LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA
Veterinarijos fakultetas
Brigita Aurėja Maračinskaitė
STRESINĖS LEUKOGRAMOS IDENTIFIKAVIMO ŠUNIMS
REIKŠMĖ RUTININĖJE DIAGNOSTIKOJE
THE IMPORTANCE OF CANINE STRESS LEUKOGRAM
IDENTIFICATION IN ROUTINE DIAGNOSTICS
Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų MAGISTRINIS BAIGIAMASIS DARBAS
Darbo vadovas: vet. gyd. Tautvilė Šukytė
DARBAS ATLIKTAS DR. LEONO KRIAUČELIŪNO SMULKIŲJŲ GYVŪNŲ KLINIKOJE
PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ
Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Stresinės leukogramos identifikavimo šunims reikšmė rutininėje diagnostikoje―
1. Yra atliktas mano pačios.
2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir uţsienyje.
3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą. Brigita Aurėja Maračinskaitė
(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)
PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŢ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE
Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe. Irena Kairevičienė
(data) (redaktoriaus vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO
Vet. gydytoja Tautvilė Šukytė
(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas) MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)
(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė) (parašas) Magistro baigiamojo darbo recenzentai:
1) 2)
(vardas, pavardė) (parašai)
Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas: (data) (gynimo komisijos sekretorės (-iaus) vardas, pavardė) (parašas)
TURINYS
SANTRAUKA...4
SUMMARY...5
SANTRUMPOS...6
ĮVADAS...7
DARBO TIKSLAI IR UŢDAVINIAI...8
1.LITERATŪROS APŢVALGA...9
1.1.LEUKOGRAMA IR JOS KOMPONENTAI...9
1.1.1.GRŪDĖTIEJI LEUKOCITAI (GRANULIOCITAI)...9
1.1.2.NEGRŪDĖTIEJI LEUKOCITAI (AGRANULIOCITAI)...10
1.1.3.LEUKOCITAI SU POKYČIAIS...11
1.2.LEUKOGRAMŲ RŪŠYS IR JŲ YPATUMAI...12
1.2.1.UŢDEGIMINĖ LEUKOGRAMA...12
1.2.2.STRESINĖ LEUKOGRAMA...13
1.2.3.SUSIJAUDINIMO LEUKOGRAMA...15
2.TYRIMO MEDŢIAGA IR METODAI...17
2.1. TYRIMO MEDŢIAGA...17
2.2. TYRIMO METODIKA...17
2.2.1. MANUALINIS LEUKOCITŲ SKAIČIAVIMAS...17
2.2.2. LASERCYTE DX HEMATOLOGINIS ANALIZATORIUS...18
2.2.3.TIRIAMŲJŲ GRUPAVIMAS, ATRINKIMAS IR STEBĖTI RODIKLIAI...19
2.3.TYRIMO REZULTATAI...20
3. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS...26
4. IŠVADOS...31
SANTRAUKA
Stresinės leukogramos identifikavimo šunims reikšmė rutininėje diagnostikoje Brigita Aurėja Maračinskaitė
Magistro baigiamasis darbas
Darbo apimtis: 36 puslapiai, 17 paveikslų, 1 lentelė, 63 literatūros šaltiniai.
Tyrimo tikslas: įvertinti šunų stresinės leukogramos reikšmę klinikinėje diagnostikoje. Tyrimo uţdaviniai:
1. Surinkti kraujo mėginius ir diferencijuoti stresines ir uţdegimines šunų leukogramas. 2. Susieti stresines leukogramas su gyvūno ligos eiga ir diagnoze.
3. Įvertinti ar stresinės leukogramos atpaţinimas yra naudingas klinikinėje praktikoje diagnozuojant lėtines ligas.
Tyrimo metodika:
Surinktas 21 šuns kraujo mėginys. Tyrimai atlikti hemocitometru Neubauer, manualiai skaičiuojant ląsteles ir hematologiniu analizatoriumi LaserCyte Dx. Duomenys palyginti. Įvertinus parametrus išskirtos dvi grupės – stresinės (n=4) ir uţdegiminės (n=6).
Tyrimo rezultatai ir išvados:
Atlikus vertinimus, kraujo tyrimas manualiai ir hematologiniu analizatoriumi buvo panašus leukocitų, neutrofilų ir monocitų kiekiu, bet skyrėsi bazofilų, limfocitų ir eozinofilų kiekiai. Lyginant grupes pagal paţeistas organų sistemas, stresinės leukogramos grupėje 50 proc. atvejų sudarė endokrininiai susirgimai, 50 proc. traumos ir mechaniniai paţeidimai. Uţdegiminės leukogramos grupėje daţniausia buvo stebimi gastrointestinaliniai susirgimai, tai sudarė 90 proc. atvejų. Pastebėtas stiprus ryšys tarp leukocitų ir segmentuotų neutrofilų – didėjant leukocitų kiekiui, didėja segmentuotų neutrofilų (padidėjus 1 proc. pastarųjų didės 0,958 proc.). Silpnas ryšys stebėtas tarp leukocitų ir lazdelinių neutrofilų (padidėjus 1 proc. leukocitų, lazdelinių neutrofilų kiekis sumaţės 1,738 proc.). Tyrimo metu pastebėta, kad kraujo hematologinio tyrimo rezultatai rodo tipinę stresinę leukogramą hiperadrenokorticizmo atveju, tačiau vienam endokrinologinį susirgimą turinčiam pacientui buvo nustatyta uţdegiminė leukograma, bet tai gali būti siejama su ūmiu gretutinės ligos pasireiškimu. Taigi po klinikinės gyvūno apţiūros, esant endokrinologinių ligų įtarimui, siūloma kraujo ląsteles skaičiuoti manualiniu metodu.
