Data: 9 Marzo Editore: Giulia Ricci, Ludovica Ricci
Autori: Simone Bovi, Federico Caggese, Alessandra Maio, Edoardo Caramelli Modulazione della glicolisi e gluconeogenesi – parte 1
La volta precedente avevamo discusso del bilancio della glicolisi che va guardato con attenzione:
Per ogni molecola di glucosio che viene ossidata, la cellula ottiene 2 molecole di ATP (guadagno netto, dato che ne otterrebbe 4, ma 2 sono state utilizzate) e 2 molecole di NADH:
glucosio + 2ATP + 4ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2piruvato + 2ADP + 4ATP + 2NADH + 2H+ semplificando i termini comuni, si ottiene:
glucosio + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ → 2piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H+
Il NADH darà energia, tramite i suoi protoni, ossidandosi. E’ un’energia recuperabile e abbiamo, in condizioni di aerobiosi, il recupero attraverso il trasporto degli elettroni mentre, in anaerobiosi, tramite la fermentazione. Il piruvato avrà un’importanza strategica, in presenza di ossigeno entrerà nel mitocondrio sotto forma di acetilCoA e innescherà un ciclo di produzione detto degli acidi tricarbossilici o dell’acido citrico. Non è un diagramma di flusso univoco. Nella cellula quando c’è il piruvato, a seconda della situazione energetica del soggetto, questo prende varie strade. Può andare a produrre glucosio, quindi gluconeogenesi. Un soggetto che mangia tanto e si muove poco di piruvato ne avrà tanto e a quel punto gli conviene fare glucosio “e arrotondare”. Un soggetto che fa tanto sport e mangia il giusto andrà verso la produzione di energia. Un interessante studio mostra come effettivamente non è il mero esercizio fisico che mantiene in forma ma il bilancio perfetto di quello che introduco in termini di supplementi ossidabili e quello che faccio in termini di consumo energetico. L’acetilCoA che deriva dall’azione di un enzima, ovvero la piruvato deidrogenasi, avrà due effetti uno a feedback negativo sull’enzima che serve a produrlo mentre se in eccesso andrà ad innescare la via della gluconeogenesi quindi trasformare l’accumulo di piruvato in glucosio.
L’acetilCoA controlla la bidirezionalità del sistema. L’eccesso di AcetilCoA, in mancanza di consumo energetico, blocca la via del piruvato e induce la formazione di glucosio. La regolazione della glicolisi è una fine evoluzione, la trascrizione dei geni relativi alle 3 tappe di comando: esochinasi, fosfofruttochinasi, piruvatochinasi sono regolati da insulina e glucagone. L’insulina va a regolare la trascrizione (per trascrizione si intende: ormone proteico, recettore accoppiato a proteina G, attivazione dell’adenilato ciclasi, chinasi, liberazione di un fattore di trascrizione che va nel nucleo, innesca la sintesi proteica ecc…) dei geni che codificano per gli enzimi delle tappe di comando della glicolisi. Il Glucagone invece ha effetto opposto: downregola l’espressione genica di questi enzimi di comando della glicolisi. Questo tipo di regolazione è lenta non è immediata. L’andamento della glicolisi dipende dalla disponibilità di substrato. Abbiamo anche una regolazione allosterica di alcuni enzimi e per fosforilazione.
Nella reazione 1: l’enzima coinvolto è esochinasi, di esochinasi ce ne sono di 2 tipi con diverse costanti di affinità per il substrato e diversa localizzazione; il glucosio 6 fosfato va a regolare l’attività dell’ esochinasi. Contemporaneamente la fosfofruttochinasi va ad essere regolata da quello che è l’andamento di produzione energetica del ciclo degli acidi tricarbossilici e da quella che è la disponibilità di ATP prodotto dalla glicolisi. La piruvatochinasi viene regolata dall’acetilCoA. La regolazione della glicolisi in primis avviene per disponibilità del substrato poi c’è una regolazione più fine condotta dai tre enzimi.
