EOZINOFILŲ β GRANDINĖS CITOKINŲ RECEPTORIŲ IR INTEGRINŲ RAIŠKA BEI BRONCHŲ EPITELIO PAŽAIDOS ŽYMENŲ REIKŠMĖ SERGANT 2-OJO TIPO ASTMA

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

Virginija Kalinauskaitė-Žukauskė

EOZINOFILŲ β GRANDINĖS CITOKINŲ

RECEPTORIŲ IR INTEGRINŲ RAIŠKA

BEI BRONCHŲ EPITELIO PAŽAIDOS

ŽYMENŲ REIKŠMĖ SERGANT

2-OJO TIPO ASTMA

Medicinos ir sveikatos mokslai, medicina (M 001)

Disertacija rengta 2014–2019 metais Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Pulmonologijos klinikoje.

Mokslinis vadovas

prof. dr. Kęstutis Malakauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).

Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:

Pirmininkė

prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001).

Nariai:

prof. dr. Vilmantė Borutaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, gamtos mokslai, biologija – N 010);

prof. dr. Rimantas Daugelavičius (Vytauto Didžiojo universitetas, gamtos mokslai, biochemija – N 004);

prof. dr. Laura Malinauskienė (Vilniaus universitetas, medicinos ir sveikatos mokslai, medicina – M 001);

prof. dr. Marc Humbert (Pietų Paryžiaus universitetas, medicinos ir svei-katos mokslai, medicina – M 001).

Disertacija ginama viešajame Medicinos mokslo krypties tarybos posėdyje 2020 m. vasario 20 d. 12 val. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligo-ninės Kauno klinikų Didžiojoje auditorijoje.

LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES

Virginija Kalinauskaitė-Žukauskė

EXPRESSION OF EOSINOPHIL β

CHAIN-SIGNALING CYTOKINES

RECEPTORS AND INTEGRINS,

THE VALUE OF BRONCHIAL

EPITHELIAL INJURY MARKERS

IN TYPE 2 ASTHMA

Medicine (M 001)

The Dissertation has been prepared at the Department of Pulmonology of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2014–2019.

Scientific Supervisor

Prof. Dr. Kęstutis Malakauskas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).

The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences: Chairperson

Prof. Habil. Dr. Vaiva Lesauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).

Members:

Prof. Dr. Vilmantė Borutaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Natural Sciences, Biology – N 010);

Prof. Dr. Rimantas Daugelavičius (Vytautas Magnus University, Natural Sciences, Biochemistry – N 004);

Prof. Dr. Laura Malinauskienė (Vilnius University, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001);

Prof. Dr. Marc Humbert (South Paris University, Medical and Health Sciences, Medicine – M 001).

Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on the 20th of February, 2020 at 12.00 PM in the Large Auditorium at the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno klinikos.

5

TURINYS

1.1. Astmos samprata, etiologija ir epidemiologija ... 14

1.2. Astmos fenotipai ir endotipai ... 14

1.3. Astmos sunkumas, klinikinė eiga ... 16

1.4. 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimas ... 17

1.4.1. Eozinofilopoetinai ir jų β gradinės receptoriai ... 19

1.4.2. Eozinofilų integrinai ... 21

1.4.3. Eozinofilų biologinė reikšmė ... 23

1.4.4. Eozinofilinio uždegimo slopinimas skiriant biologinę terapiją ... 25

1.5. Bronchų epitelio įtaka astmos patogenezei ... 27

1.6. 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimo biologiniai žymenys ... 29

2. METODAI ... 32

2.1. Tiriamųjų atrankos kriterijai... 32

2.2. Tyrimo eiga ... 33

2.3. Tyrimų metodai ... 35

2.3.1. Spirometrija ... 35

2.3.2. Bronchų dilatacinis mėginys ... 35

2.3.3. Bronchų provokacinis mėginys metacholinu ... 35

2.3.4. Bronchų provokacinis mėginys alergenu ... 36

2.3.5. FeNO matavimas iškvepiamajame ore ... 36

2.3.6. Odos dūrio mėginiai ... 37

2.3.7. Periferinio kraujo eozinofilų išskyrimas ... 37

2.3.8. Eozinofilų β grandinės citokinų receptorių ir išorinės membranos integrinų raiškos matavimas ... 38

2.3.9. Biologiškai aktyvių medžiagų koncentracijų nustatymas kraujo serume ... 39

2.4. Statistinė analizė ... 40

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 41

3.1. Eozinofilų β grandinės citokinų receptorių ir integrinų raiška ... 41

3.1.1. IL-3, IL-5, GM-CSF receptorių raiška eozinofiluose ir šių citokinų koncentracijos kraujo serume ... 42

6

3.1.3. Periostino, eotaksino ir CCL17 koncentracijos kraujo

serume ... 47

3.2. Bronchų epitelio pažaidos žymenys ir jų reikšmė ... 50

3.2.1. IL-25, IL-33, TSLP ir ezrino koncentracijų pokyčiai kraujo serume po bronchų provokacinio mėginio Dermatophagoides pteronyssinus alergenu ... 53

3.2.2. IL-4/IL-13 signalinio kelio aktyvumas po bronchų provokacinio mėginio alergenu ... 57

3.2.3. IL-25 ir TSLP koncentracijų pokyčiai kraujo serume slopinant eozinofilinį uždegimą ... 59

IŠVADOS ... 64

PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 65

SUMMARY ... 66

LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 103

PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 121

Straipsniai, kuriuose paskelbti tyrimo rezultatai ... 121

Mokslinės konferencijos, kuriose paskelbti tyrimo rezultatai ... 122

PRIEDAI ... 152

CURRICULUM VITAE ... 155

7

SANTRUMPOS

ATS – (angl. American Thoracic Society) Amerikos krūtinės draugija b. d. – būtinojo dydžio

CD − (angl. cluster of differentiation) diferenciacijos grupė CCL11 – chemokino C-C motyvo ligandas 11

CCL17 – chemokino C-C motyvo ligandas 17

CRTH2 – (angl. chemoattractant receptor-homologous molecule expressed

on Th2 cells) chemoatraktanto receptoriaus homologinė molekulė

ant antrojo tipo T limfocitų pagalbininkų DL – dendritinės ląstelės

DNR – deoksiribonukleorūgštis

D. pteronyssinus – Dermatophagoides pteronyssinus D. farinae – Dermatophagoides farinae

EDTA – etileno-diamino-tetra-acto rūgštis

ELISA – (angl. enzyme-linked immunosorbent assay) imunosorbentinė analizė

ERS – (angl. European Respiratory Society) Europos respiratologų draugija

FeNO – (angl. fractional exhaled nitric oxide) azoto monoksido frakcija

iškvepiamajame ore

FEV1 – (angl. forced expiratory volume in 1 second) forsuoto iškvėpimo

tūris per pirmąją sekundę

FVC – (angl. forced vital capacity) forsuota gyvybinė talpa

GATA-3 – (angl. GATA binding protein 3) transkripcijos veiksnį GATA surišantis baltymas 3

GINA – (angl. Global Initiative for Asthma) Pasaulinė astmos iniciatyva GM-CSF – (angl. granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)

granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojantysis veiksnys HEP – (angl. histamine equivalent potency) histamino ekvivalentinis

stiprumas

ICAM-1 – (angl. intercellular adhesion molecule-1) tarpląstelinė adhezijos molekulė-1

Ig – imunoglobulinas

IGK – įkvepiamieji gliukokortikoidai

ILC2s – (angl. type 2 innate lymphoid cells) įgimtos antrojo tipo limfoidinės ląstelės

IL – interleukinas

8 IL-5R – interleukino 5 receptoriai IVBA – ilgo veikimo β2 agonistai

IVMA – ilgo veikimo muskarino receptorių antagonistai KMI – kūno masės indeksas

LLD – (angl. lower limit of detection) apatinė aptikimo riba LSMUL KK – Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninė Kauno

klinikos

mRNR – matricinė ribonukleorūgštis N – tiriamųjų skaičius

ODM – odos dūrio mėginiai p – patikimumo lygmuo

PBS – (angl. phosphate-buffered saline) fosfatinis buferio druskų tirpalas

PD20A – provokacinė alergeno dozė, nulėmianti FEV1 sumažėjimą

20 proc. nuo pradinės vertės

PD20M – provokacinė metacholino dozė, nulemianti FEV1 sumažėjimą

20 proc. nuo pradinės vertės PGD2 – prostaglandinas D2

PGR – polimerazės grandininė reakcija PSO – Pasaulio sveikatos organizacija pvz. – pavyzdžiui

RNR – ribonukleorūgštis

SNEA – sunki nealerginė eozinofilinė astma

sin. – sinonimas

ST2 – (angl. serum stimulation-2) serumo stimuliatoriaus 2 receptorius Th0 – (angl. naïve helper T cells) naivieji T limfocitai pagalbininkai Th2 – (angl. T helper cells type 2) antrojo tipo T limfocitai

pagalbininkai

TSLP – (angl. thymic stromal lymphopoietin) užkrūčio liaukos stromos limfopoetinas

TVBA – trumpo veikimo β2-agonistai

VEGF – (angl. vascular endothelial growth factor) kraujagyslių endotelio augimo veiksnys

VCAM-1 – (angl. vascular cell adhesion molecule-1) kraujagyslinė adhezijos molekulė-1

9

ĮVADAS

Astma yra lėtinė uždegiminė, dažniausiai visą gyvenimą trunkanti kvė-pavimo takų liga, kuriai būdinga epizodiniai arba nuolatiniai kvėkvė-pavimo simptomai, kintama bronchų obstrukcija, klinikinių požymių ir patogenezės heterogeniškumas. Sergamumas nuolat didėja, kaip ir su tuo susijusi ekono-minė našta [1–3]. Per pastaruosius 35 metus astma pasiekė epidemijos lygį [4]. Vyksta nuolatiniai astmos patogenezės tyrimai, siekiant geriau suprasti ir nustatyti būdus, kaip veiksmingiau ją valdyti.

Svarbiausia astmos patogenezės grandis – lėtinis kvėpavimo takų uždegi-mas [5]. Dažniausiai nustatouždegi-mas 2-ojo tipo uždegimo atsakas [6], kuris tiks-liau apibrėžiamas kaip 2-ojo tipo T limfocitų pagalbininkų (angl. T helper

cells type 2, Th2) uždegimas, turintis ryškią eozinofiliją [7]. 2-ojo tipo

uždegi-mas būdingas pacientams, sergantiems alergine ir eozinofiline astma, kurios sudaro iki šiol identifikuotų astmos fenotipų ir endotipų pagrindą [8]. Pagal vyraujantį uždegimo modelį, vartojami „2-ojo tipo“ ir „eozinofilinės astmos“ terminai. Astma su vyraujančiu eozinofiliniu uždegimu turi intensyvesnius ligos simptomus, būna dažnesni ligos paūmėjimai, blogesnis atsakas į skiria-mus įkvepiamuosius gliukokortikoidus (IGK), o ligos eiga dažniausiai būna sunki [9, 10–2]. Ligos sunkumas kinta net ir tarp tą patį fenotipą arba endotipą turinčių asmenų [9]. Todėl, nors ir žinoma eozinofilų reikšmė astmos pato-genezei, vis dar nėra aišku, kas nulemia minėtus skirtumus; kokie mecha-nizmai, o gal pačių eozinofilų struktūros ypatumai gali lemti kvėpavimo takų uždegimo intensyvumą.

