di Au; in b) per un'immagine SEM (2500x, 10 kV, 21 pA e HFW 82.9 µm) di un campione con 12 nm di Au; in c) per un'immagine SEM (1000x, 5 kV, 43 pA e HFW 207 µm) di un campione con 40 nm di Au; in d) per un'immagine SEM (1000x, 5 kV, 43 pA e HFW 207 µm) di un campione con 60 nm di Au.
Come mostrato in Figura 4.4 ogni immagine viene calcolata la FFT che indica l'andamento della distribuzione spaziale delle wrinkles. Infatti, come si può notare dalla Figura 4.4a,b,c,d i punti corrispondenti alle frequenze spaziali (nel K-spazio) si distribuiscono in maniera preferenziale su una linea orizzontale passante per il centro, questo a significare che la variabilità dell'immagine è alta se la si attraversa in senso orizzontale. Ne segue che dai profili tracciati orizzontalmente sull'immagine importata
82 in Gwyddion® si possono ricavare le lunghezze d'onda tipiche delle corrugazioni. Inoltre, grazie all'implementazione di algoritmi in MatLab® è stato possibile ricavare in maniera rapida e ripetibile le lunghezze d'onda delle corrugazioni lungo il piano x-y di tutte le immagine SEM relative a ogni tipo di campione.
Figura 4.5. Grafici dell'andamento delle lunghezze d'onda in funzione di diversi spessori di Au. In a) è illustrato
il grafico relativo alle immagini di campioni uniassiali realizzati per questo lavoro di tesi. In b) è illustrato il grafico proposto da M. Khine et al. in cui vengono mostrate le due famiglie di corrugazioni a diversi spessori di Au. La lunghezza d'onda λ viene vista come il rapporto tra ɳ1/3 e h dove ɳ è proporzionale al rapporto tra il modulo di Young della skin e il modulo di Young della foundation (YSKIN / YFOUND)ed h rappresenta l'altezza delle corrugazioni
[76]
Come già evidenziato in precedenza su sistemi simili [76] lo studio ha permesso di apprezzare l’esistenza di due famiglie principali di corrugazioni aventi lunghezze d'onda caratteristiche. Nel corso dell'analisi condotta sono stati considerati due picchi più evidenti della PSDF a cui corrispondono lunghezze d'onda che si ripetono con maggiore probabilità. Dai grafici della PSDF ottimizzati in MatLab® (Appendice D) sono stati ricavati i valori delle lunghezze d'onda corrispondenti ai picchi più evidenti in funzione dello spessore di Au depositato. In Figura 4.5 vengono mostrati i risultati di questa analisi in cui si evidenzia la dipendenza del valore delle periodicità tipiche (λ) all’aumentare dello spessore dello strato di Au in sistemi con bilayer Au/PEDOT:PSS. Ai fini di un utile confronto in Figura 4.5 b) si riporta l’analogo andamento evidenziato in sistemi con solo Au, così come riportato da Khine et al. in un recente lavoro [76]. Dal confronto si può notare che i valori di lunghezze d'onda ottenuti in questo lavoro di tesi sono notevolmente superiori. Dai risultati ottenuti in questa prima fase di caratterizzazione delle corrugazioni non si sono ottenute lunghezze d'onda inferiori al micron, che come già detto in precedenza sono necessarie a fornire stimoli topografici alle cellule, promuovendo così la loro crescita in direzioni ben definite; infatti F. Greco et al. in precedenti studi hanno trovato dei risultati interessanti relativi alla crescita delle cellule muscolari in direzioni ben definite dal pattern fornito dai campioni uniassiali costituiti da un substrato di PolyShrink e 50 nm di PEDOT:PSS [71]. Ne segue che i risultati preliminari, ottenuti da questa fase di caratterizzazione dei campioni, non si sono dimostrati utili per la realizzazione di smart scaffold a causa delle lunghezze d'onda caratteristiche superiori al micron. Ma da come mostrato in