L’esochinasi e la glucochinasi sono lievemente diverse:
esochinasi – bersaglio: gli esosi – è ubiquitaria
glucochinasi – bersaglio: il glucosio – fegato e cellule Beta del pranceas.
La costante di affinità è diversa: l’esochinasi lavora con tracce di esoso mentre la glucochinasi lavora con abbondanza di glucosio.
Con un aumento significativo di glucosio ematico Il fegato va a sottrarlo agli altri tessuti, come il muscolo, e contemporaneamente la cellula Beta del pancreas si attiva.
L’esochinasi non è inducibile mentre la glucochinasi-4 è inducibile. Si trova nel fegato e viene indotta con l’aumento del glucosio ematico. Il significato clinico dell’alterazione delle esochinasi sarà la rottura delle cellule ematiche (emazie) dovuta ad un mancato rifornimento energetico della pompa sodio potassio (che è il sistema che consuma più ATP all’interno della cellula). Sia l’esochinasi che la glucochinasi servono a mantenere la concentrazione di glucosio intracellulare adeguata. L’esame della glicemia a digiuno del paziente serve a valutare l’alterazione del metabolismo del glucosio. Se c’è un eccesso di glucosio ematico il pancreas libera l’insulina che fa entrare il glucosio nelle cellule
tramite il recettore glut-4. Inoltre l’insulina va a stimolare (vedremo come) la formazione di glicogeno a livello epatico come accumulo di glucosio. Nel momento in cui abbiamo degli stimoli che inducono una diminuzione della glicemia il glucagone stimola la demolizione di glicogeno a livello epatico e la liberazione di glucosio.
Vediamo nel dettaglio come vengono regolate l’esochinasi in genere e la glucochinasi-4 che ha come substrato preferenziale il glucosio.
La esochinasi 1:
ha una costante di affinità di 0,1 mM (100 volte più bassa della glucochinasi) e pertanto reagisce con altri monosaccaridi;
è presente in tutte le cellule;
è indipendente dall’insulina;
è inibita dal glucosio-6-fosfato.
La glucochinasi:
è presente solo nel fegato;
reagisce solo col glucosio;
ha una costante di 10 mM;
è inducibile dall’insulina;
non è inibita dal glucosio-6-fosfato (quindi una volta che è stata indotta continua a lavorare).
Questa slide ci mostra le differenze tra le Vmax delle esochinasi in relazione con la concentrazione di glucosio ematico a digiuno rappresentato dalla colonna centrale. Prestiamo ora attenzione alla Km della glucochinasi e della esochinasi. La glucochinasi a riposo è tendenzialmente inattiva perché il glucosio non può essere sottratto al sistema, mentre invece l’esochinasi capta qualsiasi cosa che transita nei suoi pressi.
L’esochinasi 1 deve assicurare la captazione di qualsiasi traccia di glucosio per convogliarlo verso il cervello o le emazie; inoltre ha una bassa Vmax, quindi sarò sicuro che produrrà solo il glucosio- 6-fosfato che serve, anche perché è da esso inibita allostericamente. Ciò fa sì che nei tessuti ci sarà sempre una quantità di glucosio-6-fosfato adatta al consumo senza che questa molecola finisca per accumularsi.
La glucochinasi invece viene prodotta in condizioni di iperglicemia, in modo da incrementare la produzione di glucosio 6 fosfato che, essendo così tanto, sarà indirizzato alla biosintesi del
glicogeno ed espleterà la sua funzione di intermediario chimico della glicolisi. Non viene mai inibita dalla glucosio-6-fosfato (questo vuol dire che più mangi più accumuli).
La glucochinasi è però inibita da una proteina regolatrice specifica del fegato che va a praticamente a bloccare l’enzima reversibilmente:
il glucosio entra nell’epatocita attraverso un trasportatore del tipo glut-2 (cioè insulino-
indipendente). Questo glucosio può essere poi trasformato in glucosio-6-fosfato, poi in fruttosioi-6- fosfato e così via.. L’esochinasi-4 però non viene inibita, anzi viene quasi favorita
se negli epatociti il glucosio è altamente concentrato sposta l’equilibrio verso la sua forma legata alla glucochinasi, spingendola a separarsi dalla sua proteina regolatrice;
se la concentrazione epatica di glucosio è bassa il fruttosio-6-fosfato in circolo va a favorire la formazione di questo dimero “esochinasi-proteina regolatrice”.
