Impieghi delle cellule
staminali in laboratorio
Perchè le cellule staminali sono importanti?
-Interesse per la clinica
-In test farmacologici
-In studi sullo sviluppo
- IN CLINICA: per la loro capacità di svilupparsi in tutti i tipi cellulari, rappresentano una sorgente potenzialmente illimitata di tessuti.
- IN TEST FARMACOLOGICI: per lo studio di nuovi farmaci. La capacità di crescere specifici tipi cellulari offre la possibilità di testare composti chimici e farmaci.
Ciò rappresenterebbe una scorciatoia per testare rapidamente centinaia di migliaia di molecole che oggi richiedeno tempi molto lunghi.
-IN STUDI SULLO SVILUPPO: le fasi più precoci dello sviluppo embrionale dell’uomo sono state difficili o impossibili da studiare. Le cellule embrionali staminali umane offrono la possibilità di conoscere eventi dello sviluppo che non possono essere studiati direttamente nell’uomo. La conoscenza di questi eventi ha importanza clinica, per la prevenzione o il trattamento di difetti dello sviluppo. Per esempio, test farmacologici su cellule staminali embrionali umane potrebbe aiutare a ridurre il rischio di difetti congeniti causati da farmaci.
In laboratorio, le CELLULE STAMINALI EMBRIONALI possono proliferare
indefinitamente ed essere indotte a differenziare in vari tipi cellulari
•A meno che le cellule staminali embrionali non
vengano combinate con embrioni, non possono dare origine ad un intero organismo.
•Queste cellule embrionali non sono esse stesse embrioni.
Una cellula staminale si dice PLURIPOTENTE
se ha la capacità di dare origine a tipi di cellule che si sviluppano da tutti e tre i foglietti embrionali (mesoderma,
endoderma ed ectoderma).
strato “feeder” di fibroblasti di topo
bloccati
nuovo strato feeder
coltura stabile di cellule staminali cellule staminali dissociate e ripiastrate blastocisti in coltura
massa cellulare interna isolata morula
Cellule staminali embrionali in coltura
strato feeder
di fibroblasti
cellule staminali indifferenziate
Le cellule ES possono essere mantenute nello stato indifferenziato…
Induzione del differenziamento di cellule staminali
embrionali in coltura
Embrione sviluppato in vitro a partire da
cellule staminali embrionali di topo
…o essere indotte a differenziare,
cambiando le
condizioni di coltura
The effect of matrix composition on embryonic stem cell differentiation
Collagen matrices
Embryoid bodies
Embryoid bodies grown in: • Collagen 2.4 and 1.2
mg/ml
• Collagen + Fibronectin • Collagen + Laminin
PECAM1 expression Cardiac differentiation
Collagen + Fibronectin
Battista et al., Biomaterials 2005
Induzione del differenziamento di cellule staminali
embrionali in coltura
Induzione del differenziamento di cellule staminali
embrionali in coltura
Blastocisti umana con massa cellulare interna e trofoectoderma.
Nel 1998, i ricercatori sono stati per la prima volta capaci di isolare CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI DA EMBRIONI UMANI (blastocisti) e di crescerle in coltura.
Usando 14 blastocisti ottenute da embrioni
soprannumerari prodotti da fecondazione in vitro, un gruppo di biologi dell’ Università di Wisconsin-Madison ha stabilito 5 linee indipendenti di cellule staminali.
Gli embrioni usati all’Università di Wisconsin-Madison erano
stati prodotti originariamente per trattare casi di infertilità
e vennero donati, dopo consenso informato, da coppie che
non volevano più che gli embrioni venissero impiantati.
In tutte le cliniche dove viene attuata la fecondazione in
vitro, gli embrioni soprannumerari, se non vengono donati
ad altre coppie sterili o per scopi di ricerca, vengono
distrutti.
In pochi anni dalla scoperta delle cellule embrionali
staminali umane, sono emerse numerose evidenze
della loro capacità di dare origine a quasi tutte le cellule
specializzate del corpo e, pertanto, di generare cellule
per sostituire un’ampia gamma di tessuti e organi, quali
cuore, pancreas e sistema nervoso. Pertanto, le cellule
staminali umane fanno sperare nella possibilità di
riparare o sostituire cellule o tessuti danneggiati da
varie patologie.