Raktaţodţiai: stresinė leukograma, uţdegimas, leukocitozė, monocitozė, neutrofilija, segmentuoti neutrofilai, lazdeliniai neutrofilai, gliukokortikoidai.
SUMMARY
The importance of canine stress leukogram identification in routine diagnostics Brigita Aurėja Maračinskaitė
Master‘s Thesis
The Thesis consists of 36 pages, 17 figures, 1 table and 63 references.
The aim of this research: An evaluate the importance of stress leukogram in routine diagnostics. Tasks:
1. To collect blood samples and differentiate the stress and inflammation leukograms. 2. To connect stress leukograms with disease‘s symptoms and diagnosis.
3. To determine how important is recognition of stress leukogram in routine diagnostics. Research:At veterinary clinic „X― was collected 21 canine blood sample. Performed an analysis with two different methods – hemocytometer Neubauer, counted white blood cells manually, and hematology analyzer LaserCyte Dx. Results were compared and according to main parameters created two groups of leukograms – stress and inflammation.
Research results and conclusion:
21 canine blood samples were compared. Noticed that samples which tested manually and with hematology analyzer had similar amount of leukocytes, neutrophils, monocytes and differ in lymphocytes, basophils and eosinophils. Comparing groups between stress and inflammation, observed that in group of stress leukogram was 50 % endocrine disorders and 50 % injuries/mechanical traumas. In other group of inflammation leukogram most frequent was gastrointestinal disorders (90 %). After calculations, strong relation between leukocytes and segmented neutrophils was measured (when leukocytes increse 1 %, segmented neutrophils increase too 0,958 %). However, weak relation was between leukocites count and band neutrophils (when leukocytes rise 1 %, band neutrophils decrease 1,738 %). Step by step, observed that typical stress leukogram case was hyperadrenocorticism or Cushing‘s disease. In contrast to inflammatory leukogram, one case of endocrine disease was, but that wasn‘t main reason of appointment to the vet. In conclusion, the suggestion is to prepare manual blood cell counting to patients with suspected endocrine disorders.
Keywords: stress leukogram, inflammation, leukocytosis, monocytosis, neutrophilia, segmented neutrophils, band neutrophils, gluccocorticoids.
SANTRUMPOS
LEU – leukocitai LYM – limfocitai MONO – monocitai NEU – neutrofilai EOS – eozinofilai BASO - bazofilaiACTH – adrenokortikotropinis hormonas
HPA – pagumburio-hipofizės-prieinkstinių liaukų ţievės ašis SAM – simpatinė prieinkstinių liaukų šerdies ašis
ĮVADAS
Leukograma – pakankamai seniai ţinomas metodas. Vienas pagrindinių leukogramos atlikimo privalumų yra greita ir kiekvienos ląstelės morfologiją bei pokyčius apimanti analizė. Tačiau pastebėta, kad klinikiniame darbe susiduriama su interpretacijos problemomis. Tuo tikslu mokslo įstaiga, pavadinimu Onderstepoort Academic Teaching Hospital, bendradarbiaudama kartu su gyvūnų augintinių departamento klinikinės patologijos skyriaus laboratorija, išrinko 1998 m. kovo mėn. – 2002 m. birţelio mėn. pasitaikiusias šunų leukogramas. Jų buvo surinkta 5739, suskirstyta į 25 diagnostines grupes, o pastarosios į 69 diagnostines kategorijas. Kadangi tyrimas buvo didelės imties, padarytos išvados suteikė daugiau aiškumo ir dėmesio į pasitaikiusias tendencijas. Pavyzdţiui, limfopenija 23 iš 33 atvejų buvo stebima esant šunų marui, o net 51 proc. nustatytas Kušingo sindromas. Svarbu, kad leukogramos paaiškinimui ir tolimesnei gydymo/diagnozavimo eigai reikalinga jos rūšis – uţdegiminė, stresinė ar susijaudinimo. Būtent leukocitų skaičiavimas ir diferencijavimas yra būdas atskirti šias rūšis, kadangi kiekviena jų turi savitus bruoţus. Nurodoma, kad daţniausiai leukoformulė atskleidţia uţdegiminių ląstelių pasiskirstymą, o stresinė leukograma pasitaiko esant hiperadrenokorticizmui ar gydant gliukokortikoidais. Išskiriant šią minėtą rūšį, vis dar nėra pakankamai informacijos apie kitas pasireiškimo tendencijas, todėl aktualumas pagrįstas tikslu išsiaiškinti, ar reiktų atidţiau paţvelgti į gautą stresinės leukogramos rezultatą, ir kokius simptomus, vėliau ir diagnozes, tokie pacientai galėtų turėti.
Darbo tikslas:
Įvertinti šunų stresinės leukogramos reikšmę klinikinėje diagnostikoje. Darbo uţdaviniai:
1. Surinkti kraujo mėginius ir diferencijuoti stresines ir uţdegimines šunų leukogramas. 2. Susieti stresines leukogramas su gyvūno ligos eiga ir diagnoze.
3. Įvertinti ar stresinės leukogramos atpaţinimas yra naudingas klinikinėje praktikoje diagnozuojant lėtines ligas.