Eozinofilų brendimas, aktyvinimas ir telkimasis plaučiuose lemiamas trijų pagrindinių citokinų, dar vadinamų eozinofilopoetinais – interleukino (IL) 3, IL-5 ir granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančiojo veiksnio (angl.

granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) – bei yra

susi-jęs su integrinų (ypač pagrindinių – α4β1, αMβ2), esančių ant eozinofilų pa-viršiaus, aktyvinimu [13–19]. Pastarieji reguliuoja eozinofilų migravimą iš bronchų kraujotakos į bronchus ir jų spindį. Integrinų funkcija sudėtinga, kadangi kiekvienas jų gali būti keliose konformacijos būsenose, turėti skirtingą raiškos lygį. Nors nuolat atliekami tyrimai, vis dar trūksta žinių apie galbūt skirtingą minėtų citokinų receptorių ir integrinų raišką eozinofiluose bei sąsają su eozinofilinio uždegimo intensyvumu.

Pastaraisiais metais didėja susidomėjimas bronchų epitelio svarba astmos patogenezei. Bronchai su aplinka tiesiogiai kontaktuoja per įkvepiamą orą, o jų epitelis yra pirmoji apsauga, veikianti kaip fizinis ir cheminis barjeras [20]. Daromos prielaidos, kad būtent dėl epitelio pažaidos, nulemiančios jo

dis-10

funkciją, keičiasi epitelio citokinų, pvz., užkrūčio liaukos stromos limfopoe-tino (angl. thymic stromal lymphopoietin, TSLP), IL-25, IL-33 ir citovilino ezrino, gamyba bei išsiskyrimas. Daugėja duomenų, kad tai gali būti vienas iš esminių kvėpavimo takų uždegimo atsiradimo, jo palaikymo ir sisteminio organizmo atsako etapų [7, 21, 22]. Norint išsiaiškinti, ar eozinofilinio užde-gimo aktyvumas turi įtakos šių biologiškai aktyvių medžiagų gamybai, rei-kalingi detalesni tyrimai, atliekami ir eozinofilinio uždegimo slopinimo metu.

Ne mažiau svarbu ir 2-ojo tipo uždegimo biologiniai žymenys. Šiuo metu patvirtinti yra penki: periferinio kraujo ir skreplių eozinofilų kiekis, azoto monoksido frakcija iškvepiamajame ore (angl. fraxional exhaled nitric oxide, FeNO), imunoglobulino (Ig) E ir serumo periostino koncentracija [23]. Daugelis jų nėra specifiški, todėl būtinos papildomos priemonės, galinčios padėti anksčiau identifikuoti 2-ojo tipo astmą, vertinti uždegimo aktyvumą gydymo metu. Tokios priemonės galėtų buti eozinofilų brendimo, aktyvinimo ir telkimosi procesuose aktyviai dalyvaujantys citokinai, pvz., IL-3, IL-5, GM-CSF (alerginės astmos (AA) atveju) ir pagrindinio IL-4/IL-13 signalinio kelio citokinai, aktyvintų eozinofilų telkimąsi į audinius (chemotaksį) regu-liuojantys chemokinai – chemokino C-C motyvo ligandas 11 (CCL11, eotak-sinas), chemokino C-C motyvo ligandas 17 (CCL17); su bronchų epitelio pažaida susiję IL-25, IL-33, TSLP, ezrinas. Visos šios biologiškai aktyvios medžiagos aktyviai dalyvauja formuojant 2-ojo tipo uždegiminį atsaką.

Taigi, nors eozinofilų reikšmė astmos patogenezei plačiai pripažįstama, paviršiniai eozinofilų komponentai, galbūt lemiantys eozinofilų telkimąsi kvėpavimo takuose, o su tuo ir susijusį 2-ojo tipo uždegimo intensyvumą, nėra visiškai ištirti. Per mažai įvertinta ir bronchų epitelio citokinų įtaka suke-liant, skatinant ir palaikant 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimą. Taip pat trūksta papildomų biologinių žymenų, galinčių prisidėti vertinant šių procesų intensyvumą diagnozuojant ir gydant 2-ojo tipo astmą bei prognozuojant jos eigą.

Darbo tikslas

Ištirti eozinofilų β grandinės citokinų receptorių ir integrinų raišką bei bronchų epitelio pažaidos žymenų reikšmę sergant 2-ojo tipo astma.

Uždaviniai

1. Įvertinti sunkia nealergine eozinofiline astma (SNEA) ir nesunkia alergine astma (AA) sergančių asmenų eozinofilų β grandinės citokinų interleukino (IL) 3, IL-5, granulocitų-makrofagų kolonijas stimuliuojančiojo veiksnio (GM-CSF) receptorių raišką ir 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimo

pro-11

cesuose dalyvaujančių biologiškai aktyvių medžiagų eotaksino, chemo-kino C-C motyvo ligando 17 (CCL17), periostino koncentracijas kraujo serume.

2. Ištirti eozinofilų integrinų subvienetų α4, αM, β1, β2 raišką sergant SNEA ir nesunkia AA.

3. Nustatyti AA sergančių asmenų bronchų epitelio pažaidos žymenų IL-25, IL-33, užkrūčio liaukos stromos limfopoetino (TSLP), ezrino koncentra-cijų kraujo serume bei IL-4/IL-13 signalinio kelio aktyvumo pokyčius po bronchų provokacinio mėginio Dermatophagoides pteronyssinus alergenu.

4. Įvertinti SNEA sergančių asmenų bronchų epitelio pažaidos žymenų IL-25 ir TSLP koncentracijų kraujo serume pokyčius eozinofilinį uždegimą slopinant humanizuotu monokloniniu antikūnu prieš IL-5 mepolizumabu. Tyrimo naujumas

Eozinofilų brendimui, aktyvinimui ir išgyvenamumui svarbiausiais lai-komi β grandinės receptorių citokinai IL-3, IL-5 ir GM-CSF [13, 24, 25]. Per didelė šių citokinų arba jų receptorių raiška gali sukelti pernelyg intensyvų arba netipišką signalo perdavimą, keisti ligos eigą [26]. Sergant SNEA pastebimas ryškus eozinofilų skaičiaus padidėjimas audiniuose ir kraujyje, tačiau trūksta duomenų, ar taip yra dėl šių trijų pagrindinių citokinų kiekybi-nių verčių, ar dėl eozinofilų receptorių raiškos pokyčių. Iki šiol atliktų tyrimų duomenimis, IL-3, IL-5 ir GM-CSF kryžmiškai reguliuoja (angl.

cross-regu-late, t. y. kai vieno signalinio kelio produktas veikia kaip slopiklis (sin.

inhibitorius) arba aktyviklis kitame signaliniame kelyje) atitinkamų citokinų α receptorių raišką sveikų žmonių eozinofiluose [27, 28]. Tačiau sergant astma, duomenys gali būti kitokie dėl sudėtingos ligos patogenezės, esant lėtiniam uždegimui. Trūksta duomenų apie sergančių SNEA, AA ir sveikų asmenų minėtų citokinų ir jų receptorių raiškos eozinofiluose palyginamumą.

Svarbus stabilesnės ir stipresnės eozinofilų adhezijos prie ląstelių ligandų arba užląstelinio užpildo veiksnys, skatinantis ląstelių aktyvinimą ir tuo pačiu 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimą, yra eozinofilų integrinų raiška [17, 29]. Sergant astma svarbiausi yra α4β1 ir αMβ2 [15, 17, 30]. Publikuotas tyrimas, kurio metu padidėjusi šių integrinų raiška nustatyta sergant nesunkia, IGK dar negydyta AA [31–33] ir sieta su intensyvesniu eozinofiliniu kvėpavimo takų uždegimu. Nors yra duomenų apie eozinofilų integrinų raišką sergant AA, tačiau neaišku, kokia jų raiška sergant SNEA [34].

Naujuose astmos patogenezės tyrimuose dėmesys telkiamas į bronchų epitelio pažaidos ir disfunkcijos svarbą. Keliama hipotezė, kad būtent dėl sutrikusios jo funkcijos po kontakto su išoriniu dirgikliu išsiskiria uždegimo tarpininkai (sin. uždegimo mediatoriai). Jie sukelia uždegimą ir pradeda

12

tolesnę imuninę grandinę, palaiko lėtinį kvėpavimo takų uždegimą, nule-miantį kvėpavimo takų struktūrinius pokyčius (remodeliavimo procesus). Ir priešingai – epitelis gali būti taikinys, siekiant užkirsti kelią arba lėtinti kvėpa-vimo takų remodeliakvėpa-vimo procesus [21]. Remiantis iki šiol atliktų tyrimų duomenimis, sergant astma kraujo serume nustatomos padidėjusios citokinų IL-25, IL-33, TSLP [22, 35–413] bei citovilino ezrino [21, 44, 45] koncent-racijos, palyginti su sveikais asmenimis. Daroma prielaida, kad minėtos biologiškai aktyvios medžiagos išsiskiria po kontakto su išoriniu dirgikliu pakitus bronchų epitelio vientisumui ir atliekamoms funkcijoms. Tačiau duomenų apie sudėtinį epitelio gaminamų ir išskiriamų IL-25, IL-33, TSLP, ezrino koncentracijų vertinimą, jų įtaką sukelti / sustiprinti imuninių procesų grandinę bei galimas sąsajas su eozinofilinio uždegimo aktyvumu – stinga. Ypač trūksta duomenų apie patogenetinius procesus, vykstančius po tiesio-ginio alergeno poveikio in vivo. Pastebėta, kad po alergeno poveikio bronchų epitelyje ir pogleivyje didėja IL-25, IL-33 ir TSLP imunoreaktyvumas. Nustatyta jo sąsaja su vėlyvosios fazės bronchų obstrukcijos laipsniu. Tai tarsi patvirtina, kad minėti citokinai ir ezrinas gali būti potencialūs nauji taikiniai, siekiant slopinti kvėpavimo takų uždegimą, kilusį po alergeno poveikio [46]. Disertacinio darbo metu atlikti bronchų provokaciniai mėginiai

D. pteronyssinus alergenu – dažniausiai laikomu svarbiausiu antigeniniu

požiūriu [47], imituojant ūminį AA epizodą bei vertinant ne tik epitelio gaminamų biologiškai aktyvių medžiagų koncentracijas, bet ir pagrindinio IL-4/IL-13 signalinio kelio citokinų koncentracijų serume pokyčius sergant nesunkia, IGK negydyta AA. Biologinę terapiją pradėjus taikyti sunkiai eozi-nofilinei astmai gydyti ir stebint veiksmingą poveikį, reikia detaliau įvertinti, kaip keičiasi bronchų epitelio citokinų koncentracijos slopinant eozinofilinį uždegimą. Disertacinio darbo metu taip pat vertintas IL-25 ir TSLP koncent-racijų pokytis prieš gydymą ir po pirmosios antikūno prieš IL-5 – mepoli-zumabo dozės. Panašaus pobūdžio atliktų tyrimų nepavyko rasti.