La sperimentazione con le hESC (human embryonic stem cells) è cominciata solo nel 1998.
Inoltre i fondi Federali per ricerche sulle hESC sono stati messi a disposizione solo a partire dal 2001, dopo la decisione del presidente Bush di finanziare tale tipo di ricerche. Pertanto, la ricerca sulle hESC è ancora nelle sue prime fasi.
Fino ad oggi nessuna malattia è mai stata curata con le cellule
staminali embrionali umane
Problemi di base da superare per l’utilizzo delle
cellule staminali embrionali
• COME DIRIGERE IL DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE SECONDO
VIE SPECIFICHE DI DIFFERENZIAMENTO?
per es. tutte le cellule in cellule muscolari o tutte in cellule nervose;
uso di diversi “cocktail” di fattori di crescita.
•COME SUPERARE IL RIGETTO IMMUNITARIO?
per es. alterando i geni di istocompatibilità; clonaggio terapeutico.
•COME CREARE UN ORGANO?
Cioè come combinare tipi cellulari diversi in strutture
tridimensionali?
Tuttavia, l’uso di hESC a scopo
terapeutico presenta molti problemi etici ed è ritenuta illegale.
cordone
ombelicale
midollo
osseo
tessuto adiposo
pannicolo adiposo
infrapatellare del
ginocchio
Le maggiori informazioni sulle cellule staminali adulte vengono da studi sulle cellule staminali emopoietiche isolate dal midollo osseo e dal
sangue.
Queste cellule sono state ampiamente studiate ed applicate terapeuticamente per varie patologie.
Le cellule staminali adulte, come quelle del midollo osseo, che danno origine alle cellule del sangue (chiamate hematopoietic stem cells o HSCs), sono al momento attuale, le uniche cellule comunemente usate per scopi terapeutici.
Il trasferimento di HSCs tramite trapianti di midollo osseo è una pratica clinica che viene applicata da 40 anni. Oggi si usano tecniche più
avanzate per prelevare le HSCs e per trattare patologie quali leucemie, linfomi e anemie.
L’utilità clinica delle cellule staminali adulte è stata dimostrata anche nel trattamento di altre patologie, tra le quali il diabete e tumori del rene. Tuttavia, questi studi sono stati condotti su di un numero abbastanza limitato di pazienti.
Una singola MSC posta in coltura in vitro può auto rinnovarsi per produrre una popolazione clonale di cellule capaci di formare interi organi in vitro, contenenti vari tipi cellulari.
La PLASTICITÀ è la capacità di una cellula staminale adulta di un tessuto di
generare tipi cellulari specializzati di altri tessuti. Un esempio di plasticità è
quello di cellule staminali adulte di midollo osseo, che, sotto particolari
condizioni sperimentali, generano cellule neuronali e altri tipi di cellule
che si trovano nel cervello. PLASTICITÀ
Il concetto di PLASTICITÀ delle cellule staminali adulte è un concetto nuovo e il fenomeno non ancora completamente compreso. Alcuni dati sperimentali suggeriscono che, dato un ambiente
appropriato, alcune cellule staminali adulte sono capaci di venire “riprogrammate” a generare cellule specializzate caratteristiche di tessuti differenti.
STUDI CLINICI sulle CELLULE STAMINALI ADULTE
Una serie di studi in animali hanno dimostrato che
cellule staminali adulte possono riparare il tessuto
miocardico infartuato, sviluppando nuovi vasi sanguigni
e cellule muscolari cardiache.
Riparo del muscolo cardiaco per mezzo di cellule staminali adulte
cellule muscolari cardiache danneggiate
le cellule staminali aiutano
a rigenerare il muscolo
cardiaco
Cellule staminali adulte
del topo vengono iniettate
direttamente nel muscolo
della parete del ventricolo
Le cellule staminali inducono la formazioni di nuovi vasi sanguigni nel muscolo cardiaco danneggiato e la proliferazione della
vascolatura esistente.
cellule muscolari cardiache danneggiate
Cellule staminali adulte
umane di midollo osseo
vengono iniettate nella
vascolatura della coda di
Nel 2001, questo fenomeno è stato dimostrato anche nell’uomo: in
alcuni pazienti, l’iniezione di cellule staminali autologhe ha migliorato il flusso ematico nella regione
infartuata.