Questo dimero non sarà mai conservato nel citoplasma, ma verrà conservato nel nucleo. Sarà l’eccesso di glucosio a far sì che il dimero si scinda e che la esochinasi torni ad espletare il suo lavoro.
Questo domino avviene perché come detto in precedenza il fegato non si può permettere di
“rubare” il glucosio e si è venuto quindi a creare questo geniale meccanismo, secondo il quale per evitare di rubare glucosio al sistema non solo la lego a una proteina regolatrice, ma viene anche cambiato il compartimento in cui questa molecola viene conservata.
FOSFOFRUTTOCHINASI.
“Io dico sempre che un sistema così sofisticato non può permettersi che uno stesso prodotto o intermedio inibisca tutte le tappe di comando. Le tappe di comando devono essere inibite da un inibitore specifico in maniera che non si crea confusione. Perché un enzima si può confondere!”
La fosfofruttochinasi lavora come un tetramero in un certo senso simile all’emoglobina: esiste in una forma tesa e una forma rilassata e l’inibitore sarà l’ATP che è un regolatore allosterico in due siti di legame distinti. L’ATP è il substrato inibitore della fosfofruttochinasi su due siti distinti, mentre invece ADP o AMP e fruttosio-2,6-bifosfato rimuovono gli effetti inibitori dell’ATP e sono dei veri e propri attivatori allosterici.
ATP -> ho già energia -> non devo promuovere glicolisi -> inibisco fosfofruttochinasi AMP, ADP, fruttosio 2,6 bifosfato -> non ho energia -> devo promuovere glicolisi -> attivo fosfofruttochinasi
L’ATP agisce spostando l’equilibrio dalla forma T alla forma R. Quindi se la curva è regolata allostericamente somiglierà moltissimo a quella dell’emoglobina, fino a diventare quasi iperbolica quando non ci sono inibitori. Siccome i siti di legame per AMP e ADP sono diversi da quello per l’ATP, l’enzima “risuona” tra le conformazioni T e R andando a regolare la velocità corretta per fosforilare il substrato.
(l’ATP lega di preferenza lo stato T, mentre la fruttosio-2,6 bifosfato lo stato R).
Quindi vediamo che la reazione è
[ATP + D-fruttosio 6-fosfato = ADP + D-fruttosio 1,6-bifosfato]
(fonte wikipedia che dalla registrazione non se capisce che dice)
Altro regolatore importante è il citrato. È un intermedio importante per quella che è l’ossidazione aerobica del Piruvato, e diventa un inibitore allosterico della fosfofruttochinasi. Può essere
considerato una sorta di mediatore cellulare: i cicli “si parlano tra di loro”, quindi se il ciclo di Krebs sta lavorando bene e tanto, va a fare in modo che siano rallentate le reazioni precedenti. Quindi quando alti livelli di citrato si accumulano perché non sto consumando ATP, e quindi ho alti livelli di ATP perché mi trovo a riposo, lo stesso citrato andrà a inibire la funzionalità del ciclo di Krebs perché le necessità energetiche sono soddisfatte e rallenta la demolizione del glucosio attraverso glicolisi. In pratica il Citrato aumente l’effetto inibitorio dell’ATP, così da ottenere un blocco più rapido possibile.
Nel fegato il principale regolatore allosterico della fosfofruttochinasi è il fruttosio 2,6 bifosfato che attiva la fosfofruttochinasi. Il ruolo chiave di questo enzima è il fatto di essere un momento
coordinato della regolazione di glicolisi e gluconeogenesi e pertanto il ruolo del suo regolatore allosterico è quello di decidere se la reazione va spostata in favore della glicolisi o della
gluconeogenesi. Se c’è tanto fruttosio-2,6-bifosfato l’enzima è attivato (stimola la glicolisi e inibisce la gluconeogenesi) ; se ce n’è poco l’enzima non è attivato (stimola la gluconeogenesi e inibisce la glicolisi).
