III Risultati

(1)

III

Risultati

Sul totale di 107 isolati da 96 campioni esaminati, siamo stati in grado di identificare le seguenti specie appartenenti al genere

Aspergillus

:

A. fumigatus, A. niger, A. flavus, A. terreus, A. ustus, A, candidus.

Non è stato possibile trarre conclusioni dal campione T2 proveniente da San Piero a Grado (PI), dal campione T22 proveniente da Pistoia, da 2 campioni provenienti da Siracusa (S39 ed S42), e da 11 casi clinici provenienti dal C.R.U.M.A. ovvero dai campioni clinici C7, C8, C9, C10, C14, C18, C19, C20, C21, C22 e C23, in quanto tutti negativi agli aspergilli.

Il resto dei campioni ha offerto alla valutazione sempre uno o più isolati appartenenti al genere

Aspergillus

(Tabella 3.1).

Tabella 3.1

Provenienza Campioni Isolati Campioni negativi

Pisa San Piero a Grado 9 12 1 T2

Pisa San Rossore 4 6 /

Livorno Cruma 11 18 / Pistoia 6 6 1 T22 Siena 28 32 / Casi clinici 24 13 11 C7,C8,C9, C10, C14, C18, C19, C20,C21, C22, C23 Siracusa 14 20 2 S39, S42

(2)

N. 10

A. terreus

, N. 3

A. ustus

, N. 2

A. candidus

(tabella 3.2).

T

abella 3.2

Dai campioni raccolti in Sicilia, tutti ambientali, sono stati isolati N. 1

A. fumigatus

, N. 11

A. niger

, N. 4

A. flavus

, N. 1

A. terreus

e N. 3

A. ustus

per un totale di N. 20 isolati

.

Da campioni ambientali provenienti dalla Regione Toscana sono stati isolati N. 6

A. fumigatus

, N. 36

A. niger

, N. 23

A. flavus

, N. 9

A. terreus

, N. 2

A. candidus

. Dei casi clinici provenienti dal C.R.U.M.A. di Livorno sono stati isolati N. 13

A. fumigatus

per un totale di N. 87 isolati (tabella 3.3). Tabella 3.3 Ambientali 1 11 4 1 3 -A. flavus 23 -A. terreus 9 -A. fumigatus 6 13 A. niger 34 -S28; S29 e da S35 a S46 Ambientali dal T1 ad T27 , da T47 a T72 Clinici da C1 a C24 A. ustus - -A. candidus 2 Sicilia Specie Clinici isolati da campioni

ambientali isolati da campioni

Toscana

A. fumigatus

20 A. niger

45 A. flavus

27 A. terreus

10 A. ustus

3 A. candidus

2 Tot

107 Isolati

(3)

3.1 Gli isolati di

A. fumigatus

da campioni ambientali

Nello specifico in Sicilia

A. fumigatus

è stato isolato 1 volta in un campione (S37) ambientale proveniente da una serra adibita alla coltivazione di zucchine e solo in parte alla coltivazione di rose, dal territorio di Siracusa. Nella regione Toscana invece è stato isolato 6 volte: 1 isolato proviene da un campione ambientale (T26) rappresentato dalle piume di un tordo prelevate al C.R.U.M.A durante i giorni in cui il sottoscritto effettuava tirocinio curriculare nell'anno 2012. Gli altri 5 dei sei isolati toscani provengono dalle campagne senesi da dove per tre volte

A. fumigatus

è stato isolato da campioni prelevati in vigneti (T49, T50, T51), 1 volta da piantagione di mais (T47), 1 volta da piantagione di grano (T48), Tabella 3.4.

Tabella 3.4

Substrato N. campione Provincia

zona/provenienza

Piume Tordo T26 Livorno Cruma

Serra con Rose

e Zucchine S37 Siracusa Piantagione mais T47 Siena Piantagione grano T48 Siena Vigneto T49 Siena Vigneto T50 Siena Vigneto T51 Siena

(4)

3.2 Gli isolati di

A. fumigatus

da campioni di casi clinici

Dei 13 isolati da casi clinici, 3 provengono da 3 substrati (C1, C2, C3) di N.1 cenerino, 1 isolato proviene da 1 campione (C4) prelevato dalla lettiera di N.1 beccapesci. I restanti isolati sono stati identificati a partire da cloache, trachea, o sacchi aerei di N. 8 diversi gabbiani i cui campioni prelevati sono numerati rispettivamente come C5, C6, C11, C12, C13, C15, C16,C17, C24, Tabella 3.5.

Tabella 3.5

3.3 Gli isolati di

A. niger

da campioni ambientali

Dei 45 isolati identificati come

A. niger

, N. 34 provengono da campioni ambientali toscani, N. 11 provengono da campioni ambientali della provincia di Siracusa.