83 Figura 4.5a, dall'analisi dei campioni ottenuti con 6 nm di Au su cui viene depositato PEDOT:PSS con velocità 4000 rpm, si sono ottenuti valori relativi a lunghezze d'onda, corrispondenti al secondo picco più evidente della PSDF (prima famiglia di rughe), di circa 1.5 µm. Ne segue che, tali valori uniti a quanto già noto dalla letteratura hanno permesso di passare ad una seconda analisi dei campioni uniassiali, variando sia gli spessori di Au, in particolare 3 nm e 6 nm, che lo spessore del layer di PEDOT:PSS depositato con velocità di spin coating, rispettivamente di: 4000, 5000 e 6000 rpm per 60 secondi, corrispondenti ad uno spessore depositato di PEDOT:PSS compreso tra 40 e 50 nm. L'analisi delle immagini è stata effettuata su tre immagini SEM prese per ogni tipologia di campione, effettuando il T-test sui dati ottenuti. In Figura 4.6 e in Figura 4.7 sono riportati i valori delle lunghezze d'onda calcolate sia in MatLab®, sia come distanze tra i picchi dei profili presi direttamente sulle immagini. L’analisi permette di confermare quanto mostrato da F. Greco et al., secondo i quali la lunghezza d'onda diminuisce all'aumentare della velocità di spin coating [98]. I risultati ottenuti per 3 nm di Au con spin coating di PEDOT:PSS a tre diverse velocità mostrano:
una corrispondenza tra i dati delle lunghezze d'onda ottenuti dai profili e dall'implementazione degli algoritmi MatLab® (Figura 4.6g);
valori statisticamente non significativi che non lasciano distinguere la differenza tra campioni (Figura 4.6g);
lunghezze d'onda ottenute analizzando 6 picchi più evidenti della PSDF che si avvicinano al micron; infatti un valore tipico della lunghezza d'onda trovato in corrispondenza del picco 6 relativo a campioni con 3 nm di Au e 6000 rpm di PEDOT:PSS è di 0.75 ± 0.01 µm (Figura 4.6h).
I risultati ottenuti per 6 nm di Au con spin coating di PEDOT:PSS a tre diverse velocità mostrano:
una corrispondenza tra i dati delle lunghezze d'onda ottenuti dai profili e dall'implementazione degli algoritmi MatLab® (Figura 4.6g);
valori statisticamente significativi relativi a lunghezze d'onda inferiori al micron (Figura 4.6g);
valori tipici di lunghezze d'onda relative a 6 picchi più evidenti della PSDF: al picco 6 della PSDF corrisponde un valore pari a 0.61 ± 0.06 µm (Figura 4.6h).
Dai risultati ottenuti si può evincere che per le applicazioni proposte i campioni più adatti risultano quelli con 6 nm di Au su cui viene effettuato uno spin coating di PEDOT:PSS a 6000 rpm; infatti questi campioni hanno lunghezze d'onda tipiche minori di un micron, ottimo presupposto per le colture cellulari.
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Figura 4.6. Immagini SEM (5000x, 10 kV) per campioni con 3 nm di Au, profili e dati relativi alle lunghezze d'onda. In a) è riportata un'immagine di un campione con spin coating di 4000 rpm con il profilo illustrato in d); in
b) un campione con spin coating di 5000 rpm con il profilo illustrato in e); in c) un campione con spin coating di 6000 rpm con il profilo f). In g) sono graficati i risultati relativi al confronto tra i profili delle immagini e i dati ricavati dalla PSDF ottimizzata in MatLab®. In h) è mostrato il grafico delle distribuzioni dei primi sei picchi ricavati dall'implementazione degli algoritmi MatLab® mediati su tre immagini prese per ogni tipologia di campione.
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Figura 4.7. Immagini SEM (5000x, 10 kV) per campioni con 6nm di Au, profili e dati relativi alle lunghezze d'onda. In a) è riportata un'immagine di un campione con spin coating a velocità 4000 rpm; in b) un campione con
spin coating a velocità 5000 rpm; in c) un campione con spin coating a velocità 6000 rpm (** p < 0.01, *** p <
0.001). In g) sono graficati i risultati relativi al confronto tra i profili delle immagini e i dati ricavati dalla PSDF ottimizzata in MatLab®. In h) è mostrato il grafico delle distribuzioni dei primi sei picchi ricavati dall'implementazione degli algoritmi MatLab® mediati su tre immagini prese per ogni tipologia di campione.