Siekiant patogenezės tyrimų duomenis susieti su klinikine praktika, nu-matant 2-ojo tipo astmos eigą, parenkant tinkamiausią gydymą, reikalingi ir nauji biologiniai žymenys. Šiuo metu naudojama – kraujo ir skreplių eozino-filija, FeNO, IgE, serumo periostino koncentracija. Daugelis jų turi apri-bojimų (plačiau apie juos 1.6 skyriuje „2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimo biologiniai žymenys“) [23, 48–50]. Todėl esamus biologinius žymenis papil-džius potencialiai naujais, atspindinčiais 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimo (ypač eozinofilinio komponento) intensyvumą, galima turėti didesnę sudė-tinio biožymenų vertinimo prognozinę vertę ligos eigai, taip pat numatyti ligos paūmėjimus, vertinti gydymo atsaką. Trūksta duomenų apie eozinofilo-poetinų (IL-3, IL-5, GM-CSF), pagrindinio AA signalinio kelio citokinų

13

(IL-4 ir IL-13), epitelio gaminamų citokinų (IL-25, IL-33, TSLP) bei cito-vilino ezrino kaip biologinių žymenų reikšmę, apibrėžiant 2-ojo tipo užde-gimo intensyvumą. Yra duomenų, kad periostinas, būdamas įvairių eozinofilų integrinų ligandu, geba specifiškai pritraukti IL-5, IL-3 ar GM-CSF suakty-vintus eozinofilus. Tam labai svarbus aMβ2 integrinas [51]. Periostinas, būdamas aMβ2 ligandas, gali veikti kaip eozinofilų aktyviklis, tačiau daug svarbesnė jo funkcija moduliuojant eozinofilų migraciją, chemoatrakciją ir adheziją [52]. Didėja poreikis naudoti ir 2-ojo tipo uždegimo biožymenis, kontroliuojančius aktyvintų eozinofilų telkimąsi iš kraujo į audinius, pvz., CCL11 (eotaksino), CCL17. Buvo atliktas tyrimas, įvardijantis eotaksiną kaip galimą astmos diagnostikos biožymenį. Trisdešimties skirtingų tyrimų duo-menų analizė atskleidė, kad eotaksino koncentracija skrepliuose yra po-tencialus astmos sunkumo vertinimo biožymuo [53]. Th2 sukeliamas uždegi-mas yra susijęs su specifine chemokinų, pvz., CCL17 baltymo, raiška plaučių audinio ląstelėse, todėl siekiant aktyvinti specifinių Th2 ląstelių telkimąsi ir aktyvinimą, šie serumo chemokinai gali veikti kaip specifiniai ligos sunkumo biologiniai žymenys. Tam tikrų tyrimų metu nustatytos reikšmingos kore-liacijos tarp CCL17 ir įvairių ligų sunkumo [54–56] – pabrėžta jo panaudo-jimo galimybė sergant alerginėmis ligomis [57], tačiau nėra duomenų apie nealerginę astmą su ryškia eozinofilija. Tikslinga ištirti minėtų biologiškai aktyvių medžiagų koncentracijas esant sunkiai ir nesunkiai bei skirtingo fenotipo (alerginė / nealerginė) astmai.

14

1. LITERATŪROS APŽVALGA

Astma yra lėtinė, dažniausiai visą gyvenimą trunkanti uždegiminė kvė-pavimo takų liga, sukelianti epizodinius arba nuolatinius klinikinius simp-tomus, pvz., švokštimą, cypimą krūtinėje, dusulį, kosulį su arba be skreplia-vimo, veržimo jausmą krūtinėje. Astmai būdinga lengvai sukeliamas bronchų spazmas, kintama bronchų obstrukcija ir jos grįžtamumas.

Tiksli astmos etiologija vis dar nėra žinoma. Manoma, kad daugiausia įtakos jai atsirasti turi su oru įkvepiamos aplinkos dalelės, alergenai ir ge-netika [58, 59]. Galimi priežastiniai veiksniai – nutukimas, persirgta sunki respiracinė infekcija, neadekvati organizmo reakcija į vartojamus nesteroi-dinius vaistus nuo uždegimo, ypač aspiriną, nuolatinis oro dalelių, paten-kančių dirbant konkrečius darbus, poveikis. Išskiriama ~ 15 proc. suaugusiųjų astmos atvejų, kurie susiję su darbu [58, 60].

Pastebėta, kad vyrai ir moterys astma serga ne vienodai dažnai. Vaikystėje astma dažniau serga berniukai, sulaukus 20–40 metų – reikšmingo skirtumo tarp lyčių nelieka, o po 4-ojo dešimtmečio astma dažniau suserga moterys, todėl astmos atsiradimas siejamas ir su lytinių hormonų pusiausvyros sutri-kimu [61–63].

Pasaulio sveikatos organizacijos (PSO) duomenimis, astma serga apie 339 milijonai žmonių visame pasaulyje ir kasdien ši liga nusineša apie 1000 gy-vybių [5]. Ypač didelis paplitimas nustatomas besivystančiose šalyse ir gau-siai apgyvendintose vietovėse. Pastarųjų 35 metų duomenimis, astmos pa-plitimas įgauna epidemijos mastą [4]. Manoma, kad įtakos turi intensyvi urbanizacija, sumažėjęs žmonių aktyvumas, eismo arba pramonės sukelta oro tarša, padidėjęs alergenų poveikis [3].

1.2. Astmos fenotipai ir endotipai

Vykstant intensyviems astmos tyrimams, sąvoką „ligos heterogenišku-mas“ vis labiau keičia sąvokos „fenotipas“, „endotipas“. Pagal etiologinį veiksnį, ligos atsiradimo laiką, plaučių funkciją, atsaką į skiriamą gydymą, vyraujantį patogenetinį mechanizmą, astma sergantys asmenys skirstomi į grupes – fenotipus, endotipus. Ilgą laiką vartota tik sąvoka „fenotipas“, api-brėžianti tam tikrą bendrą požymį turinčių astma sergančių asmenų grupes, nesvarbu, ar tai būtų priežastinis, klinikinis arba patogenetinis veiksnys. Vis geriau suprantant skirtingus astmos patogenezės mechanizmus, astma ser-gantys asmenys pagal vyraujantį patogenetinį mechanizmą pradėti skirstyti į

15

endotipus. Astmos fenotipų ir endotipų gausa klaidina, tačiau kiekvienas jų leidžia geriau suprasti, su kokio pobūdžio astma susiduriama. Vis dar nėra vieno skirstymo, kuris reikšmingai palengvintų ligos sampratą, leistų leng-viau prognozuoti ligos eigą ir parinkti optimaliausią gydymą.

Pirmiausia astma pradėta skirstyti į alerginės ir nealerginės kilmės feno-tipus [64]. Vėliau fenotipų daugėjo ir pagal išskiriamą etiologinį veiksnį šiuo metu astma skirstoma į alerginę, nealerginę, aspirininę, su nutukimu arba fiziniu krūviu susijusią astmą; pagal ligos pradžią – ankstyvą, vaikystėje pra-sidėjusią astmą, ir vėlyvos pradžios, sulaukus suaugusiojo amžiaus prasidė-jusią astmą; pagal plaučių funciją išskiriamas stabilios bronchų obstrukcijos astmos fenotipas; įvardijamas ir dažnų astmos paūmėjimų fenotipas, taip pat mažą atsaką į IGK turinčios astmos fenotipas [6, 7, 9, 64–71]. 2019 metų Pasaulinės astmos iniciatyvos (angl. Global Initiative for Asthma, GINA) rekomendacijose išskiriami pagrindiniai penki astmos fenotipai: alerginė, nealerginė, vėlyvos pradžios, su nutukimu susijusi ir astma, turinti stabilią bronchų obstrukciją [5].

Juo daugiau atliekama astmos patogenezės tyrimų, juo labiau tampa aišku, kad astma yra sudėtinga liga. Ją sudaro daugybė ligos variantų, turinčių skir-tingus vyraujančius patofiziologinius mechanizmus. Iš pradžių pagal patoge-netinį mechanizmą astma pradėta skirstyti į ne Th2 ir Th2 astmą, o Th2 astma išskirta į intensyvaus Th2 (angl. Th2-high) ir neintensyvaus Th2 uždegimo (angl. Th2-low) astmą [6, 7, 9, 65–70]. Pastebėjus skirtingą ligos atsaką į gy-dymą, skirtingą ligos eigą, atsiradus daugiau žinių apie skirtingus patoge-nezės mechanizmus, astma pradėta skirstyti į eozinofilinę (dar vadinamą 2-ojo tipo) ir neeozinofilinę (neutrofilinę, mišrią granulocitinę ir paucigranu-locitinę). Eozinofilinė astma įprastai yra vėlyvos pradžios, dažniausiai susi-jusi su lėtiniu rinosinusitu, nosies polipais, dažniausiai yra sunki ir nea-lerginės kilmės [63]. Šio fenotipo astma sergantiems asmenims, nors skiria-mas gydyskiria-mas IGK, tiek kraujyje, tiek plaučių audinyje nuolat išlieka eozi-nofilija, stebimas dažnas sisteminių gliukokortikoidų poreikis dėl per mažai kontroliuojamų ar nekontroliuojamų ligos simptomų [72–75].

Įdomu, kad esant vienam vyraujančiam patogenetiniam mechanizmui, ga-limi keli skirtingi ligos fenotipai [76]. Visus klinikinius ligos požymius nu-lemia imuniniai žmogaus organizmo procesai, todėl mokslo požiūriu skirs-tymas pagal bendrą patogenetinį mechanizmą yra svarbus [68]. Siekiant veiksmingiau gydyti astmą, silpninti juntamus simptomus, lengvinti ligos eigą, pagrindinis gydymo taikinys turėtų būti lėtinio kvėpavimo takų užde-gimo slopinimas, pritaikytas kiekvienam pacientui pagal vyraujančias pato-genetines grandis, pvz., humanizuoti monoklininiai antikūnai prieš IgE, IL-5 ar IL-5 receptorius (IL-5R).