Oltretutto anche l’insulina e il glucagone hanno ruoli antagonisti sulla funzionalità di questo enzima.
Insulina -> promuove espressione di fosfatasi -> attivazione fosfofruttochinasi
Glucagone -> promuove espressione di fosfochinasi -> inattivazione fosfofruttochinasi
La cosa importante da sottolineare è che non è il Glucagone che inibisce la fosfofruttochinasi, ma induce l’espressione genica di chinasi le quali poi a loro volta posso fosforilare tutti i substrati fosforilabili, tra cui anche questo enzima.
Poi arriva l’insulina:
Qui è interessante ritornare a quella frase d’inizio lezione: "ci vogliono giorni per stabilire chi vince", ovvero ci vuole tempo per compiere questa serie di processi (defosforilazione del pattern, indurre espressione genica etc), non può essere una regolazione istantanea.
Quando vi dicono “devi switchare il metabolismo così dimagrisci”, la ragione sta che passiamo da fosforilazione a defosforilazione (che sono delle reazioni statiche).
Ovviamente quando ho questa situazione mi trovo che ho bloccato la glucanogenesi, che avviene solo in un verso, e la glicolisi avviene soltanto in un altro verso.
La regolazione della piruvato kinasi:
- è allosterica e covalente nel fegato - è solo allosterica negli altri tessuti.
Nel fegato ho il glucagone che incontra la piruvato kinasi, la quale qui viene fosforilata in piruvato kinasi inattiva.
Loa piruvato kinasi di tutti gli altri tessuti in più ha effettori negativi che bloccano la piruvato chinasi quali:
-acetilcoenzima A,
-acidi grassi a lunga catena, -amminoacidi.
Il fruttosio-1-6-bifosfato invece, se si accumula, va ad avere un effetto allosterico positivo sulla piruvato kinasi.
La piruvato chinasi in questo ambito ha due regolatori:
-Alta concentrazione di glucosio epatico, ho un passaggio a quella che è la piruvato kinasi defosforilata e quindi più attiva
-Bassa concentrazione di glucosio epatico, ho una piruvato kinasi fosforilata meno attiva.
Un deficit di piruvato kinasi provoca malattia emolitica (autosomica recessiva)
La piruvato chinasi serve per mantenere attive le vie che producono energia (cioè ATP), se essa non è sufficiente, si apre la pompa sodio-potassio, e la membrana delle emazie si deforma.
SUBSTRATI GLICOLITICI ALTERNATIVI AL GLUCOSIO
Un carboidrato alternativo della dieta è da subito, nella vita del neonato, il lattosio (tramite il latte materno).
[Bisogna sapere come si scrivono e da cosa sono composti lattosio e fruttosio].
Ve ne sono poi altri quali il maltosio (dimero glucosio-glucosio) e il saccarosio (dimero glucosio- fruttosio). Ovviamente parte del lattosio e del saccarosio e tutto il maltosio, una volta scissi dalle disaccaridasi, mi danno il glucosio.
La metà del lattosio materno è composto da galattosio, che diventerà qualche cosa (per esempio glucosio-1-fosfato) per poi andare a diventare glucosio-6-fosfato.
Lo stesso discorso vale per il fruttosio: esso entra nella cellula come fruttosio-6-fosfato e deve diventare in qualche modo gliceraldeide-3-fosfato; inoltre esso può modificarsi da fruttosio-6-fosfato a fruttosio-1-fosfato, quindi questo oggetto qui è un pochino più pericoloso, va maneggiato con cura perché si va ad inserire nella cascata in una parte molto bassa.
In più esso deriva anche dal glicerolo-3-fosfato, che deriva dalla scissione di acidi grassi.
In conclusione i substrati glicolitici che possono arrivare a piruvato sono in gran parte costituiti da glucosio (90%), ma tutto il resto può venire da fruttosio, galattosio e glicerolo.