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4.3.2 Ampiezza delle microcorrugazioni
Scelto il tipo di campione, si è passati all'analisi AFM per valutare le ampiezze tipiche (Amedia) delle corrugazioni dei campioni uniassiali (vedi Figura 3.11). Le altezze sono
state calcolate mediante il codice MatLab® (Appendice D) su tre profili diversi, presi su tre immagini per ogni campione, importate in Gwyddion®. In Tabella 10 sono messi a confronto i valori delle altezze medie calcolate sia direttamente sui profili delle immagini importate in Gwyddion®, sia valutate sui dati importati in MatLab®. In Figura 4.8 sono mostrate le immagini analizzate, i profili e la frequenza relativa delle altezze.
Tabella 10. Valori delle ampiezze medie (Amedia) su tre profili presi per tre immagini diverse dello stesso
campione.
Immagine AGwyddion®) [µm] media (elaborazione in AmediaMatLab®) [µm] (elaborazione in
1 0.8 ± 0.5 0.6 ± 0.5
2 0.8 ± 0.4 0.8 ± 0.5
3 0.8 ± 0.5 0.7 ± 0.5
Nella fase di valutazione delle ampiezze (o altezze), non si è perso l'obiettivo di indagare sulla presenza di dimensioni micro- e nanometriche delle corrugazioni. Grazie ai tool di Gwyddion, è stato possibile ricavare dai profili le ampiezze viste come distanza tra un picco massimo e un picco minimo lungo l'asse y (Figura 4.8). Inoltre, implementando un algoritmo ad hoc in MatLab® (Appendice D) è stato velocizzato il processo dell'analisi delle ampiezze su tutti i profili delle immagini. In più lo stesso algoritmo è stato integrato con un processo di selezione dei dati e di calcolo dei rispettivi valori medi; infatti sono state selezionate ampiezze medie minori di un micron e maggiori di un micron: 0.5 ± 0.3 µm e 1.3 ± 0.3 µm. L'algoritmo permette di graficare gli intervalli dei valori delle ampiezze in funzione della frequenza relativa (Figura 4.8d); il grafico dimostra che le ampiezze minori di 1µm si ripetono con frequenza maggiore.
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Figura 4.8. Analisi AFM (area di scansione 50 x 50 µm2) e i profili di tre immagini corrispondenti allo stesso
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4.4 Valutazione della conducibilità superficiale
La conducibilità degli scaffold scelti per le prove di protein electroadsorption è stata valutata, realizzando elettrodi costituiti da 40 nm di Au (sputtering) di dimensioni 2 mm x 7 mm sulle superfici dei campioni F, B ed U. Per tale prova sono state utilizzate maschere di materiale elastomerico per non danneggiare la superficie dei campioni stessi e quindi ottenere dei risultati attendibili. L'obiettivo di tali prove è stato quello di misurare un valore di resistenza tipico per ogni tipologia di campione. In Tabella 11 sono mostrati i valori tipici di resistenza trovati per ogni tipologia. I risultati ottenuti dimostrano che non c'è una differenza significativa di resistenza tra le tre diverse tipologie di campione, per cui non è possibile stabilire una variabilità tra i campioni stessi. D'altro canto, i risultati ottenuti sono coerenti con la fisica del sistema, infatti la presenza dello strato di Au sotto il PEDOT:PSS permette di considerare il doppio strato Au/PEDOT:PSS come due resistenze in parallelo; ne segue che la presenza di un layer di Au fa diminuire il valore della resistenza di circa tre ordini di grandezza rispetto in base a quanto già noto su campioni senza il layer di Au. Infatti i risultati possono essere confrontati con quanto trovato da F. Greco et al. su campioni F, B ed U costituiti da PolyShrink e PEDOT:PSS [71]. Tali ricercatori, anche se hanno effettuato un tipo di analisi differente, misurando i valori della sheet resistence (Rs), hanno trovato valori dell'ordine dei KOhm/sq variabili per ogni tipologia di campione e per ogni spessore di PEDOT:PSS depositato (all'aumentare dello spessore diminuisce Rs). In particolar modo hanno riscontrato che i campioni biassiali hanno valori di Rs minori rispetto ai flat e agli uniassiali, per effetto dei contatti cortocircuitati generati dalla loro topografia isotropica.