1. LITERATŪROS APŢVALGA
1.1. Leukograma ir jos komponentai
Leukograma – tai baltųjų kraujo kūnelių (leukocitų, angl. white blood cells, WBC) profilis, susidedantis iš jų bendro skaičiaus, skirtingų tipų leukocitų skaičiaus bei jų morfologijos įvertinimo kraujo mėginyje (1). Dar kitaip leukograma vadinama leukocitine formule, išreiškiama leukocitų rūšių procentiniu santykiu (2). Leukogramą sudarantys leukocitai gali būti vertinami manualiai hemocitometrais, įranga skaičiuojami automatiškai arba pasitelkiant QBC (kiekybinę Buffy Coat) analizę (3,4,5). Tam, kad būtų galima įvertinti ne tik pačių leukocitų skaičių mėginyje, būtina ţinoti apie leukocitų tipus ir jų morfologinius ypatumus/skirtumus. Baltieji kraujo kūneliai skirstomi į dvi grupes (granulocitai ir agranuliocitai arba grūdėtieji ir negrūdėtieji leukocitai) ir penkis tipus (neutrofilai, eozinofilai, bazofilai, limfocitai ir monocitai) pagal citoplazmos išvaizdą, branduolio formą ir nusidaţymo bruoţus (6). Šios leukogramoje randamos ląstelės yra normaliai fiziologiškai randamos šunų kraujyje, tačiau yra ir nenormalių leukocitų bei jų pokyčių, kuriais remiantis galima daryti atitinkamas išvadas (7).
1.1.1. Grūdėtieji leukocitai (granulocitai)
Grūdėtieji leukocitai taip vadinami dėl citoplazmoje esančių granulių. Pagal grūdelių daţymąsi granulocitai yra trijų tipų – neutrofilai, eozinofilai ir bazofilai. (1 pav.) Neutrofilai sudaro 65-75 proc. visų WBC, todėl yra gausiausia leukocitų grupė (9). Pagrindinė neutrofilų fukcija yra fagocitozė. Jos metu veikiant chemotaksiui neutrofilai pasiekia svetimkūnius, kuriuos „praryja― ir tokiu būdu jie sunaikinami. Neutrofilai yra kelių rūšių – lazdeliniai ir segmentuoti. Lazdeliniai neutrofilai (angl. band neutrophils) yra nesubrendusios ląstelės, turinčios C, U ar S formos branduolį ir sudarančios nedidelę dalį periferiniame kraujyje (apie 1-7 proc.). Tirta 50 šunų ir vidutinis lazdelinių neutrofilų kiekis siekė 1-4 proc., tuo tarpu atlikus manipuliacijas neurocranium srityje, kiekis siekė 6,5 proc., kas siejama su aktyvia granulopoezija kaulų čiulpuose (10,11). Segmentuoti neutrofilai (angl. mature, segmented neutrophils) yra subrendusios ląstelės bei ţymiai gausesnė grupė, sudaranti 40-80 proc. Ištyrus 50 šunų, vidutinis segmentuotų neutrofilų kiekis siekė 51-84 proc.(10). Segmentuotų neutrofilų branduolys yra išsidėstęs segmentais (daţniausiai būna 2-5 segmentai) tarsi su sąsmaukomis, todėl atrodo nevienalytis, su skiltelėmis. Neutrofilų kiekio padidėjimas kraujyje vadinamas neutrofilija, o sumaţėjimas – neutropenija (8). Kitas granulocitų tipas yra eozinofilai. Jie dalyvauja alerginėse ir įvairiose hiperjautrumo reakcijose, esant parazitozėms. Kraujyje jų kiekis svyruoja 0-9 % arba 0-12% kaip teigiama šaltiniuose (10).Tačiau eozinofilų vidurkiu sveikiems šunims laikoma 2,5-3,5 proc. (12). Šunų kraujyje esantys eozinofilai turi apvalios formos granulių ir melsvą citoplazmą, branduolys susideda iš įvairaus kiekio segmentų. Reikia paminėti, kad kai kurių veislių šunų (pavyzdţiui, greihaundų, angl. greyhounds)
eozinofilai yra vakuolėti. Iš tyrime tirtų greihaundų veislės šunų 53 proc. turėjo būtent vakuolėtus eozinofilus (13). Eozinofilų kiekio padidėjimas kraujyje vadinamas eozinofilija, o sumaţėjimas – eozinopenija. Trečias tipas yra bazofilai, kurie daţniausiai siejami su alerginėmis organizmo reakcijomis. Normaliai jų kraujyje yra labai nedidelis kiekis 0-1 proc. (10). Bazofilų fukcija taip pat susieta su alerginėmis, uţdegiminėmis organizmo reakcijomis. Šių ląstelių branduolys uţima didelį pačios ląstelės plotą, daţnai jo išvaizda panaši į surištą kaspiną, kuris dėstosi lyg juostomis, o granulės nusidaţo gana ryškia levandų spalva (violetine). Bazofilų kiekio kraujyje padidėjimas vadinamas bazofilija, o sumaţėjimas – bazopenija (8).