I substrati dai quali è stato possibile isolare

A. niger

sono tra i più variegati, a dimostrazione della ubiquità ambientale degli isolati di

1 cenerino sacchi aerei

C1

1 cenerino trachea

C2

1 cenerino lettiera

C3

1 beccapesci lettiera

C4

gabbiano1 cloaca

C5

gabbiano2 sacchi aerei

C6

gabbiano7 cloaca

C11

gabbiano8 trachea

C12

gabbiano9 sacchi aerei

C13

gabbiano11 cloaca

C15

gabbiano12 cloaca

C16

gabbiano12 sacchi aerei

C17

(5)

questa specie. Sono stati indagati terreni adibiti a coltivazione di alimenti e a fioricoltura, terreni appena lavorati, sabbia, lettiere di varie specie animali tra cui volatili, paglia, alimenti per volatili, vari tipi di piantagione, financo la vinaccia sottoprodotto dei procedimenti di mostificazione e residui di palmento. La tabella 3.6 elenca nello specifico i substrati indagati e da cui è stato possibile l'isolamento di miceti appartenenti alla specie

A. niger

.

Tabella 3.6

Substrato Campione Provincia/zona/provenienza

Terreno T1 Pisa S. Piero a Grado

Prato T6 Pisa S. Piero a Grado

Sabbia umida T7 Pisa S. Piero a Grado

Lettiera cavalli

*

T8 Pisa S. Piero a Grado

Paglia T9 Pisa S. Piero a Grado

Letamaia Cavallo T10 Pisa San Rossore

Lettiera Box T11 Pisa San Rossore

Lettiera Box T12 Pisa San Rossore

Terreno pascolo T13 Pisa San Rossore

Lettiera Gabbiani T14 Livorno Cruma

Lettiera pulcini 20 gg T16 Siena

Terreno rose non

trattate

*

T20 Pistoia

Terreno per vasi di rose

*

T21 Pistoia

Alimento

*

T24 Livorno Cruma

Lettiera Gabbiano

*

T25 Livorno Cruma

Piume Tordo T26 Livorno Cruma

Vinaccia

*

2S8 Siracusa

(6)

Lettiera Gabbiani Cruma T30 Livorno Cruma Lettiera Gabbiani Cruma

*

T31 Livorno Cruma Lettiera Gabbiani Cruma

*

T34 Livorno Cruma

Terreno carciofi S35 Siracusa

Lettiera pecore in disuso

*

S36 Siracusa Serra con Rose e

Zucchine

*

S37 Siracusa

Letamaia Cavallo S38 Siracusa

Serra Garofani

*

S40 Siracusa

Terreno con gigli

coltivati

*

S43 Siracusa

Ricoveri animali vari S44 Siracusa

Letamaia Pecore

*

S45 Siracusa

Letamaia Cavallo S46 Siracusa

Vigneto T55 Siena

Oliveto T56 Siena

Vigneto T57 Siena

Piantagione pomodori T58 Siena

Vigneto T59 Siena

Piantagione insalata T60 Siena

Piantagione cavoli T61 Siena

Insilato mais T63 Siena

Oliveto T64 Siena

Piantagione grano T65 Siena

Oliveto T66 Siena

Piantagione orzo T68 Siena

Vigneto T69 Siena

Oliveto T70 Siena

Lettiera bovini finissaggio T71 Siena

(7)

3.4 Gli isolati di

A. flavus

da campioni ambientali

Come visto in Tabella 3.2 sommariamente,

A. flavus

è stato rinvenuto 27 volte: 23 sono gli isolati offerti dai campioni ambientali di origine toscana, mentre 4 sono gli isolati di

A. flavus

di origine siciliana. Le indagini di laboratorio hanno permesso di evidenziare l'assenza di

A. flavus

dai campioni di casi clinici. Come si può vedere dalla tabella 3.7 la maggior parte degli isolati è stata rinvenuta a partire da campioni ambientali di Livorno per un numero di 7 isolamenti. N. 4 isolati sono stati identificati a partire da campioni della zona di San Piero a Grado (PI) nelle vicinanze dell'ospedale didattico veterinario, altri N. 2 isolati provengono da campioni prelevati nella zona di San Rossore (Pisa). N.4 isolati sono stati recuperati a partire da campioni provenienti dal territorio siciliano. 10 isolati di

A. flavus

invece hanno origine dalle campagne senesi.

Come per

A. niger

i substrati studiati da cui si è potuto procedere con l'isolamento di

A. flavus

sono di diversa natura, talora un singolo substrato ha permesso di identificare, dopo le opportune metodologie di laboratorio, più isolati appartenenti a diverse specie del genere

Aspergillus.