L’intolleranza al lattosio è comune soprattutto ad alcune popolazioni, come quella africana, nella quale ad una certa età avviene la soppressione o disfunzione genica della lattasi a livello dell’orletto a spazzola degli enterociti (esistono due alleli per la lattasi).
Per intolleranza al lattosio si intende quella condizione in cui il soggetto non è capace di scindere il legame beta-1-4 tra galattosio e glucosio.
Se tale rottura non avviene, il lattosio finisce nelle feci e, poiché non può essere assorbito in quanto non c’è un trasportatore per il disaccaride, sarà utilizzato dai batteri mediante un’ossidazione che produrrà CO2, con conseguente gonfiore dell’intestino.
Esistono due motivi biologici per cui ciò avviene:
1. l’enzima scompare dall’orletto a spazzola per motivi genetici, cioè non è più espresso perché c’è una metilazione e, quindi, finisce l’espressione di quell’enzima;
2. vi è una sofferenza dell’orletto a spazzola per altre ragioni, ad esempio dovuta al fatto che le proteine non vengono ben sintetizzate, dunque l’enterocita soffre e non produce abbastanza lattasi.
Negli europei si verifica una persistenza di questo sistema (a differenza di altre popolazioni).
Quando, invece, esiste un polimorfismo per il gene della lattasi (es. una citosina che diventa timina), compare un sito di legame per la proteina che permette che il gene venga mantenuto tanto o meno.
Com’è possibile che il galattosio diventi glucosio-6-fosfato?
Il galattosio-1-fosfato reagisce con un UDP-glucosio, ciò fa si che questa uridina difosfato (UDP) venga scambiata con quella del galattosio, che a sua volta diventa UDP-galattosio.
Quest’ultimo può essere trasformato da un’epimerasi in glucosio-UDP, il quale scambia con il galattosio-1-fosfato, diventando glucosio-1-fosfato e da qui glucosio-6-fosfato.
L’epimerasi che trasforma il galattosio in glucosio funziona solo se il galattosio è legato ad un UDP (ceduto da un glucosio-UDP). Scambiandosi questo carrier il galattosio diventa soggetto capace di subire l’azione di un’epimerasi, la quale agisce cambiando la posizione dell’ossidrile sul carbonio 4 e, a questo punto, ho la formazione di glucosio-1-fosfato.
Per galattosemia si intende la concentrazione citoplasmatica di lattosio dovuta all’incapacità di scindere il galattosio e la mancanza dell’enzima galattosio-1-uriditil-transferasi, cioè l’enzima che serve per digerirlo. In questo caso non si può utilizzare lattosio nella dieta.
Alla nascita si può compiere un test per vedere se c’è questo tipo di patologia, la quale risulta abbastanza pesante in quanto si forma un accumulo di galattosio che può causare danni cerebrali.
Come entra il fruttosio nella glicolisi?
Il fruttosio nella glicolisi entra come fruttosio-1-fosfato.
Ci sono due enzimi (fosfofruttochinasi e aldolasi) che possono mancare e dare patologie molto rare:
nella prima si riscontrano grandi quantità di fruttosio nelle urine (fruttosuria)
la seconda è caratterizzata da una mutazione dell’enzima l’aldolasi-b (che trasforma la gliceraldeide), è più problematica in quanto vi è un accumulo di fruttosio-1-fosfato, di conseguenza si hanno problemi epatici (cirrosi epatica) e bisogna eliminare il fruttosio e il saccarosio dalla dieta.
[In ogni punto si può verificare un accumulo di qualche sostanza, il che è sempre problematico.]
Le principali differenze metaboliche fra il glucosio e il fruttosio.
Il fruttosio tende ad essere un monosaccaride pericoloso per l’uomo a causa dei deficit regolatori rispetto al glucosio, infatti nel metabolismo del fruttosio manca la regolazione ormonale dell’insulina e la regolazione allosterica della fosfofruttochinasi. Perciò accade che per grandi immisioni di fruttosio si va a formare tanto acetil-CoA (che porta colesterolo), lattato (che acidifica), acidi grassi e trigliceridi, lipoproteine LDL e HDL.