Negrūdėtieji leukocitai (agranuliocitai)
Negrūdėtieji leukocitai, priešingai nei grūdėtieji, neturi citoplazmoje granulių, o ląstelių branduoliai vientisi. Agranuliocitai yra dviejų tipų – limfocitai ir monocitai.(1 pav.) Limfocitai gaminami ne tik kaulų čiulpuose, bet ir limfiniuose audiniuose (čiobrialiaukėje, limfiniuose mazguose) (6). Limfocitai yra antri pagal paplitimą kraujyje, nes sudaro 8-38 proc., vidurkis apie 23 proc. visų leukocitų (10). Limfocitų pagrindinė funkcija yra organizmo imuniteto moduliavimas, todėl jie yra dviejų rūšių: B, T ląstelės, kurios dalyvauja imuniniame atsake, sudaro antikūno-antigeno kompleksą, naikina svetimkūnius (14). Limfocitai yra maţos ląstelės su dideliu apvaliu branduoliu ir šviesiai mėlyna citoplazma. Limfocitų skaičiaus
padidėjimas kraujyje vadinamas limfocitoze, o sumaţėjimas – limfopenija. Antras agranulocitų tipas yra monocitai. Jų kiekis normaliai nėra didelis, apie 1-9 proc., o jų funkcija yra dalyvauti imuninio atsako ir uţdegimo reakcijose (6). Ląstelės yra panašaus dydţio kaip eozinofilai ir bazofilai, bet didesnės uţ neutrofilus, limfocitus. Branduolys varijuoja nuo išilgėjusios U formos iki formos, primenančios segmentus. Taip pat monocitai turi į pseudopodijas panašias struktūras, citoplazma nusidaţo pilkai melsva spalva. Monocitų kiekio padidėjimas kraujyje vadinamas monocitoze, o sumaţėjimas –
monocitopenija(15). 1 pav. Baltieji kraujo kūneliai
1.1.2. Leukocitai su pokyčiais
Yra keletas pagrindinių leukocitų pokyčių, kurie svarbūs leukogramos interpretavimui ir/ar ligos diagnozavimui, patvirtinimui. Nesubrendusių lazdelinių neutrofilų skaičiaus padidėjimas yra vadinamas poslinkiu į kairę (angl. left shift) (8). Jis skiriamas į regeneracinį ir degeneracinį. Pastaruoju poslinkis į kairę laikomas tada, kai matomas didelis kiekis lazdelinių ir maţai segmentuotų neutrofilų. Regeneracinis yra toks, kada abiejų rūšių ląstelių yra daugmaţ lygiai ar subrendusių kiekis didesnis. Poslinkis į kairę rodo uţdegimą, o bendras neutrofilų kiekis – organizmo gebėjimo tvarkytis su patogenais galimybes. Esant neutrofilijai, daţniausiai kaulų čiulpai geba duoti atsaką į uţdegiminį stimulą, o neutropenijos metu atsakas prastas (17). Poslinkiu į dešinę (angl. right shift) laikomas neutrofilų grūdėtumas arba hipersegmentacija, kada neutrofilų branduolys turi 5 ir daugiau segmentų. (2 pav.) Toks pokytis atsiranda esant organizme uţdegimui, veikiant gliukokortikoidams, senstant, kai neutrofilai ilgiau nei įprastai cirkuliuoja kraujyje (1). Neutrofilų hiposegmentacija – tai tokia ląstelės branduolio išvaizda, kai yra maţiau nei 3 sąsmaukos. Neutrofilų hiposegmentacija gali būti stebima keliais atvejais: įgyta esant ūmiam uţdegimui ir kaip įgimta neutrofilų branduolio patologija, vadinama Pelger Huet anomalija (trump.
PHA). Tokie neutrofilai atpaţįstami iš netipinės jų formos (branduolys gali būti be sąsmaukos,
ovalus arba kiek pailgas su įlinkiu, taip pat gali matytis aiški sąsmauka, dalinanti branduolį į dvi dalis) (54). Keliuose straipsniuose pateikta informacija, kad PHA pastebėta ortopedinių sutrikimų turėjusiems šunims (13 metų danų/švedų aviganiui diagnozuota spondiliozė, 7 metų australų aviganiui - plyšęs priekinis kryţminis raištis) (55). Hiposegmetacija gali būti įgimta. Predispozicija yra tam tikroms veislės, kaip pavyzdţiui, australų aviganiai (šaltinis nurodo, kad tyrime iš 87 šunų 10 proc. turėjo šią patologiją) (56). Taip pat yra toksinių neutrofilų pokyčių, kurie daugiau susiję su
citoplazmos pakitimais, kaip pavyzdţiui, citoplazminė bazofilija, Dohle kūneliai. Reaktyvūs limfocitai pasirodo esant lėtiniams uţdegimo procesams. Ne maţiau svarbūs įvairūs leukocitų intarpai, kurie gali būti infekcinės ir neinfekcinės kilmės. Infekciniais leukocitų intarpais laikomos
2 pav. Neutrofilų hipersegmentacija šuns
kraujo mėginyje. (1)
3 pav.Anaplasma phagocytophilumšuns
4 pav.Segmentuotų ir lazdelinių neutrofilų
pasiskirstymas uţdegimo metu.(28)
bakterijų, virusų, pirmuonių ir grybų sukeltos ligos, kada tai matoma analizuojant kraujo mėginį (1). Esant anaplazmozei, sukeltai Anaplasma spp. pirmuonių, neutrofiluose stebimi mėlynai nusidaţę intracitoplazminiai intarpai (18). (3 pav.) Neinfekcinės kilmės sukelti leukocitų pakitimai susiję su imuniniais, paveldėtais sutrikimais. Sergant hemolitine anemija neutrofiluose atsiranda gelsvai rudų granulių (1). Atsirandant organizme neoplaziniams procesams gali būti stebimos kitos ląstelės, tokios kaip histiocitai ir mastocitai (putliosios ląstelės) (19,20).
1.2. Leukogramų rūšys ir jų ypatumai
Pagrindinės trys leukogramų rūšys yra šios – uţdegiminė, stresinė ir susijaudinimo. Kliniškai sveiko gyvūno leukogramos rezultatas
daţniausiai pateikiamas ląstelių skaičiumi 103
ar 109 mikrolitre ar litre kraujo, kas apskaičiuojama pagal metodikoje nurodytą formulę.