16

1.3. Astmos sunkumas, klinikinė eiga

Astma gali būti lengva, vidutinė ir sunki. Skirstoma retrospektyviai – pagal taikomo gydymo intensyvumą, kai pavyksta pasiekti ligos kontrolę ir užkirsti kelią ligos paūmėjimams. Naujai diagnozuojant astmą, sunkumas vertinamas tik preliminariai – pagal ligos diagnozavimo metu esančių simptomų inten-syvumą. Lengva astma laikoma, kai astmos kontrolę pavyksta pasiekti ski-riant simptomus slopinančių vaistų su ar be mažos IGK dozės, arba ligos nu-statymo metu simptomai lengvi, epizodiniai. Vidutinio sunkumo astma – kai ligos kontrolę pavyksta pasiekti skiriant simptomus slopinančių vaistų ir vidutinę IGK dozę (dažnai su ilgai veikiančiu bronchus plečiančiuoju vaistu), arba ligos nustatymo metu simptomai yra ryškūs, neretai nustatoma ir bronchų obstrukcija. Sunki astma – tai astma, kuriai gydyti per praėjusius metus buvo reikalinga didelė IGK dozė kartu su ilgo veikimo β2 agonistu arba leukotrienų receptorių antagonistu, arba teofilinu, arba per praėjusius metus ≥ 50 proc. laiko buvo vartojami sisteminiai gliukokortikoidai tam, kad astma būtų kontroliuojama, arba, nors ir skiriant adekvatų gydymą, astma išlieka nekontroliuojama. Jei pirmieji nediagnozuotos astmos simptomai pasireiškia iškart paūmėjimu ir būtinas stacionarinis gydymas, tai taip pat gali būti laikoma sunkios astmos požymiu.

Didžiausias iššūkis – gydyti sunkią astmą, sudarančią 5–10 proc. visų astma sergančių žmonių populiacijos [77–79]. Reikšmingos ir sunkiai astmai gydyti skiriamos lėšos [2, 77, 80–83]. Bene daugiausia problemų kelia sunki eozinofilinė astma, kurios simptomus sunku kontroliuoti, stebimi dažni ir sunkūs ligos paūmėjimai, nuolat blogėjanti plaučių funkcija ir gyvenimo kokybė, atsparumas gydymui hormonais, greitai atsirandantys struktūriniai kvėpavimo takų pokyčiai. Būdinga eozinofilija. Ji, esant šiam fenotipui, labiau apibrėžiama pagal skreplių eozinofilų kiekį – ne mažiau kaip 2–3 proc. ląstelinės sudėties. Kraujo eozinofilija yra vienas iš papildomų eozinofilinio uždegimo vertinimo žymenų (kartu su FeNO, IgE, periostinu) ir įprastai vertinama pagal biologinės terapijos vaistų skyrimo indikacijas – apatinė riba svyruoja nuo 0,15–0,30 × 109_/l.

Astmos eiga dažnai yra banguojanti – simptomų intensyvumas gali būti matuojamas kartais per dieną arba kartais per savaitę–mėnesį [5]; kinta netgi simptomų sunkumas – nuo lengvai toleruojamų iki reikšmingai gyvenimo kokybę lemiančių, nebūtinai su bronchų obstrukcijos sunkumu koreliuojančių

simptomų [60]. Stabilią eigą dažniausiai keičia paūmėjimai, ir atvirkščiai. Astmos paūmėjimu laikoma būklė, kai simptomai progresuoja, nors asmuo ir

vartoja jam paskirtą optimalų gydymą, stebimas plaučių funkcijos blogėji-mas, patogenetiškai – intensyvėja kvėpavimo takų uždegimas. Paūmėjimus gali lemti įvairūs veiksniai, pvz., infekcija, buvimas daug alergenų turinčioje

17

aplinkoje, oro temperatūros kaita, rūkymas, prisidėjusios gretutinės ligos arba kitos būklės (pvz., nėštumas). Gali turėti įtakos ir fizinis krūvis, emocinė sa-vijauta, vartojami vaistai (pvz., nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo, β adreno-receptorių blokatoriai), oro tarša, alergija maistui, astmos gydymo režimo nesilaikymas [5]. Net to paties asmens paūmėjimai gali būti skirtingi – praeiti tiesiog sustiprinus ambulatoriškai skirtą gydymą arba pridėjus antibiotikų ar geriamųjų gliukokortikoidų. Tačiau gali prireikti ir stacionarinio gydymo, kartais net intensyviosios terapijos. Baigtys gali būti ir mirtinos. Pastarieji atvejai yra gana reti, išskyrus besivystančias šalis [5, 60].

Paūmėjimai svarbūs tolesnei ligos eigai, nes prisideda prie jau ir taip dėl nuolatinio kvėpavimo takų uždegimo vykstančių struktūrinių kvėpavimo takų pokyčių (dar vadinamo remodeliavimo), pvz., subepitelinės fibrozės, padi-dėjusios bronchų lygiųjų raumenų masės, bronchų sekretą išskiriančių liaukų padidėjimo, neovaskuliarizacijos ir epitelio pokyčių [5, 77, 84, 85]. Visa tai gali reikšmingai pabloginti plaučių funkciją, turėti įtakos vėlesnių paūmėjimų dažniui [86], ligos eigos sunkumui, blogesniam atsakui į skiriamą gydymą [5, 84]. Pastebėta, kad astmos, turinčios vyraujančią eozinofiliją, paūmėjimai yra dažnesni ir sunkesni [10, 77].

1.4. 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimas

2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimas apibrėžiamas kaip Th2 uždegimas, turintis ryškią eozinofiliją [7, 85, 87], ir kuriam būdingas putliųjų ląstelių, bazofilų, Th2 ląstelių, įgimtų antrojo tipo limfoidinių ląstelių (angl. type 2

innate lymphoid cells, ILC2) ir IgE gaminančių B ląstelių kaupimasis. Sąvoka

„eozinofilija“ reiškia padidėjusį eozinofilų kiekį kraujyje ir / arba audiniuose. Kraujyje eozinofilija dažniausiai apibrėžiama kaip šių ląstelių skaičiaus padidėjimas daugiau kaip 0,5 × 109_{/l, audiniuose – atsižvelgiant į fiziologiškai}

nustatomą jų kiekį [73]. Tačiau ir gerokai mažesni kraujo eozinofilų kiekiai gali sukelti reikšmingų audinių / organų pokyčių. Sergant eozinofiline astma, plaučių audinyje nustatomas padidėjęs eozinofilų, sukeliančių lėtinį kvėpa-vimo takų uždegimą ir pažeidžiančių plaučių audinį, kiekis. Dėl šių priežasčių ligos eiga ir gydymas tampa komplikuoti. Pastebėtas eozinofilijos ryšys su astmos sunkumu [73, 83, 88]. Pagal vyraujantį uždegimo modelį, vartojami „2-ojo tipo astmos“ ir „eozinofilinės astmos“ terminai, o 2-ojo tipo uždegimas dažnai pavadinamas eozinofiliniu uždegimu. Kaip jau minėta, dažniausiai ast-ma, esant vyraujančiam eozinofiliniam uždegimui, pasireiškia intensyves-niais ligos simptomais, dažnesintensyves-niais paūmėjimais, blogesne reakcija į skiria-mus IGK, o ligos eiga paprastai būna sunki [6–12, 65–70, 83]. Būdingi ir ryškūs struktūriniai kvėpavimo takų pokyčiai [7, 89, 90]. 2-ojo tipo imuninė reakcija laikoma tipišku atopiškų asmenų atsaku į alergeno poveikį.

18

Pastebėta, kad ir daugybė aplinkos dirgiklių, pvz., teršalai, virusai, taip pat gali sukelti šio tipo uždegimą ir nesant atopijos (nealerginės eozinofilinės astmos atveju). Eozinofilinė (tiek alerginė, tiek nealerginė) astma sudaro visų iki šiol identifikuotų astmos fenotipų ir endotipų pagrindą [8], todėl 2-ojo tipo imuninis atsakas yra dažniausias sergant astma [6].

Eozinofilinį uždegimą, atsižvelgiant į atopijos buvimą / nebuvimą, sukelia skirtingi patogenetiniai keliai (1.4.1 pav.). AA atveju dendritinės ląstelės (DL) CD4+ T ląstelėms (CD (angl. cluster of differentiation) − diferenciacijos grupė; CD4+ yra T limfocitų pagalbininkų skiriamoji molekulė) pateikia antigeną, indukuoja Th2 ląsteles, gaminančias pagrindiniais 2-ojo tipo užde-gimo tarpininkais (sin. uždeužde-gimo mediatoriais) vardijamus citokinus IL-4, IL 5 ir IL-13 [91-93], o tai lemia antikūnų gamybos B ląstelėse „perjungimą“ iš IgM / IgG į IgE, kvėpavimo takų eozinofiliją, putliųjų ląstelių aktyvinimą ir gleivių hipersekreciją [94]. IL-4 yra svarbus naiviųjų T limfocitų pagalbi-ninkų (angl. naïve helper T cells, Th0) diferenciacijai į Th2 ir IgE gamybai. Specifiniai IgE antikūnai jungiasi prie jiems giminingų receptorių FceRI, esančių ant bazofilų ir putliųjų ląstelių paviršiaus, ir šias ląsteles įjautrina. IL-5 yra atsakingas už eozinofilų ir putliųjų ląstelių aktyvinimą ir telkimąsi, o IL-13 sukelia taurinių ląstelių hiperplaziją, gleivių hipersekreciją ir padi-dėjusį bronchų reaktyvumą [7, 95].