Altri pazienti sono stati trattati con cellule prelevate da biopsie muscolari
Cellule staminali adulte dal midollo osseo o dal tessuto adiposo possono dare origine a muscolo, cartilagine, osso, dove si sono dimostrate capaci di riparare fratture.
CELLULE STAMINALI IN INGEGNERIA DEI TESSUTI
cellule
staminali
epidermide
Espansion
e ex vivo
scaffold
semina con
fibroblasti dermici
sostituto dermico
riparo di lesioni
profonde della
pelle
midollo osseo
cellula
staminale
mesenchimale
espansione ex vivo
trapianto in vivo
adesione a scaffold di
idrossiapatite/fosfato di calcio
cellule
staminali
embrionali
cellule
staminali
adulte
pluripotenti
facili da maneggiare
proliferazione
illimitata
non tumorigeniche
non presentano
problemi etici
sviluppo di tumori
proliferazione
limitata
problemi etici
potenziale
differenziativo più
limitato (?)
sono poche
vantaggi
Le cellule staminali adulte devono essere isolate dalle cellule
differenziate dello stesso tessuto
Marcatura attraverso anticorpi fluorescenti
Terapia con cellule staminali
❑
Trapianto
di
cellule
staminali
nell’area
danneggiata
❑
Stimolazione
delle
cellule
staminali
del
paziente
Fino ad oggi, questa è la
terapia
che
ha
dato
maggiore successo
Recentemente
si
sta
cercando
di
sviluppare
nuove strategie per il
“recruitment” delle cellule
staminali del paziente.
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
• Nel 2006, due riceractori dell’Università di Kyoto dimostrarono che
inserendo nel genoma copie attivate di quattro geni codificanti alcuni
fondamentali fattori di trascrizione, quasi ogni cellula di un organismo
murino adulto poteva essere trasformata in una cellula staminale
pluripotente indotta (induced pluripotent stem cell, iPSC) con la
pluripotenza di una cellula staminale embrionale.
• I geni in questione erano Sox2 e Oct4, c-Myc e Klf4.
• Sox2 e Oct4 sono capaci di attivare Nanog e altri fattori che
stabiliscono la pluripotenza e bloccano il differenziamento.
• c-Myc, aprendo la struttura della cromatina, rende i geni accessibili a
Sox2, Oct4 e Nanog.
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC)
• Analogamente alle ESC, le iPSC possono essere propagate a tempo
indefinito e, se poste in coltura, possono formare tipi cellulari
rappresentativi di tutti e tre i foglietti germinativi.
• Sebbene le iPSC siano funzionalmente plutipotenti, esse sono
particolarmente adatte a generare i tipi cellulari da cui deriva la
cellula somatica di provenienza.
Applicazione delle iPSC nello studio dello
sviluppo e delle malattie dell’uomo
Al momento esistono quattro principali usi delle iPSC in medicina:
1. generare iPSC specifiche per il paziente, al fine di studiarne la patologia;
2. combinare la terapia genica con le iPSC specifiche del paziente, per
curare la patologia;
3. utilizzare cellule progenitrici derivate dalle iPSC specifiche per il paziente,
in terapie basate sul trapianto cellulare senza complicazione del rigetto
da parte del sistema immunitario;
4. usare cellule differenziate derivate dalle iPSC specifiche per il paziente, ai
fini della selezione dei farmaci più opportuni per la terapia.
Generazione di modelli di malattie multigeniche umane mediante le iPSC
Malattie dello spettro dell’autismo.
Una possible strategia è stata quella di generare iPSC dal maggior numero di bambini affetti dallo spettro dell’autismo, per acquisire una comprensione più globale dei geni ad esso associati.
Sclerosi laterale amiotrofica (SLA).
Le iPSC derivate da pazienti possono essere indotte a differenziare in motoneuroni e in tipi cellulari non neuronali, come gli astrociti, anch’essi coinvolti nella SLA. I ricercatori hanno utilizzato queste cellule per testare vari composti farmaceutici che migliorassero la salute dei motoneuroni.
Cellule staminali: speranza o illusione?
Da considerare: • Problemi etici • Costi elevati • Problemi legali
Trials clinici basati su cellule staminali
Clinicaltrials.gov
International society for stem cell research
www.isscr.org Per approfondire…