1.2.1. Uţdegiminė leukograma
Uţdegimas – tai organizmo reakcija (ūmi ar lėtinė) į patogeną. Esant ūmiai reakcijai būdingi didesni kiekiai neutrofilų negu lėtinės ar poūmės reakcijos metu, kai dominuoja makrofagai ir limfocitai. Tačiau tiek ūmiame,
tiek lėtiniame procese pirmiausia dalyvauja ir reaguoja neutrofilai (1). Neutrofilai esti kaulų čiulpuose. Juose yra „zonos― – vienoje jų vyksta ląstelių vystymasis ir diferenciacija, kitoje bręsta ląstelės ir sudaromas pastovus jų rezervas. Organizme atsiradus infekcijos ţidiniui, leukocitų sumaţėjimas nėra normalus. Tai paaiškinama tuo, kad neutrofilai iš kaulų čiulpų nuolat patenka į kraują ir cirkuliuoja jame, todėl patekus uţdegimo sukėlėjui, dideli kiekiai ląstelių gali telktis audiniuose ir greitai pasiekti infekcijos šaltinį (28). Neutrofilai turi specifinius receptorius (L-selektinai) paviršiuje, dėl kurių jie sukimba su endotelio ląstelėmis aplink uţdegimo sritį. Šiame procese veikia ir kiti chemotaktiniai faktoriai, sąlygojantys neutrofilų riedėjimą, adheziją, emigraciją. Esant ūmiam uţdegimui, iš kaulų čiulpų subrendusios (segmentuotos) ląstelės dideliais kiekiais patenka į bendrą cirkuliaciją. Kai nėra pakankamas šių ląstelių kiekis kovoti su infekcija arba išsenka cirkuliuojančių ląstelių rezervas, tuomet į kraujotaką išleidţiamos nesegmentuotos/lazdelinės ląstelės ir tai vadinama poslinkiu į kairę, vyksta staigi ląstelių produkcija kaulų čiulpuose (28,29). (4 pav.) Šis reiškinys parodo infekcijos buvimą bei infekcijos ūmumą. Uţdegiminei leukogramai būdinga ląstelių išraiška svyruoja, pagal uţdegimo tipą. Pasireiškiant poūmiai reakcijai atsiranda neutropenija su poslinkiu į kairę ir toksiniais pokyčiais (angl. toxic
5 pav.
Pagumburio-hipofizės-prieinkstinių liaukų ţievės veikimas.(26)
change) (30). Ūmi reakcija – neutrofilija su poslinkiu į kairę ir įvairiais toksiniais pokyčiais. Lėtinės
reakcijos metu būdinga neţymi neutrofilija arba fiziologiškai normalus neutrofilų kiekis, gali būti švelnus poslinkis į kairę. Apskritai uţdegimui būdinga limfopenija, monocitozė (gali ir nebūti arba neţymi), eozinofilija (ypač jei uţdegimo prieţastis yra parazitai; atsiranda ir bazofilija), limfocitų kiekis sumaţėja arba nepakinta. Vienas iš uţdegiminės leukogramos patvirtinimų esti neutrofilija su poslinkiu į kairę, kai yra daugiau nei 1000 nesegmentuotų neutrofilų/mikrolitre arba 1,0*109
/l ir branduolio hiposegmentacija. Švelnus poslinkis į kairę, kai yra 300-1000 nesegmentuotų neutrofilų/mikrolitre, stebimas esant hemoraginėms, lėtinėms, granulomatozinėms ligoms (7,8). Gali būti skaičiuojamas neutrofilų ir limfocitų santykis. Neutrofilų ir limfocitų santykis (bendras lazdelinių ir segmentuotų neutrofilų skaičius padalintas iš limfocitų skaičiaus) ţmonių medicinoje vadinamas uţdegimo biomarkeriu ir yra naudojamas kaip uţdegimo indikatorius, pagal kurį galima prognozuoti paciento būklės kitimą, išgyvenamumo procentą. Ištirta, kad šis santykis gana tiksliai atspindi paciento išlikimo galimybes esant tokioms būklėms, kaip sepsis, išemijos (lot. ischaemia) ir vėţiniai susirgimai. Apie šunų neutrofilų ir limfocitų santykio vertinimą literatūros nėra daug (57). Viename straipsnyje ištirta, kad šunų, kuriems nustatyta vėlesnė putliųjų ląstelių naviko stadija (nuo antros stadijos), neutrofilų/limfocitų santykis buvo didesnis lyginant su pirmos stadijos atvejais (58). Kitame straipsnyje nurodoma, kad šunų, sirgusių uţdegimine ţarnyno liga (angl.
inflammatory bowel disease, IBD), minėtas santykis taip pat didesnis lyginant su sveikais šunimis.
Tai svarbu todėl, kad didesnis neutrofilų/limfocitų santykis parodo ţarnyno uţdegimo stiprumą (59).
1.2.2. Stresinė leukograma
Stresas – nespecifinė adaptyvi organizmo reakcija į dirgiklį. Stresas gali būti trumpalaikis, kai organizmo reakcija į stresorių aktyvi, geba su juo kovoti, ir ilgalaikis, kai organizmo atsakas tampa maţiau aktyvus arba reakcija minimali. Pagumburio-hipofizės-prieinkstinių liaukų ţievės (angl. HPA axis) sąveikoje skatinamas adrenokortikotropinio hormono (trump.