Sergant nealergine eozinofiline astma oro teršalai, mikroorganizmai ir glikolipidai sukelia bronchų epitelio citokinų, įskaitant IL-33, IL-25 ir TSLP, kurie aktyvina ILC2 nuo antigeno nepriklausomu būdu per atitinkamus receptorius (IL-17 receptorius B, ST2 (angl. serum stimulation-2; serumo stimuliatoriaus-2 receptorius) ir TSLP receptorius) išsiskyrimą [96, 97]. Ne-seniai atliktas tyrimas, kurio metu siekta geriau suprasti nealerginės kilmės eozinofilinio kvėpavimo takų uždegimo mechanizmus. Nustatyta, kad po stimuliacijos TSLP ir IL-33, ILC2 ląstelės pradėjo gaminti su Th2 uždegimu susijusius citokinus, įskaitant didelius IL-5 ir IL-13 kiekius bei kiek mažiau IL-4 [98, 99]. Padidėjusi IL-5 gamyba iš dalies gali paaiškinti eozinofilinio uždegimo atsiradimą SNEA metu. Sergant sunkia astma kvėpavimo takuose padidėja epitelio citokino TSLP ir lipoksino A raiška, todėl sumažėja ILC2 išskiriamo IL-13 kiekis, nevaldomas ILC2 aktyvinimas gali lemti refrakterinę eozinofiliją sunkia nealergine astma sergantiems asmenims [98, 100, 101]. Nustatyti ir genai, kurie siejami su ILC2 vystymusi ir aktyvinimu: ILC2 diferenciacijai svarbus su retino rūgštimi susijusio receptoriaus α (angl.

retinoid-related orphan receptor α, ROR-α) koduojantis genas; o genai,

ko-duojantys IL-33 ir IL-1 receptorių tipą 1, kuris yra IL-33 receptorių komp-lekso ST2 dalis, tarpininkauja perduodant IL-33 signalą ir aktyvina ILC2 [100, 102].

19

1.4.1 pav. Skirtingi eozinofilinio uždegimo patogenetiniai keliai

sergant astma [102]

CRTH2 − chemoatraktanto receptoriaus homologinė molekulė ant Th2 ląstelių; ALX / FPR2 − lipoksino A4 receptorius; FcεRI − didelio giminingumo IgE receptorius;

GATA3 − GATA surišantis baltymas 3; PGD2 − prostaglandinas D2; RORα − su retino rūgštimi susiję receptoriai α.

Taigi, eozinofilija yra bendras alerginės ir nealerginės astmos patogene-tinių kelių požymis ir bene svarbiausias astmos eigą nulemiantis 2-ojo tipo uždegiminės grandinės etapas, kuriam vykti reikalingas eozinofilų aktyvini-mas [103]. IL-3, IL-5 ir GM-CSF yra esminiai citokinai, reguliuojantys eozinofilų vystymąsi [13].

1.4.1. Eozinofilopoetinai ir jų β gradinės receptoriai

Eozinofilų kiekis kraujyje, organuose, audiniuose yra jų pirmtakų gamy-bos kaulų čiulpuose, diferenciacijos, brendimo, patekimo į kraujotaką, akty-vinimo ir tikslinio telkimosi padarinys. Už eozinofilų brendimą, aktyvini-mą, išgyvenamumą ir apoptozę daugiausia atsakingi citokinai IL-3, IL-5 ir GM-CSF, kurie dar vadinami eozinofilopoetinais [13–16, 104].

20

Pagrindiniai IL-3 šaltiniai yra T ląstelės, natūralūs žudikai (NK ląstelės) ir putliosios ląstelės, iš kurių svarbiausias − aktyvintos T ląstelės [105]. IL-3 skatina mišrių neutrofilinių granulocitų, makrofagų, megakariocitų ir eritro-citų kolonijų susidarymą. IL-3 sinergistiškai veikia kartu su granuloeritro-citų kolonijas stimuliuojančiuoju veiksniu, IL-1 ir IL-6, stimuliuojant pirmines kraujodaros ląsteles. Yra duomenų apie astma sergančių asmenų padidėjusį ląstelių, išskiriančių IL-3 matricinę ribonukleorūgštį (mRNR), skaičių glei-vinės biopsijose ir bronchoalveolinio lavažo ląstelėse [106].

Pagrindinis IL-5 šaltinis yra aktyvintos ląstelių T pagalbininkių popu-liacijos, mažesniais kiekiais − eozinofilai, putliosios ląstelės, CD4+ ir CD8+ T ląstelės (CD8+ molekulė yra T limfocitų žudikų skiriamasis požymis) [107]. IL-5 yra esminis eozinofilų atsako reguliavimo citokinas [108] − svarbus proliferuojant eozinofilų pirmtakinėms ląstelėms, skatina eozinofilų gamybą, diferenciaciją, brendimą, aktyvinimą, ilgina jų išgyvenamumą, svar-bus atsirasti bronchų hiperaktyvumui, sąveikauja su kitais eozinofilų chemo-atraktantais ir aktyvikliais, pvz., chemokinais, siekdamas aktyvinti ir sukelti eozinofilų chemoatrakciją [21, 106, 109]. IL-5 yra eozinofiliniam uždegimui labai specifiškas citokinas. Antikūnai, blokuojantys IL-5, veiksmingai mažina eozinofilinį uždegimą bei padidėjusį bronchų hiperreaktyvumą [106, 110–112]. Humanizuoto monokloninio antikūno prieš IL-5 mepolizumabo tyrimai patvirtino jo veiksmingumą mažinant eozinofilų kiekį kraujyje ir kvėpavimo takuose sergant astma, tačiau nepakeitė bronchų hiperreaktyvumo ar atsako į alergeną [113].

GM-CSF yra pleotropinis citokinas, galintis stimuliuoti ir reguliuoti krau-jodaros ląstelių augimą, proliferaciją, brendimą ir funkcijas. GM-CSF gamina eozinofilai, makrofagai, T limfocitai, fibroblastai, endotelio ląstelės, kvėpa-vimo takų lygiųjų raumenų ir epitelio ląstelės, astma sergančių asmenų kraujo monocitai [24, 114]. GM-CSF, kartu su IL-8, įtakoja eozinofilų chemoatrak-ciją ir aktyvinimą, dalyvavauja sukeliant bronchų hiperreaktyvumą [115].

IL-3, IL-5 ir GM-CSF receptoriai signalui perduoti turi unikalius α gran-dinės subvienetus (atitinkamai IL-3Rα, IL-5Rα arba GM-CSFRα) ir dalijasi bendrais visiems trims β grandinės subvienetais [26]. Pastarieji būtini signalui perduoti, paaiškina persidengiančią citokinų veiklą, tačiau vieni patys nesugeba surišti nė vieno citokino, priešingai nei α grandinės receptoriai, turintys unikalius subvienetus, surišančius tik jiems specifinius ligandus, ir leidžiančius išskirti kiekvieno eozinofilopoetino svarbą skirtingais astmos pa-togenezės etapais [26]. Citokinui jungiantis prie jam specifiško α recepto-riaus, telkiami β receptoriai. Jie jungiasi prie citokino ir taip suteikia būtiną α ir β subvienetų fizinį ir konformacinį artumą, inicijuoja tarpląstelinį signalo perdavimą ir sukelia reikiamą fiziologinį poveikį (1.4.1.1 pav.) [115]. Didelė

21

IL-3, IL-5 ir GM-CSF arba jų receptorių raiška gali sukelti pernelyg intensyvų signalo perdavimą ir prisidėti prie astmos patogenezės [115, 116].

1.4.1.1 pav. IL-3, IL-5 ir GM-CSF receptoriai [115]

IL-3Rα, IL-5Rα ir GM-CSFRα ant neaktyvintų ląstelių egzistuoja kaip monomerai. Kiekvienam receptoriui specifiška α grandinė (Rα) formuoja citokinų jungimosi specifiškumą. Prijungdamas ligandą, β grandinės subvienetas (βc) yra telkiamas prie Rα / ligando komplekso ir sąveikauja su Rα surištu citokinu, kad suaktyvintų signalo perdavimą

ir fiziologinį atsaką.

Taigi, kad kraujo eozinofilai telktųsi į plaučius, kvėpavimo takus, juos reikia suaktyvinti [14, 15]. Daugiausia tai priklauso nuo eozinofilopoetinų [14, 16]. Ne mažiau svarbu ir tiesioginė eozinofilų adhezija per integrinus prie tikslinių ląstelių.

1.4.2. Eozinofilų integrinai

Kvėpavimo takuose eozinofilų kiekis dažniausiai pakinta dėl uždegimo ir suintensyvėjusio ląstelių migravimo, nulemto daugybės veiksnių, kurių pa-grindiniai yra putliosios, T ir B ląstelės bei jų išskiriami citokinai. Sisteminėje kraujotakoje esantys eozinofilai į kvėpavimo takus geba patekti adhezijos ir migravimo keliu per bronchų kraujagyslių endotelį [117]. Eozinofilų migra-vimas iš kraujotakos į audinius vyksta jų paviršiuje esantiems integrinams sąveikaujant su kraujagyslių endotelio ląstelių paviršiaus sukibimo (adhezi-nėmis) molekulėmis. Adhezija yra svarbi eozinofilų aktyvinimui ir atlieka-moms funkcijoms.

Integrinai yra ląstelių receptoriai, turintys α ir β subvienetų, reguliuojančių eozinofilų migravimą iš kraujotakos į bronchus ir jų spindį. Žmogaus kraujo eozinofilai išskiria septynis integrinų heterodimerus: α4β1, α6β1, αMβ2, αLβ2, αXβ2, αDβ2 ir α4β7 [118]. Šie sąveikauja su jiems būdingais ligandais, esančiais užląsteliniame užpilde arba ant kitų ląstelių paviršiaus. Suprasti

22

integrinų funkcijas sudėtinga, nes kiekvienas jų gali turėti kelias konfor-macijos būsenas, skirtingą raiškos lygį ir telktis plazmos membranoje [119, 120]. Todėl eozinofilų migravimas į astma sergančio asmens plaučius apima sudėtingą skirtingos aktyvinimo būsenos integrinų receptorių sąveiką, daly-vaujant adhezinėms bronchų endotelio ir audinių molekulėms [17, 18]. Adhe-zinėmis molekulėmis vardinamos kraujagyslinė adhezijos molekulė-1 (angl.

vascular cell adhesion molecules-1, VCAM-1) ir tarpląstelinė adhezijos

mo-lekulė-1 (angl. intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1), periostinas, P selektinas, P selektino glikoproteino ligandas-1 ir vėlyvo aktyvinimo antigeno / kraujagyslių ląstelių sukibimo molekulės [121]. Nustatyta, kad VCAM-1 ir P selektino raišką endotelio ląstelėse padidina IL-4 ir IL-13, visa tai lemia geresnį eozinofilų sukibimą su endotelio ląstelėmis ir migravimą į kvėpavimo takus (per VCAM-1/integrinų α4 sąveiką) [122, 123].

Kraujotakoje esantys eozinofilai adhezijos būdu (esant aktyvintiems integ-rinams jų paviršiuje) prisitvirtina prie kraujagyslių endotelio. Veikiant cito-kinais, eozinofilų aktyvinimas tęsiasi ir, reaguodami į chemoatraktantus, mig-ruoja į kvėpavimo takus [124–126] (1.4.2.1 pav.). α4β1 ir αMβ2 – du svar-biausi integrinai, tarpininkaujantys eozinofilų adhezijai ir judėjimui [125]. Yra duomenų, kad sergant astma integrinų raiškos pokyčiai gali lemti eozino-filų sukeltus kvėpavimo takų lygiųjų raumenų struktūros pokyčius [29].