Tabella 3.7. Tabella 3.7

Substrato Campione Provincia /zona/provenienza Insilato triticale T5 Pisa S. Piero a Grado

Prato T6 Pisa S. Piero a Grado

Paglia T9 Pisa S. Piero a Grado

(8)

Terreno pascolo T13 Pisa San Rossore

Lettiera gabbiani T14 Livorno Cruma

Lettiera pulcini 20 gg T16 Siena Lettiera pulcini 11 gg T17 Siena

Lettiera gabbiano T25 Livorno Cruma

Piume tordo T26 Livorno Cruma

Lettiera capinera* T27 Livorno Cruma Lettiera gabbiani

Cruma* T30 Livorno Cruma

Lettiera Cruma T32 Livorno Cruma

Lettiera gabbiani Cruma T34 Livorno Cruma Serra con rose e

zucchine S37 Siracusa

Letamaia cavallo S38 Siracusa

Serra garofani S40 Siracusa

Letamaia pecore S45 Siracusa

Fieno T52 Siena

Lettiera conigliera T53 Siena

Oliveto T54 Siena Oliveto T55 Siena Piantagione alberi da frutto T56 Siena Oliveto T57 Siena Fieno T62 Siena

Fieno bovini finissaggio T72 Siena

(9)

3.5 Gli isolati di

A. terreus

da campioni ambientali

Da quanto è esplicato dalla tabella 3.2 il numero degli isolati di

A. terreus

corrisponde a 10 unità delle quali solo un isolato è stato identificato a partire da campioni provenienti dal territorio siracusano dove il substrato era rappresentato da terreno in riposo. Gli isolati indagati da campioni di provenienza toscana sono stati prodotti a partire da campionamenti effettuati nella zona di Pistoia, dove il sito prescelto era rappresentato da terreno adibito a colture di rose, da un vigneto nel senese, ed ancora dal C.R.U.M.A dove le lettiere per volatili sembrano manifestare particolari condizioni favorevoli per la crescita di varie specie di Aspergilli. Infine un campione di sabbia prossimo all'ospedale di San Piero a Grado ed una lettiera per cavalli sono state le matrici lavorate dalle quali siamo stati in grado di isolare altre N. 2 unità di

A. terreus,

Tabella 3.8.

Tabella 3.8

Substrato Campione Provincia/zona/provenienza

Lettiera cavalli T8 Pisa S. Piero a Grado

Lettiera Gabbiani T15 Livorno Cruma

Foglie Rose trattate T18 Pistoia

Terreno rose trattate T19 Pistoia

Terreno rose trattate T23 Pistoia

Lettiera Cruma

*

T32 Livorno Cruma

Lettiera Cruma T33 Livorno Cruma

Terreno in riposo S41 Siracusa

Vigneto T67 Siena

(10)

3.6 Gli isolati di

A. ustus e A. candidus

da campioni ambientali

N.3 isolati di

A. ustus

sono stati identificati solo a partire da campioni di origine siciliana, mentre due isolati appartenenti alla specie

A. candidus

sono stati isolati solamente da campioni toscani. Le unità di

A. ustus

provengono da campionamenti effettuati in serra dove veniva praticata coltura di rose e zucchine. Si tratta del campione S37 che ci ha regalato la contemporanea possibilità di isolare

A. fumigatus, A. niger, A. flavus,

e come scritto già

A. ustus

.

A. candidus

invece è stato isolato da 2 campioni provenienti rispettivamente da terreno del pistoiese adibito a coltura di rose e da terreno prossimo all'ospedale veterinario di San Piero a Grado (tabella 3.9).

Tabella 3.9

Isolato Sustrato Campione Provincia/zona/provenienza

A.candidus Terreno T3 Pisa S. Piero a Grado

A.candidus Terreno rose trattate T19 Pistoia

A.ustus Serra con rose e zucchine S37 Siracusa

A.ustus Letamaia Cavallo S38 Siracusa

(11)

3.7 Risultati delle prove di sensibilità con metodo della

microdiluizione seriale

(EUCAST E.DEF 9.1)

(12)

La specie più rappresentata dagli isolati che hanno mostrato elevata capacità di resistenza ai dosaggi previsti dal metodo standardizzato quale l'

EUCAST

è indubbiamente

A.niger

(tabella 3.10) con una prevalenza del 31,1 %, ossia di 14 casi resistenti su N. 45

A. niger

isolati e saggiati con il metodo della microdiluizione. I'8,89% (4/45) mostrava al saggio capacità di crescita a dosaggio intermedio pari a [ITZ 4 mg/L] ossia ad un valore superiore al limite di cut-off 2 mg/L, ma inferiore al breakpoint posto a > 4 mg/L in linea con quanto espresso dal

“Mycology Reference Centre Manchester”.