ACTH) išmetimas į kraujotaką, kuris verčia prieinkstinių
liaukų (antinksčių) ţievę aktyvuoti gliukokortikoidų sekreciją. Platesne prasme esant stresoriui, į pagumburį neuromediatoriais perduodama informacija ir išskiriamas kortikotropiną atpalaiduojantis hormonas (trump. CRH), kuris skatina adenohipofizę išskirti
ACTH. Tuomet sureaguoja prieinkstinių liaukų ţievės vidurinioji zona (lot.zona fasciculata) ir išskiriami gliukokortikoidai (kortizolis). Tokiu keliu kortizolis patenka į kraujotaką ir vyksta atsakas į stresorių (21). (5 pav.) Per didelė ar lėtinio tipo gliukokortikoidų ekspozicija išderina reakcijos į stresorius mechanizmus ir yra vienas veiksnių, lemiančių endokrininių, autoimuninių, metabolinių ir psichologinių ligų išsivystymą (22). Klasikinė leukograma gydant kortikoidais ar esant ūmiam stipriam stresui yra saikinga leukocitozė su neutrofilija (dominuoja segmentuoti neutrofilai, gali būti su hipersegmentacija – poslinkiu į dešinę), limfopenija ir eozinopenija bei lengva, saikinga monocitozė. Leukocitozė tiesiogiai veikiant kortikosteroidams gali siekti 30-40 tūkst. ląstelių mikrolitre, bet įprastai siekia 15-25 tūkst. ląstelių mikrolitre. Neutrofilų skaičiaus didėjimas vystosi 4-12 valandų laikotarpyje po gydymo kortikosteroidais, o atsistatymas į fiziologinę normą per kiek maţiau nei parą (7). Limfopenija nesant neutrofilijai paprastai parodo lėtinį stresą, kai stresoriumi būna lėtinės ligos (pavyzdţiui, lėtinis inkstų funkcijos nepakankamumas, hiperadrenokorticizmas arba Kušingo sindromas), ilgas laiko tarpas gydant gliukokortikoidais. Subrendusių neutrofilų skaičiaus padidėjimą ir galimą hipersegmentaciją lemia didesni jų kiekiai, išmetami iš kaulų čiulpų, didesnės dalies pasiskirstymas kraujotakoje negu audiniuose ir ilgesnis laiko tarpas cirkuliuojant kraujotakoje, nemigruojant į audinius. To pasekmė daţniausiai yra stresas, padidėjusi gliukokortikoidų koncentracija, dėl kurios skatinamas, ilginamas neutrofilų buvimą kraujotakoje (31). Limfopenija vystosi dėl limfolizės. Yra veislių, pavyzdţiui, kurtai, kurie gali turėti fiziologiškai ţemą leukocitų kiekį, įskaitant ir maţesnius neutrofilų bei limfocitų kiekius (32). Limfocitai, T ir B ląstelės, atsakingi uţ specifinį/įgytą imunitetą. Stresinė leukograma pasiţymi gliukokortikoidų įtaka, dėl šios prieţasties vystosi limfocitų kiekio sumaţėjimas, kadangi gliukokortikoidų veikimas yra imunosupresinis. Steroidinės medţiagos slopina limfocitų aktyvaciją ir inicijuoja jų apoptozę. Labai didelių koncentracijų steroidai veikia T ir B imunines ląsteles – tai inhibitorinis poveikis jų gamybai (33). Įdomu tai, kad ne vien gliukokortikoidų kiekis gali sukelti limfopeniją. Buvo pastebėta sąveika tarp limfocitų sumaţėjimo ir lėtinio inkstų nepakankamumo esant azotemijai ir ūmėjant klinikiniams poţymiams (vėmimas, anoreksija) (34). Sumaţėję eozinofilų kiekiai atsiranda dėl jų sulaikymo, izoliavimo kaulų čiulpuose ir audiniuose. Monocitozė vyksta dėl pertvarkos iš periferinių audinių į bendrą cirkuliaciją (23). Monocitozė aptinkama apie 30 proc. atvejų. Kraujyje monocitai virsta makrofagais ir šie nukeliauja į audinius. Monocitozė pasireiškia esant ūmiam ir chroniškam procesui, tačiau be kitų hematologinių pokyčių negalėtų būti vertinama kaip kaţkuris vienas jų. Esant kartu limfopenijai/eozinopenijai, indikuotų stresinės leukogramos buvimą, o jų nesant labiau tikėtina audinių destrukcija ir uţdegimas (35). Stresinė leukograma pasirodo ir esant skausmui (skausmo stiprumas priklauso nuo organizmo skausmo slenksčio) – 9 šunims iš 31 (29 proc.), kurių visiems buvo diagnozuota aortos trombozė, pastebėtas stresinės leukogramos šablonas. (24). Taip pat tiriant
tarnybinius belgų aviganius, limfopenija su neutrofilija buvo stebima labiau šunims iki 2 metų amţiaus lyginant su vyresniais įvairiose tarnybinio darbo srityse, o tai aiškinama jaunesnių šunų paţeidţiamumu ir stresinių aplinkybių buvimu (keli skirtingi kinologai, įvairios uţduotys, dresūros technika ir intensyvumas) (25). Apimant daugiau atvejų, nustatyta, kad tie šunys, kuriems buvo diagnozuota epilepsija, lyginant kraujo tyrimus po priepuolio ir nesant priepuolio, turėjo stresinę leukogramą kartu su policitemija (36). Yra duomenų, jog šunys, turėję idiopatinį ūmios diarėjos sindromą, pasireiškiantį kartu ir vėmimu, apatija, turėjo stresinę leukogramą. (37). Atvejis, kai šuniui buvo diagnozuota intoksikacija organofosfatais, atskleidė leukocitozę su neutrofilija (subrendusios ląstelės), eozinopeniją bei limfopeniją (38). Vienas iš daţniausių atvejų, aprašomų literatūroje, yra hiperadrenokorticizmas arba Kušingo liga, lydima vėmimo, viduriavimo, silpnumo, gali reikštis polidipsija bei poliurija. Leukoformulė rodo leukocitozę, neutrofiliją (subrendusių ląstelių), eozinopeniją, limfopeniją ir monocitozę – tipinį stresinės leukogramos vaizdą (39). Nors stresinėse situacijose kortizolio, leukocitų, neutrofilų, monocitų kiekis kraujyje padidėja, o limfocitų sumaţėja, tačiau nebūtinai šie rodikliai turi būti ne normos ribose. Viename straipsnių ištirta, kad šunų kortizolio kiekis po jų sugavimo gatvėje ir perkėlimo į naują aplinką buvo didesnis 1,2 karto lyginant su kortizolio kiekiu po paros laiko. Leukocitų kiekis po paros sumaţėjo 1,4 karto, neutrofilų – 1,6 karto, limfocitų – 1,1 karto. Sugautų šunų neutrofilų ir limfocitų santykis buvo didesnis 1,5 karto nei po paros (60). Dėl gydymo steroidais ir neutrofilų/limfocitų santykio, minėtina tai, kad siejant neutrofilų/limfocitų santykį su stresine leukograma, stebėta, kad tų tiriamųjų, kurie buvo gydyti steroidais, ir tų, kurie nebuvo gydyti steroidais, neutrofilų/limfocitų santykis vertinant daugiacentrinės limfomos prognozę šunims nuo steroidų gavimo nepriklausė (61).