Eozinofilams skverbiantis iš kraujotakos į kvėpavimo takus, pastarieji infiltruojasi minėtomis imuninėmis ląstelėmis. Šiuo etapu svarbūs 2-ojo tipo citokinai – IL-4 ir IL-13, didinantys chemokinų – eozinofilų chemoatraktan-tų – gamybą. Eozinofilų telkimąsi bronchuose kontroliuoja chemokinų C-C motyvo ligandai 5, 7, 11, 13, 15, 24 ir 26 bei jų receptoriai CCR3, Th2 ląstelių chemoatraktanto receptoriaus homologinių molekulių (angl. chemoattractant

receptor-homologous molecule expressed on Th2 cells, CRTH2),

prisijun-giančių prostaglandiną D2 (PGD2). PGD2 veikia kaip eozinofilų chemoatrak-tantas, kurio sintezė suintensyvinama stimuliuojant CCR3 [127]. Aktyvintos putliosios ląstelės yra pagrindinis PGD2, išsiskiriančio tiek nuo IgE priklau-somo, tiek nepriklausomo aktyvinimo metu, šaltinis [128]. Uždegimo metu eozinofilų kaupimąsi kvėpavimo takuose skatina ir kvėpavimo takų epitelio ląstelių, eozinofilų, fibroblastų išskiriamas periostinas [129]. Tai užląstelinio užpildo baltymas, kuriam jungiantis su eozinofilų αMβ2 ir α4β1 integrinais, skatinama eozinofilų adhezija ir jų telkimasis kvėpavimo takuose [31, 130]. Aktyvinti eozinofilai geba greitai reaguoti į dirgiklį ir mažiau nei per valandą išskirti imunomoduliuojamąsias medžiagas – daugiau kaip 35 rūšių citokinus, augimo veiksnius ir chemokinus [29]. Gausi audinių infiltracija aktyvintais eozinofilais galiausiai sukelia struktūrinius kvėpavimo takų pokyčius.

23

1.4.2.1 pav. Eozinofilų migravimas iš sisteminės kraujotakos

į kvėpavimo takus [131]

IL-4 – interleukinas 4; IL-5 – interleukinas 5, IL-13 – interleukinas 13, CCR3 – CC chemokinų receptorius, Th2 – 2-ojo tipo T ląstelės pagalbininkės 2; ECP (angl. eosinophil

cationic protein) – eozinofilų katijoninis baltymas; EPO – (angl. eosinophil peroxidase)

eozinofilinė peroksidazė; MBP – (angl. major basic protein) didysis pagrindinis baltymas; EDN – (angl. eosinophil derived neurotoxin) iš eozinofilų kilęs neurotoksinas.

1.4.3. Eozinofilų biologinė reikšmė

Eozinofilai – tai cirkuliuojantys granulocitai, kurie kartu su kitomis balto-siomis kraujo ląstelėmis gaminami kaulų čiulpuose. Subrendę eozinofilai sudaro 1–3 proc. visų baltųjų kraujo ląstelių [80], yra 12–17 mikronų dydžio, turi dviejų segmentų branduolius, dideles acidofilines citoplazmines granules, rodančias jų giminingumą rūgštims. Ląstelės citoplazmoje gausu cheminių tarpininkų (sin. mediatorių), kurie išsiskiria aktyvinus subrendusį eozinofilą ir vykstant jo degranuliacijai. Iš kaulų čiulpų į kraujotaką patekę eozinofilai gali išgyventi iki 8–12 valandų, tačiau galutinis jų migravimo taškas yra au-diniai [117], kuriuose, ir nesant stimuliacijos, gali išlikti gyvybingi iki 8–12 dienų [132].

Įprastai eozinofilų randama smegenyse, užkrūčio liaukoje, apatinėje virš-kinamojo kanalo dalyje, kiaušidėse, gimdoje, blužnyje ir limfmazgiuose,

24

tačiau jų beveik nėra plaučiuose, odoje, stemplėje ir kai kuriuose kituose vidaus organuose [133]. Todėl eozinofilų kiekio padidėjimas, pvz., plaučių audinyje, yra neabejotinai ligos požymis ir aiškinama subrendusių eozinofilų migravimu iš kraujotakos į uždegimines audinių sritis [121].

Kad eozinofilas subręstų ir gebėtų atlikti savo funkcijas, ne visuomet palankias organizmui, turi įvykti daug biocheminių ir fiziologinių procesų. Šios imuninės ląstelės kaulų čiulpuose pradeda vystytis iš daugiagalių (sin. pluripotencinių) CD34+ pradininkių (sin. progenitorinių) kamieninių ląstelių. Eozinofilų linijos besivystančias ląsteles veikia transkripcijos veiksniai. Vienas pagrindinių – eozinofilų vystymosi metu dalyvaujantį transkripcijos veiksnį surišantis baltymas 3 (angl. GATA binding protein 3, GATA-3) [134]. Šis veiksnys skatina Th2 citokinų gamybą, įskaitant IL, kurie dalyvauja vystantis eozinofilams. Daugiausia GATA-3 išskiria Th2 ir mažiau – ILC2 [121, 128]. Tai pagrindinis Th2 ląstelių diferenciacijos reguliatorius, kontro-liuojantis IL-4, IL-5 ir IL-13 išsiskyrimą [121]. Ankstyvojoje fazėje eozi-nofilai kaulų čiulpuose diferencijuojasi veikiant GM-CSF, IL-3, IL-33; įtakos turi hematopoezinių kamieninių ląstelių ST2 receptorių raiška [134]; vėles-nėse fazėse – IL-5 [121, 132], kurio gamybai ir IL-5Rα raiškai pirmtakių ląstelių paviršiuose svarbus IL-33 [135]. Tyrimų metu pastebėta, kad trūks-tant IL-33, IL-5, stokojant ST2 ir IL-5Rα receptorių, sutrikdoma eozinofilo-poezė [135]. Eozinofilai prieš patekdami į kraujotaką gamina ir kaupia ant-rines baltymines granules, svarbias tolesniam ląstelių išgyvenimui ir funkcio-navimui. Galutinė diferencijacija įvyksta veikiant IL-5 [134].

Pagrindę funkciją eozinofilai atlieka po aktyvinimo stimulu, kai įvyksta jų citolizė ir išskiriamos eozinofilinės granulės. Pastarosios atsakingos už nuo ligando sukeltą eozinofilinių toksinų sekreciją ir sukelia struktūrinę ląstelių pažaidą [121, 128]. Manoma, kad eozinofilų granulių raiška yra reguliuojama nekoduojančiojo RNR-EGOT geno (eozinofilo granulės ontogenezės trans-kripto genas, koduojantis ne baltymus, o ilgą nekoduojamą ribonukleorūgš-ties (RNR) molekulę) [124].

Po aktyvacijos eozinofilai geba atlikti šias pagrindines efektorines funk-cijas [29, 125, 136, 137]:

• _{citotoksinių baltymų gamyba ir išsiskyrimas degranuliacijos metu:} di-dysis pagrindinis baltymas, eozinofilų katijoninis baltymas, eozinofilų peroksidazė, eozinofilų išskiriamas neurotoksinas. Didysis pagrindinis baltymas, eozinofilinė peroksidazė ir eozinofilinis katijoninis baltymas yra toksiški daugeliui audinių;

• sudaromos reaktyviosios deguonies formos, pvz., hipobromitas, super-oksidas ir persuper-oksidas (hipobromito rūgštis, kurią iš esmės gamina eozi-nofilų peroksidazė);

25

• sintetinami lipidų tarpininkai (sin. mediatoriai), pvz., eukozanoidai (leukotrienai (LT), pvz., LTC4, LTD4, LTE4; prostaglandinai (PG), pvz., PGE2);

• _{gamina ir prireikus išskiria fermentus, pvz., elastazę;}

• _{išskiria augimo veiksnius, pvz., transformuojantįjį augimo veiksnį β} (angl. transforming growth factor β, TGF-β), kraujagyslių endotelio au-gimo veiksnį (angl. vascular endothelial growth factor, VEGF) ir trom-bocitų kilmės augimo veiksnį (angl. platelet-derived growth factor, PDGF); citokinus, pvz., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13 ir naviko nekrozės veiksnį (angl. tumor necrosis factor, TNF) alfa. Neigiamus eozinofilinio uždegimo padarinius lemia ir ilgesnė eozinofilų išgyvenamumo trukmė dėl užtrukusios apoptozės, prailgėjusio eozinofilų toksinių tarpininkų (sin. mediatorių) išsiskyrimo laiko. Normos atveju, eozi-nofilus, įvykus programuotai jų žūčiai (apoptozei), pašalina makrofagai ir imuninis atsakas nesukeliamas. Esant uždelstai apoptozei, sudaromos pa-lankios sąlygos tęstis eozinofiliniam uždegimui ir šiam procesui didelę įtaką turi IL-3, IL-5 ir GM-CSF [138].

1.4.4. Eozinofilinio uždegimo slopinimas skiriant biologinę terapiją Ilgus metus astmos gydymo pagrindas išlieka IGK (monoterapija arba kartu su bronchus plečiančiais vaistais). Sergant sunkia astma, neretai tenka pridėti ir sisteminių gliukokortikoidų, kurie ne visuomet veiksmingi. Esant ryškiam eozinofiliniam uždegimui, paūmėjimai linkę kartotis, blogėja plaučių funkcija ir gyvenimo kokybė, o atsakas į skiriama gydymą – mažas. Biolo-ginės terapijos atsiradimas prilyginamas sunkios astmos gydymo perversmui [7, 91], nes didžiajai daliai pacientų galima pasiekti simptomų kontrolę arba veiksmingai suretinti ligos paūmėjimus, pagerinti fizinio krūvio toleravimą, kasdienę veiklą, gyvenimo kokybę. Atsiranda galimybė atsisakyti sisteminių gliukokortikoidų vartojimo ir taip mažinti su gydymu susijusių nepagei-daujamų poveikių dažnumą. Esant vyraujančiam eozinofiliniam kvėpavimo takų uždegimo komponentui, sergant sunkia 2-ojo tipo astma, ir nepasiekiant simptomų kontrolės, gali būti skiriama monokloninių antikūnų prieš IL-5 ar jo receptorius (IL-5R).