L’assunzione di fruttosio, pertanto, non dovrebbe superare i 7-10 g/die e possibilmente solo attraverso un veicolo naturale, ovvero la frutta. Infatti attraverso essa vi è una lenta disponibilità e rilascio essendo il fruttosio “intrappolato” nelle fibre.
I DESTINI DEL PIRUVATO
Il piruvato può andare incontro a diversi processi:
fermentazione lattica anaerobia che andrà a consumare due NAD+ ridotti precedentemente;
ossidazione aerobia nel ciclo degli acidi tricarbossilici;
fermentazione alcolica con formazione di etanolo.
Nella fermentazione lattica due molecole di piruvato, con consumo di 2 NAD+ ridotti che andranno a essere ossidati, portano ad una molecola di acido lattico con ∆G discretamente favorevole perchè c’è stata un’ossidazione di NAD+ ed una riduzione del substrato.
In assenza di mitocondri la glicolisi è l’unica fonte energetica: infatti nel muscolo a riposo utilizza il 50% di tutto l’ossigeno arriva al 90% durante l’esercizio fisico.
La latticodeidrogenasi (LDH) è un enzima NADH-dipendente che trasforma il piruvato in lattato; di essa esistono vari isoenzimi, ovvero enzimi che riconoscono un substrato con diverse affinità.
La lattatodeidrogenasi nel muscolo cardiaco (dove non deve esserci un accumulo di acido lattico) catalizza fortemente l’ossidazione di lattato in piruvato mentre in altri distretti corporei vi sono isoenzimi che trasformano tutto il piruvato possibile in lattato andando ad ossidare NADH a NAD+.
Il lattato prodotto nel muscolo in mancanza di ossigeno finisce nel circolo sanguigno e da lì nel fegato dove viene trasformato in acido piruvico. Questo viene avviato alla formazione di glucosio (con consumo di 6 ATP) che liberato nel sangue andrà a
rifornire il muscolo. Questo processo è detto ciclo di Cori.
Particolare il processo glicolitico negli eritrociti, dove parallelamente ad esso avviene la via per la produzione di 2-3,difosfoglicerato. Dal glucosio infatti si ottiene 1-3,difosfoglicerato, dal quale è possibile formare il 2-3,difosfoglicerato attraverso una mutasi. Questa via è molto importante in quanto il 2-3,difosfoglicerato è un inibitore allosterico per l’emoglobina in presenza di H+ per regolare l’affinità di questa con l’ossigeno. Addirittura il 25% del glucosio immesso negli eritrociti viene utilizzato per formare 2-3difosfoglicerato, tanto che la presenza di quest’ultimo è in rapporto di 1:1 con l’emoglobina.
LA GLICOLISI NELLE CELLULE TUMORALI
Bisogna considerare il tumore come un tessuto proliferativo, paragonabile ad un tessuto embrionale in crescita che quindi tende ad introdurre grandi quantità di glucosio, cercando di ottenerne energia con la massima velocità possibile, a discapito del rendimento.
Nelle cellule tumorali c’è un aumento di tasso glicolitico rispetto alle cellule sane. Tale dato è stato ottenuto attraverso la misurazione della formazione di CO2 delle cellule tumorali, notando che esse producono energia assumendo glucosio a velocità superiore rispetto alle altre cellule. Tuttavia, tanta è la velocità (e voracità) che il glucosio non viene utilizzato in toto per ottenere energia con alto rendimento: infatti, gran parte andrà a formare lattato, mentre la restante parte andrà incontro a glicolisi aerobia.
I fattori che portano la cellula alla glicolisi aerobia sono dei fattori di trascrizione,
Attraverso queste scoperte è stato possibile introdurre due innovazioni molto importanti in ambito oncologico:
farmaci che lavorano sulla glicolisi nella cellula tumorale, modificando tale processo a discapito di questa;
traccianti come il fluorodesossiglucosio, sostanza simile al glucosio e quindi introdotta in grande quantità nelle neoplasia, che emettendo radiazioni beta permette attraverso la diagnostica per immagini di individuare con precisione le zone colpite dal tumore.