1.2.3. Susijaudinimo leukograma
Susijaudinimo arba fiziologinio streso leukogramos sudedamosios dalys yra leukocitozė, limfocitozė, neutrofilija ir retai monocitozė (1). Fiziologinės leukogramos atsiradimo prieţastys yra baimė, susijaudinimas, skausmas ir didelis aktyvumas, taip pat daţniau stebima tarp jauniklių ir daugiau pasireiškia katėms. Skirtumas lyginant stresinę ir uţdegiminę leukogramas yra momentinis epinefrino sąlygotas atsakas į dirgiklį ir dėl to pakitusi leukoformulė, tačiau pasibaigus dirgiklio poveikiui greitai normalizuojasi. Katecholaminai (epinefrinas ir norepinefrinas) išskiriami iš prieinkstinių liaukų šerdinės dalies, kuomet aktyvinama simpatinė nervų sistema. Simpatinė adrenomeduliarinė ašis (SAM) ir jos veikimas yra ţinomi kaip „fight or flight― atsakas, kai padidėja širdies daţnis, kraujo spaudimas, gliukozės kiekis kraujo plazmoje – organizmas pasiruošęs atsakui į stresorių. Šis epinefrino indukuotas atsakas uţkertą kelią limfocitams sklisti į limfinius organus, laikinai padidėja jų mobilizacija iš krūtininio limfos latako (lot. ductus thoracicus) ir telkimasis
bendroje cirkuliacijoje, dėl ko išauga jų skaičius (6). Neutrofilai persiskirsto organizme, tačiau nėra papildomai didinama gamyba ir išleidimas iš kaulų čiulpų (40).
6 pav. Mėlyna spalva paţymėti langeliai skirti
WBC skaičiavimui. (26)
2. TYRIMO MEDŢIAGA IR METODAI
2.1. Tyrimo medţiaga
Tyrimas atliktas 2020 metais „X― smulkiųjų gyvūnų klinikoje. Tyrimo metu surinkta 21 šuns kraujo mėginys iš įvairių veislių ir mišrūnų, skirtingo amţiaus šunų.
2.2. Tyrimo metodika
2.2.1. Manualinis leukocitų skaičiavimas
Tyrimo metu gyvūnas fiksuojamas ir kraujas iš priekinėje kojoje esančios poodinės venos (v.
cephalica) paimamas į mėgintuvėlį su antikoaguliantu EDTA. Mėgintuvėlis švelniai pavartomas
aukštyn ţemyn, kad kraujas ir antikoaguliantas susimaišytų. Kraujas tiriamas iškart, per 2-3 valandas nuo paėmimo arba laikomas šaldytuve 4°C temperatūroje ir ištiriamas per 24 valandas. Tyrimas susideda iš kelių mėginio paruošimo ir vertinimo ţingsnių: kraujo skiedimo, Neubauerio hemocitometro paruošimo ir leukocitų skaičiavimo bei rezultato apskaičiavimo pagal formulę (7 pav.):
1) Kraujo skiedimas:
Į specialią Thoma-style pipetę, skirtą kraujo maišymui ir skiedimui, pritraukiama tiriamojo kraujo iki 0,5 padalos. Po to į tą pačią pipetę pritraukiama Tiurko tirpalo iki 1L padalos. Kraujas praskiedţiamas 20 kartų. Pipetės galai uţspaudţiami ir ji lėtai pavartoma kelis kartus, kad turinys tolygiai susimaišytų. Po 5-10 minučių mėginys paruoštas darbui, nes per tą laiką hemolizuojami eritrocitai.
2) Neubauerio hemocitometro paruošimas:
Hemocitometras švariai sausai nuvalomas. Papučiamas šiltas oras ir prispaudţiamas dengiamasis stiklelis tol, kol pasirodo Niutono ţiedai. Truputį palaukiama, kol išdţius aprasojęs stiklelis ir kamera uţpildoma paruoštu mėginiu. Prieš uţpildant mėginys pipetėje dar kartą pavartomas, pirmi trys lašai nuvarvinami į
vatą ir nedidelis lašas lašinamas ant hemocitometro šalia dengiamojo stiklelio krašto.