Pagal tyrimų duomenis, sunkia, gliukokortikoidams atsparia astma sergan-čių asmenų patogenezei didžiausią įtaką turi IL-5 / IL-33 signalinis kelias [74, 97, 99]. Šiems pacientams veiksmingiausias IL-5 blokuojantis gydymas [81, 139–142]. Pastebėta, kad sergant šio fenotipo astma, antikūnai prieš IL-5 (tiek blokuojantys IL-5, tiek jo receptorius, pvz., mepolizumabas, benralizumabas, reslizumabas) labai sumažina eozinofilų kiekį, astmos paūmėjimų skaičių,

26

stebimas mažesnis geriamųjų gliukokortikoidų poreikis, o astmos simptomai išlieka kontroliuojami [143–146].

Daugelis eozinofilų funkcijų yra valdomos IL-5. Trūkstant jo arba kitų ak-tyvių eozinofilinių citokinų, eozinofilai greitai apoptozuoja. Mepolizumabas ir reslizumabas yra IL-5 antagonistiškai veikiantys monokloniniai antikūnai, neutralizuojantys IL-5 ir neleidžiantys jungtis prie IL-5 receptorių, esančių ląstelių paviršiuje. Slopinamas IL-5 signalinis kelias ir IL-5 bioaktyvumas, mažinama eozinofilų gamybą kaulų čiulpuose ir jų išgyvenimas. Tačiau ben-ralizumabas jungiasi prie IL-5 receptoriaus α grandinės (IL-5Rα) ir blokuoja IL-5 prisijungimą. Minėtų receptorių randama subrendusių eozinofilų, eozi-nofilų linijos pirmtakių (sin. progenitorių ląstelių) ir bazofilų paviršiuose (1.4.4.1 pav.).

Šiuo metu Lietuvoje prieinami monokloniniai antikūnai jungiasi prie IL-5 ar jo receptorių (IL-5R). Disertacinio darbo rengimo metu SNEA gydyti buvo skiriami biologinės terapijos vaistai – antikūnai prieš IL-5, iš kurių Lietuvoje buvo kompensuojamas tik mepolizumabas.

1.4.4.1 pav. Antikūnų prieš IL-5 veikimo mechanizmų principai [143]

FcgRIIIA – fragmento imunoglobulino molekulėje, išskirto kristalizuojant, mažo giminingumo (sin. afiniteto) receptorius IIIA; IL-5 – interleukinas 5;

27

1.5. Bronchų epitelio įtaka astmos patogenezei

Kvėpavimo takų epitelio ir įkvepiamosios aplinkos sąveika yra labai svar-bi, norint suprasti astmos patofiziologiją. Epitelis yra ne tik pirmasis gynybos barjeras, apsaugantis plaučius nuo fizinių ir cheminių dirgiklių, tačiau turi didelę įtaką audinių homeostazei, reguliuoja platų imuninių ląstelių spektrą [88, 147]. Kaip atsaką į įkvepiamųjų išorinių dirgiklių sukeltą bronchų epitelio pažaidą, epitelis išskiria daug bioaktyvių medžiagų, dalyvaujančių telkiant ir aktyvinant uždegimines ląsteles, prisideda aktyvinant ir sustipri-nant įgimtą bei humoralinį imunitetą [20, 103, 147–149]. Todėl sutrikus bron-chų epitelio anatominiam vientisumui, keičiasi jo atliekamos funkcijos – ne tik kaip fizinio barjero, tačiau stebima įtaka ir imuninei funkcijai [103, 150].

Astma yra susijusi su sutrikusia epitelio ląstelių funkcija. Po kontakto su išoriniu dirgikliu epitelis išskiria tarpininkus (sin. mediatorius), įskaitant citokinus [20, 88, 150, 151]. Dažniausiai tai įvyksta per patogeno atpažinimo receptorius (angl. pathogen recognition receptor, PAR) ir transmembraninio atpažinimo receptorius (angl. toll-like receptors, TLR), įtakos gali turėti alergenų proteazės ir oksidaciniai pažeidimai [103]. Pagrindiniai epitelio gaminami citokinai yra trys – IL-25, IL-33 ir TSLP [7, 22, 35, 152]. Pastarieji, atsižvelgiant į vyraujantį patogenetinį kelią, stimuliuoja Th2 (AA atveju) ir ILC2 (nealerginės astmos atveju) gaminti Th2 citokinus [36]. IL-33 ir TSLP gali ir tiesiogiai aktyvinti putliąsias ląsteles, o TSLP skatina DL sukelti į Th2 panašų atsaką. Minėti citokinai veikia ir patį epitelį, turi neigiamą įtaką bronchų remodeliavimo procesams [36], tai dar labiau sutrikdo epitelio atliekamas funkcijas [103]. Taigi, IL-25, IL-33 ir TSLP gali sukelti ar sustiprinti uždegimo grandinę, todėl vis dažniau pavadinami aliarminais [7, 22, 35, 46, 153] (1.5.1 pav.).

28

1.5.1 pav. Pagrindiniai bronchų epitelio citokinai [35]

Epitelio gaminami citokinai – IL-25, IL-33 ir TSLP – išsiskiria reaguodami į įvairius bronchų epitelio dirgiklius, įskaitant infekcijos sukėlėjus, aplinkos alergenus ir atmosferos teršalus, aktyvina tam tikras imunines ir efektorines ląsteles ir astma sergančiam asmeniui

sukeliamas kvėpavimo takų uždegimas.

Naujausių tyrimų duomenimis, TSLP / įgimtų limfoidinių ląstelių ašis gali būti gydymo gliukokortikoidais atsparumo išsivystymo grandis. Nustatyti atminties Th2 ląstelių pogrupiai, kuriems būdinga didelė TSLP, IL-33 ir IL-25 receptorių raiška, tai patvirtina minėtų citokinų įtaką alerginių paūmė-jimų atvejais [22, 154].

Pastarąjį dešimtmetį daugėja duomenų apie citovilino ezrino reikšmę ast-mos patogenezei [44, 45, 155]. Ezrinas, svarbus ezrino / radiksino / moesino baltymų šeimos narys, veikia ląstelių membranų citoplazminiame paviršiuje ir sujungia plazmos membranos baltymus su žievės aktino ląstelės griaučiais (sin. citoskeletu) [21]. Ezrinas turi didelę įtaką bronchų obstrukcijai atsirasti, kadangi yra labai išreikštas žmogaus kvėpavimo takų lygiųjų raumenų ląste-lėse bei moduliuoja β2 adrenerginių receptorių signalus ir raumenų susitrau-kimus sergant astma [21, 156]. Pastaraisiais metais bronchų epitelio įtaka astmos patogenezei yra dėmesio centre.

29

1.6. 2-ojo tipo kvėpavimo takų uždegimo biologiniai žymenys Atsižvelgiant į astmos heterogeniškumą, fenotipų ir endotipų gausą bei patogenezės ypatumus, norint skirti veiksmingą gydymą, svarbu nustatyti kiek įmanoma tikslesnį astma sergančio žmogaus fenotipą arba endotipą. Šiam tikslui naudojami esami ir ieškomi nauji biologiniai žymenys. Idealus biologinis žymuo turėtų būti susijęs su ligos patogeneze, patikimas ir atku-riamas, kistų gydymo metu, būtų lengvai aptinkamas ir kiekybiškai įvertina-mas, nebrangus, jautrus ir specifiškas [53, 54]. Klikinėje praktikoje įvykdyti visas šias sąlygas yra sudėtinga. Dažnai biologiniai žymenys arba padeda diagnozuoti ligą ir jos fenotipą, arba kinta gydymo metu, atsižvelgiant į atsaką.

Yra patvirtinti penki 2-ojo tipo uždegimo biologiniai žymenys: eozinofilų kiekis kraujyje ir skrepliuose, FeNO, IgE bei periostino koncentracija serume [157, 158]. Šiuo metu daugiausia ištirtas biožymuo – eozinofilų skaičius kraujyje [159]. Tai paprastas, greitai atliekamas ir lengvai prieinamas tyrimas, susijęs su eozinofilinio uždegimo intensyvumu ir skreplių eozinofilija, todėl šio biožymens naudojimas klinikinėje praktikoje plačiai paplitęs. Kraujo eozinofilų skaičius nėra astmos diagnozavimo kriterijus. Jis gali būti naudo-jamas identifikuojant eozinofilinės astmos fenotipą, taip pat kaip prognozinis atsako į gydymą gliukokortikoidais biožymuo [160, 161]. Daugelis kitų biožymenų turi apribojimų. Skreplių eozinofilų skaičius – gana specifiškas tyrimas, jei atliekamas tinkamai surinkus ir apdorojus skreplius, o vertintojas turi ilgametę patirtį. Tačiau tai įgyvendinti dažniausiai įmanoma tik dide-liuose, specializuotuose, ilgametę patirtį sukaupusiuose centruose. Tyrimas trunka ilgai, turi subjektyvų vertinimo komponentą, todėl šis biožymuo nau-dojamas gana retai. FeNO yra lengvai prieinamas, greitai atliekamas, gali padėti nuspėti paūmėjimus, taip pat naudojamas atsakui į gydymą gliukokor-tikoidais, biologine terapija įvertinti. Šis tyrimas yra brangus, nespecifiškas rūkantiems asmenims. Jo vertę gali iškreipti pirmiau atlikta spirograma, intensyvus fizinis krūvis, gilus kvėpavimas, infekcija [162]. Nebuvo nustatyta aiškaus ryšio tarp IgE arba alergijos ir atsako į skiriamą gydymą arba ligos eigos. Atliktų tyrimų duomenimis, padidėjęs serumo periostino kiekis suau-gusiesiems, sergantiems astma, yra susijęs su fiksuota ir sunkesne bronchų obstrukcija [163, 164], greitesniu plaučių funkcijos blogėjimu [165, 166], gali prognozuoti atsaką į gydymą antikūnais prieš IgE [163]. Periostino koncen-tracijos matavimas yra mažai prieinamas. Bronchų epitelis jį išskiria kaip atsaką į IL-13 ir IL-4 signalus, o koncentracijos pokyčius gali lemti augimas, nėštumas, dantų ligos. Būtina nustatyti naujus, papildomus 2-ojo tipo kvė-pavimo takų uždegimo biologinius žymenis ir juos kartu vartoti su esamais biologiniais žymenimis, atspindinčiais eozinofilinio uždegimo intensyvumą.

30

Daugelis į astmos patogenezę įeinančių biologiškai aktyvių medžiagų gali būti biožymenys [24, 102, 167]:

• _{Pirmiausia, esant 2-ojo tipo uždegimui, turinčiam ryškų eozinofilinį} kom-ponentą, svarbūs eozinofilopoetinai IL-3, IL-5 ir GM-CSF – kaip pa-grindiniai citokinai eozinofilams vystantis ir bręstant (išsamus citokinų vaidmuo astmos patogenezei aprašomas skyriuje 1.4.3. Eozinofilų biolo-ginė reikšmė).