Tabella 3.11

Come descritto già in Tabella 3.6 i casi di resistenza di

A. niger

erano maggiori al Sud dell'Italia dove ben 7 resistenze sono state riscontrate su un totale di 11 isolati da campioni della provincia di Siracusa con una frequenza quindi al Sud pari al 63,3 % dei

niger

isolati su 12 campioni positivi dei 14 campionamenti effettuati (2 non hanno dato risultati

44% 16% 9% 31%

A. niger

% < 2mg/L % 2 mg/L % 4 mg/L % >4 mg/L

(13)

riferibili ad isolati del genere

Aspergillus

). I substrati sono elencati in Tabella 3.15

In Toscana la prevalenza delle resistenze osservate su un totale di 18 isolati si abbassa al 21,87 %: 1 caso di resistenza è stato ottenuto dal campione T8 procurato da lettiera per cavalli a San Piero a Grado, N. 2 casi di resistenze provengono da Pistoia dove i campioni T20 e T21 erano composti da terreno adibito a coltivazione di rose. Le zone statisticamente più significative sono apparse essere i territori del Siracusano come descritto prima e del livornese dai cui campioni 4 isolati su 7 (57%) di

A. niger

hanno mostrato resistenza.

Il 7% di A. flavus

(2/27) si è mostrato resistente in due campioni: T27 e T30 provenienti dal centro di recupero livornese, mentre il 93% degli isolati risultava sensibile a concentrazione di itraconazolo 0,125 ≤ x ≤ 2 mg/L.

Tabella 3.12

Il substrato campionato consisteva nei casi specifici in lettiera di capinera e lettiera di gabbiani.

A chiudere la lista degli isolati resistenti troviamo l'

A. terreus

in misura del 10% (1/10) identificato dal campione T32 proveniente dal C.R.U.M.A.

82% 11% 0% 7%

A. flavus

% < 2mg/L % 2 mg/L % 4 mg/L % >4 mg/L

(14)

Per una panoramica dettagliata nella tabella seguente vengono riportate le frequenze dei risultati ottenuti da ogni singola specie isolata e sottoposta al saggio

EUCAST.

Tabella 3.13

Una dimensione statistica sul comportamento di ciascuna specie nei confronti dell'itraconazolo è descritta in tabella 3.14.

Tabella 3.14

Nella tabella 3.15 vengono elencati i substrati, gli isolati e le

rispettive MIC degli identificati considerati resistenti in vitro e che

potrebbero palesare refrattarietà ai trattamenti farmacologici

indicati.

% < 2mg/L % 2 mg/L % 4 mg/L % >4 mg/L A. fumigatus 90,00 10,00 0,00 0,00 A. niger 44,44 15,56 8,89 31,11 A. terreus 90,00 0,00 0,00 10,00 A. flavus 81,48 11,11 0,00 7,41 A. candidus 100,00 0,00 0,00 0,00 A. ustus 66,67 33,33 0,00 0,00 Isolati <2mg/L 2 mg/L 4 mg/L 8 mg/L >8 mg/L A. fumigatus 18 2 A. niger 20 7 4 4 10 A. terreus 9 1 A. flavus 22 3 2 A. candidus 2 A. ustus 2 1

(15)

Tabella 3.15

Isolato Substrato Campione Provincia Trattamento MIC A.niger Lettiera cavalli T8 Pisa S. Piero a Grado 8 mg/L A.niger Terreno rose non trattate T20 Pistoia 8 mg/L A.niger Terreno per vasi di rose T21 Pistoia > 8 mg/L A.niger Alimento per volatili T24 Livorno Cruma > 8 mg/L A.niger Lettiera Gabbiani Cruma T25 Livorno Cruma > 8 mg/L A.flavus Lettiera capinera T27 Livorno Cruma > 8 mg/L

A.niger Vinaccia S28 Siracusa > 8 mg/L

A.niger Residui Palmento S29 Siracusa > 8 mg/L A.flavus Lettiera Gabbiani Cruma T30 Livorno Cruma > 8 mg/L A.niger Lettiera Gabbiani Cruma T31 Livorno Cruma > 8 mg/L A.terreus Lettiera volatili Cruma T32 Livorno Cruma 8 mg/L A.niger Lettiera Gabbiani Cruma T34 Livorno Cruma > 8 mg/L A.niger Lettiera pecore in disuso S36 Siracusa / > 8 mg/L

A.niger Serra con Rose e Zucchine S37 Siracusa DISERBANTE 8 mg/L A.niger Serra Garofani S40 Siracusa DISERBANTE > 8 mg/L

(16)

A.niger Terreno con gigli coltivati S43 Siracusa / > 8 mg/L A.niger Letamaia Pecore S45 Siracusa 8 mg/L