Tabella 11. Valori di resistenza (R) misurati sulla superficie degli scaffold conduttivi. Nel caso degli uniassili
sono stati misurati sia i valori di resistenza in direzione parallela (R||) e sia i valori di resistenza in direzione perpendicolare all'allineamento delle corrugazioni (R⊥).
Campione R (Ohm) F 15.5 ± 3.5 B 15.8 ± 0.3 U R || = 13 ± 1.2 R⊥ = 18.8 ± 4.4
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4.5 Electroadsorption di Fibronectina
La prima validazione del dispositivo è stata effettuata, valutando l' electroadsorption di Fibronectina (Fn) sui tre tipi di campioni F, U, B. La corrente scelta per tale esperimento è stata di +0.0125 mA per 180 secondi. Questo valore di corrente è stato scelto partendo dagli studi di Collazos-Castro et al. sull'elettroadsotbimento di PLL [86]. Le curve potenziale-tempo (E/t) ottenute lavorando in modalità galvanostatica durante le prove con Fn sono riportate in Figura 4.9 per ogni tipo di campione.
Figura 4.9. Screenshot dei valori di tensione (E vs Ag/AgCl) in funzione del tempo (T) e dei valori della corrente I costante nel tempo ottenuti dalle misure galvanostatiche per campioni flat (a), biassiali (b), uniassiali (c).
90 I garfici E/t mostrano l'andamento del potenziale nel tempo a partire dall'istante in cui il circuito viene chiuso. Per tutti i campioni si nota un picco di tensione verso l'alto che indica un'iniziale reazione che avviene al contatto tra il w.e e il substrato di PEDOT:PSS, che si ossida per effetto della corrente positiva fornita al w.e., la quale consente l'elettroadsorbimento di Fn carica negativamente in soluzione. Il plateau successivo al picco indica un assestamento della cella elettrochimica.
I risultati ottenuti dall'analisi fluorometrica sono illustrati in Figura 4.10. Dai risultati in fluorescenza confrontati con la retta di calibrazione, si può dedurre che la quantità di Fn elettroadsorbita sulla superficie esposta degli scaffold bilayer conduttivi utilizzati in questo lavoro di tesi (F, B, U) è di poco inferiore ad 1 µg, valore che rientra nel range della quantità consigliata per l'adesione cellulare.
Figura 4.10. Illustrazione dei risultati dell'analisi fluorimetrica (in alto) a confronto con la retta di calibrazione (in basso) ( * p < 0.05, *** p < 0.001).
Inoltre sono stati valutati i valori di fluorescenza mediante T-test, confrontando tra loro due gruppi di dati relativi a campioni F, B, U. I risultati ottenuti dalla microscopia a
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 1 2,5 5 7,5 10 Fl uo res c e nc e (A .U.) Fibronectin quantity (µg)
91 fluorescenza per la Fn su campioni F, B e U sono illustrati in Figura 4.11, Figura 4.12 e Figura 4.13 . Dai risultati in fluorescenza si può dedurre che:
la quantità di Fn adsorbita nel caso di applicazione di corrente è maggiore di quella adsorbita senza corrente su tutti e tre i tipi di campioni;
quando avviene l' adsorbimento senza corrente, i campioni biassiali presentano una maggiore quantità di proteina adsorbita sulla loro superficie a differenza dei flat e degli uniassiali; questo dimostra che l'adsorbimento di Fn dipende dal tipo di corrugazioni presente in superficie;
dalle immagini in fluorescenza si nota che la Fn tende a ripiegarsi a contatto con la superficie di PEDOT:PSS ossidato; infatti si nota una tendenza della proteina a formare degli agglomerati tondeggianti, questo dovuto principalmente all'ossidazione del PEDOT:PSS che determina una variazione della sua energia superficiale diventando più idrofobico; tali risultati confermano quanto già noto dalla letteratura (Paragrafo 3.5.1 [81]).