• _{Naujausių tyrimų duomenimis, minėtus eozinofilinio uždegimo} biožyme-nis derinant su serumo eotaksinų CCL11, CCL17 koncentracijomis, astma sergančius pacientus galima skirstyti į intensyvaus ir neintensyvaus Th2 uždegimo endotipus (angl. Th2-high and Th2-low asthma) [55, 103, 168, 169]. Šis skirstymas leistų geriau prognozuoti astmos eigą ir baigtis, gydymo veiksmingumą. Minėti eotaksinai dalyvauja kontroliuojant akty-vintų eozinofilų telkimąsi iš kraujotakos į audinius. CCL11 yra citokinas, priklausantis CC chemokinų šeimai, dar kitaip vadinamas eotaksinu. Tai vienas iš trijų pagrindinių eozinofilų chemotaksį didinančių baltymų, veikiantis per eozinofilų paviršiuje esančius chemokinų receptorius CCR3 ir skatinantis eozinofilų telkimąsi plaučiuose [53]. CCL17 yra citokinas, priklausantis CC chemokinų šeimai, kurio gamybą skatina IL-13. Sergant alerginėmis ligomis, pastebima padidėjusi CCL17 koncentracija kraujo serume. Padidėjusi CCL17 raiška, kartu esant padidėjusiam kraujo eozino-filų kiekiui ar FeNO, didina prognozinę vertę, nustatant 2-ojo tipo užde-gimą [54–56].

• Sergant AA, IL-4/IL-13 signalinis kelias yra pagrindinis, o IL-4 ir IL-13 yra vadinami prototipiniais 2-ojo tipo citokinais, kurių perduodami signalai yra vieni svarbiausių atsirandant alerginėms ligoms. IL-4 yra citokinas, sukeliantis Th0 diferenciaciją į Th2 ląsteles. IL-4 kartu su IL-13 skatina B ląsteles gaminti IgE. IL-4 padeda stimuliuoti gleives gami-nančias ląsteles ir fibroblastus, taip didindamas IL-4 įtaką kvėpavimo takų remodeliavimo procesui sergant astma. IL-4 didina VCAM-1 raišką ant endotelio ląstelių. Padidėjusi IL-4 raiška intensyvina eozinofilinį užde-gimą. Dalis IL-4 funkcijų sutampa su IL-13, kuris yra vienas iš svarbiausių citokinų, analizuojant astma sergančių pacientų (ypač AA) 2-ojo tipo uždegimą sergant astma. IL-13 jungiasi prie dalies IL-4 receptorių. IL-13 – tai pleotropinis citokinas, svarbus taurinių ląstelių diferenciacijai, skatina jų hiperplaziją, svarbus ir fibroblastų aktyvinimui, bronchų reaktyvumo padidėjimui, gleivių hipersekrecijai. Laikomas centriniu IgE sintezės reguliatoriumi. IL-13 turi daug pro- ir anti- uždegiminių savybių. Pastebėta koreliacija tarp eozinofilų kiekio ir IL-13 koncentracijos serume [170]. Padidėjusi IL-13 koncentracija serume yra susijusi su IGK atsparia astma

31

[171]. Taigi tyrimai rodo, kad IL-4/IL-13 signalinis kelias yra svarbus įvairių astmos fenotipų gydymo taikinys [170–175].

• Bronchų epitelis, tiesiogiai kontaktuodamas su įkvepiamaisiais aplinkos veiksniais, išskiria daug bioaktyvių medžiagų, dalyvaujančių telkiant ir aktyvinant uždegimines ląsteles. IL-25, IL-33, TSLP laikomi pagrindiniais citokinais, reguliuojančias bronchų epitelio atsaką į pažeidimą. Pastarai-siais metais atsiranda daugiau duomenų apie galimą citovilino ezrino įtaką [21, 44, 45]. Naujausių tyrimų duomenimis, ezrinas sergant astma gali būti kaip vienas ankstyviausių epitelio pažeidimo biožymenų. Ezrino koncen-tracija glaudžiai susijusi su plaučių funkcija (detali citokinų ir citovilino ezrino įtaka astmos patogenezei pateikiama skyriuje 1.5. Bronchų epitelio įtaka astmos patogenezei).

32

2. METODAI

Tyrimas vykdytas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų (LSMUL KK) Pulmonologijos klinikoje, gavus Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidi-mą (Nr. BE-2-13, po papildymo – Nr. BE-2-13/2015) ir Valstybinės duomenų apsaugos inspekcijos leidimą (Nr. 2R-7192 (2.6-1.), 2015 m. gruodžio mėn. 9 d.). Šis tyrimas registruotas ir clinicaltrials.gov puslapyje (identifikacijos numeris NCT03388359).

Tyrimas buvo prospektyvinis, trukęs nuo 2014 m. rūgpjūčio 28 d. iki 2019 m. rūgpjūčio 28 d. Visi sergantieji astma buvo tiriami ir gydomi LSMUL KK Pulmonologijos klinikoje. Sveiki asmenys buvo savanoriai.

Į tyrimą įtraukti tik informuoto asmens sutikimo formą pasirašę tiriamieji. 2.1. Tiriamųjų atrankos kriterijai

Į tyrimą įtraukti nerūkantys 18–65 metų amžiaus vyrai ir moterys, ser-gantys nesunkia, IGK negydyta AA, taip pat serser-gantys SNEA ir sveiki as-menys.

Priklausomai nuo disertacinio darbo uždavinio, pagrindinė tiriamoji grupė buvo pacientai, sergantys nesunkia AA arba SNEA. Kontrolinę grupę vi-suomet atstovavo sveiki asmenys.

AA grupės pacientams liga nustatyta LSMUL KK Pulmonologijos klini-koje, suaugusiojo amžiuje, remiantis būdingais klinikiniais simptomais, pvz., priepuolinis ar nuolatinis švokštimas, kosulys, dusulys, trunkančiais ne trum-piau kaip vienerius metus. Atopija patvirtinta atliekant odos dūrio mėginius (ODM) ir nustatytas įsijautrinimas namų dulkių erkių (D. pteronyssinus) alergenui, patvirtintas anamneze ir simptomų trukme ≥ 1 metai. Astma diag-nozuota bronchų provokaciniu mėginiu metacholinu ar bronchų dilataciniu mėginiu. Trumpo veikimo bronchus plečiančiųjų vaistų, pvz., salbutamolio, vartojimas leistas, tačiau prieš atliekamus tyrimus šių vaistų tiriamasis turėjo būti neįkvėpęs ne mažiau kaip 6 valandas. Asmenys, vartojantys kitus astmos gydymui skiriamus įkvepiamuosius ar geriamuosius vaistus, turintys kliniškai išreikštus nuolatinės alergijos simptomus, 1 mėn. iki tyrimo pradžios persirgę kvėpavimo takų infekcija, į tyrimą nebuvo įtraukti.

Sergantys SNEA asmenys – sunkios astmos diagnozė nustatyta ne trum-piau kaip 1 metai iki įtraukimo į tyrimą (ir liga prasidėjo suaugusiojo am-žiuje), nepavyko pasiekti astmos simptomų kontrolės skiriant dideles IGK dozes, liga paūmėja ne rečiau kaip 2 kartus per metus, nėra atopijos (pagal klinikinius simptomus ir ODM), eozinofilų kiekis kraujyje įtraukimo į tyrimą

33

metu ≥ 0,15 × 109_{/l, arba bent kartą per paskutinius metus nustatytas ≥ 0,30}

× 109_{/l kiekis, paneigus kitas galimas blogos astmos kontrolės ir eozinofilijos}

priežastis.

Į tyrimą nebuvo įtraukti SNEA sergantys asmenys, kurie 1 mėn. iki tyrimo pradžios patyrė ligos paūmėjimą ar vartojo sisteminio poveikio gliukokor-tikoidus, taip pat tie, kuriems anamnezėje jau buvo skirta biologinė terapija astmai gydyti.

Sveiki asmenys (kontrolinė grupė) galėjo dalyvauti tyrime, jei neturėjo nusiskundimų, gretutinės patologijos ir alergijos požymių.

Bendri neįtraukimo kriterijai visiems tyrimo dalyviams: kitos lėtinės kvė-pavimo sistemos ligos; kitos reikšmingos psichinės ar/ir vidaus organų ligos ir būklės; rūkymas, alkoholio ar narkotikų priklausomybė; nėštumas; maiti-nimas krūtimi.

Iš viso ištirti 59 asmenys: 21 AA sergantis asmuo, 17 SNEA sergančių pacientų ir 21 sveikas asmuo. Pirmojo ir antrojo disertacijos uždavinių įgy-vendinimui ištirti 32 asmenys – 8 pacientai, sergantys SNEA, 12 AA ir 12 sveikų asmenų. Trečiajam uždaviniui įgyvendinti ištirti 9 pacientai, sergantys AA ir 9 sveiki asmenys. Šiems pacientams atlikti bronchų provokaciniai mėginiai alergenu. Ketvirtajam uždaviniui įgyvendinti įtraukti 9 sergantys SNEA asmenys, kuriems naujai paskirtas gydymas humanizuotu monoklo-niniu IL-5 antikūnu mepolizumabu.

Tiriamieji, vykdant skirtingus uždavinius, nesikartojo.

Detalūs tiriamųjų demografiniai ir klinikiniai duomenys pateikti skyriuje 3. Rezultatai ir jų aptarimas (3.1.1, 3.2.1, 3.2.2 lentelės).

2.2. Tyrimo eiga

Priklausomai nuo disertacinio darbo uždavinio, tyrimo dalyvio ištyrimas trukdavo nuo 2 iki 3 dienų (tyrimų schemos pateikiamos 2.2.1 paveiksle; tyrimams naudoti metodai detaliai aprašomi skyriuje 2.3. Tyrimų metodai).

34

2.2.1 pav. Tyrimo eiga

(A) Pirmajam ir antrajam disertacinio darbo uždaviniams (pacientai, sergantys AA, SNEA ir sveiki asmenys); (B) Trečiajam disertacinio darbo uždaviniui (pacientai, sergantys AA,

SNEA ir sveiki asmenys; (C) Ketvirtajam disertacinio darbo uždaviniui (pacientai, sergantys SNEA). FeNO – azoto monoksido frakcija iškvepiamajame ore.

*Jeigu odos dūrio mėginiai buvo atlikti 1 mėn. laikotarpyje iki bronchų provokacinio mėginio specifiniu alergenu D. pteronyssinus, iš naujo kartoti nebuvo. AA pacientams odos dūrio mėginiai atlikti likus ne mažiau kaip 1,5 val. iki bronchų provokacinio mėginio metacholinu.

**Atrankos tyrimai – sveikiems ir AA sergantiems asmenims. Normalios spirogramos atveju – bronchų provokacinis mėginys metacholinu (AA sergantys ir sveiki asmenys).