Figura 4.11. Immagini prese al microscopio a fluorescenza dell'adsorbimento di Fibronectina su campioni flat a tre diversi ingrandimenti.
92
Figura 4.12. Immagini prese al microscopio a fluorescenza dell'adsorbimento di Fibronectina su campioni biassiali a tre diversi ingrandimenti.
Figura 4.13. Immagini prese al microscopio a fluorescenza dell'adsorbimento di Fibronectina su campioni uniassiali a tre diversi ingrandimenti.
93
4.6 Effetti delle variazioni di corrente sull'electroadsorption
di Poli-D-Lisina
Per la PDL è stato fatto uno studio diverso, utilizzando solo campioni flat e valutando gli effetti di tre diverse correnti sull'adsorbimento proteico. I valori delle correnti scelte sono: -0.00125 mA, -0.0125 mA, -0.125 mA. Le curve E/t rilevate in fase sperimentale sono riportate in Figura 4.14. Le curve E/t in questi esperimenti mostrano un picco verso il basso del potenziale; infatti in questo caso il layer di PEDOT:PSS si riduce a causa di correnti negative che gli vengono fornite dal w.e. Questo fenomeno consente l'elettroadsorbimento di PDL carica positivamente in soluzione.
Figura 4.14. Screenshot delle curve E/t ricavate da campioni flat con: in a) impostazione di una corrente di -0.00125 mA, in b) impostazione di una corrente di -0.0125 mA, in c) impostazione di una corrente di -0.125 mA.
94 I dati quantitativi di fluorescenza ottenuti mediante il lettore di piastre sono stati elaborati per le condizioni "no current" e "current". Come si può notare dai dati ottenuti per diverse correnti, si ottiene un picco massimo corrispondente alla corrente utilizzata per le prove con la Fn. In più, confrontando i valori di fluorescenza ottenuti con la curva di calibrazione (Figura 4.15) possiamo dedurre che la quantità di proteina elettroadsorbita è inferiore ad 1 µg, valore che rientra nel range consigliato per le colture cellulari. Sono state effettuate anche delle valutazioni dei valori di fluorescenza medi, sia senza applicazione di corrente e sia con applicazione di tre diverse correnti. Le misure sono state effettuate su tre campioni per ogni tipo di condizione ed è stata valutata la significatività statistica con il T-test. Le immagini in fluorescenza sono state ricavate a tre diversi ingrandimenti 4x, 10x, 20x e sono illustrate in Figura 4.17, Figura 4.18, Figura 4.19 e in Figura 4.20. Dalle immagini ottenute in fluorescenza si può dedurre che:
la PDL si adsorbe maggiormente in superficie (valori di fluorescenza maggiori rispetto alla Fn), non formando agglomerati molecolari rispetto alla Fn, questo perchè il PEDOT:PSS in questo caso si riduce e quindi non determina degli effetti particolari sulla struttura molecolare della proteina stessa;
il valore della corrente ottimale per il massimo elettroadsorbomento della PDL su campioni flat è di -0.0125 mA come noto dalla letteratura [86], Infatti a tale valore di corrente è stato trovato un picco massimo del valore di fluorescenza.
Figura 4.15. Curva di calibrazione della PDL.
0 50000 100000 150000 200000 250000 300000 350000 400000 0 2 4 6 8 10 F luo res ce n ce ( A .U.) PDL quantity (µg)
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Figura 4.16. Istogramma dei valori di fluorescenza per campioni su cui è stata adsorbita PDL senza applicare corrente e campioni a cui sono state applicate tre correnti diverse (* p < 0.05).
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