3) Leukocitų skaičiavimas:
Hemocitometras dedamas po mikroskopu, kelias minutes palaukiama, kol ląstelės nusės ant stiklelio paviršiaus ir mikroskopuojama. 4x ir 10x mikroskopo objektyvo padidinimas skirtas įvertinti
leukocitų pasiskirstymui kameros tinklelyje. 40xmikroskopo objektyvo padidinimas skirtas ląstelėms skaičiuoti. Matymo lauke surandami
didesniais kvadratais suskirstyti laukai ir juose skaičiuojamos ląstelės (išėjusios uţ langelių ribų į skaičiavimą nepatenka). (6 pav.)
4) Formulė leukocitams apskaičiuoti:
7 pav. Reikmenys manualiniam tyrimui. Asm.
2.2.2. LaserCyte Dx hematologinis analizatorius
Kraujas morfologiniam tyrimui hematologiniu analizatoriumi buvo paimtas iš priekinėje kojoje esančios poodinės venos (v. cephalica) į mėgintuvėlį su antikoaguliantu EDTA. Kraujo mėginys tiriamas iškart pagal hematologinio analizatoriaus naudojimo instrukciją. Kraujo tyrimo atsakymas gaunamas per kelias minutes. LaserCyte technologija paremta lazerinio srauto citometrija. (8 pav.) Kraujas atskiedţiamas, praleidţiamas pro lazerį ir kiekviena ląstelė patenka į tam tikrus taškus pagal skiltėtumą, branduolio ir citoplazmos santykį, ląstelės tūrį, viduląstelinį tankį ir grūdėtumą. Rezultatai pateikiami kartu su normomis.
2.2.3.Tiriamųjų grupavimas, atrinkimas ir stebėti rodikliai
Iš pradţių į imtį įtraukti visi tirti šunys, matuota kaip kito jų kraujo parametrai (*109
/L) lyginant manualinio skaičiavimo būdu ir hematologiniu analizatoriumi gautus duomenis. Stebėtos jų minimalios ir maksimalios reikšmės, vidurkis, mediana (skaičius, uţ kurį pusė variacinių eilučių reikšmių yra ne didesnės ir pusė ne maţesnės) ir statistinis patikimumas (p<0,05). Tuomet buvo diferencijuoti duomenys ir sudarytos dvi grupės – šunys, kuriems nustatyta stresinė ir šunys, kuriems nustatyta uţdegiminė leukograma. Į imtį nebuvo įtraukti visi iš pradţių tirti šunys, nes ne visi atitiko keliamus kriterijus. Į stresinės leukogramos grupę pateko 4 šunys, į uţdegiminę – 6. Vadovautasi schema (9 pav.), kartu įvertinant, kad stresinėje leukogramoje būtų <40x109/L leukocitų, <1,5x109
/L lazdelinių neutrofilų ir 10-20x109/L segmentuotų neutrofilų. Stresinio ir uţdegiminio šablono rezultatai lyginti tarpusavyje. Naudotas Stjudento T-testas, chi testas, ryšiui nustatyti pasirinkta koreliacija, nustatytas patikimumas (p<0,05, p<0,01). Naudota „Microsoft
Excel―
programa.
10 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal lytį.
11 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal kilmę.
2.3. Tyrimo rezultatai
Tiriamųjų populiacijoje didesnę dalį 57 proc. (n=12) sudarė patinai, maţesnę 43 proc. (n=9) – patelės. Išskirsčius populiacijas pagal leukogramų tipą, stresinės leukogramos atveju patinų buvo 100 proc. (n=4), patelių nepasitaikė, o uţdegiminės atveju – patelių 67 proc. (n=4), patinų 33 proc. (n=2). (10 pav.) Pagal šunų kilmę, mišrūnai 52 proc. (n=11) ir veisliniai 48 proc. (n=10) pasiskirstė beveik po lygiai, vienu tiriamuoju mišrūnų grupėje buvo daugiau. (11 pav.) Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amţių varijavo nuo 1 m. iki 15 m., suskirsčius į dvi grupes, kurių viena 6 m. ir vyresni šunys, o kita 5 m. ir jaunesni, matoma, kad 67 proc. (n= 14) visų tirtų šunų sudarė vyresni, o 33 proc. (n=7) jaunesni. (12 pav.)
12 57 proc. 9
43 proc.
Tiriamųjų pasiskirstymas pagal lytį
Patinai Patelės 10 48 proc. 11 52 proc.
Tiriamųjų pasiskirstymas pagal kilmę
Veislinis Mišrūnas
12 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amţių.
Išskyrus pagal pasitaikiusius simptomus, daţniausias simptomas buvo vėmimas ir apatija 57 proc. (n=12), rečiausias – padidėję limfmazgiai 5 proc. (n=1). (13 pav.)
Kadangi tiriamųjų kraujo mėginiai buvo tirti dviem būdais, jie palyginti. Vidutiniškai leukocitai manualiniu ir leukocitai analizatoriumi skyrėsi 1,2 karto, tai nebuvo statistiškai reikšmingas rodiklis (p>0,05). Minimalus manualiniu metodu apskaičiuotas leukocitų kiekis siekė 3,00x109/L, analizatoriumi – 4,76x109/L. Neutrofilų kiekio palyginimas taip pat nebuvo statistiškai reikšmingas (p>0,05), tačiau manualiai skaičiuotas kiekis buvo didesnis 1,04 karto nei analizatoriaus rezultatas.
6 m. ir vyresni 67proc. 5 m. ir jaunesni 33proc.
Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amţių
0 2 4 6 8 10 12 14 P ac ientų k ieki s Simptomai
Simptomų daţnumas
13 pav. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal simptomų daţnumą.
Statistiškai reikšmingai (p<0,05) skyrėsi eozinofilų, bazofilų ir limfocitų duomenys. Pastarųjų suskaičiuota 1,8 karto maţiau manualiai nei analizatoriumi. Didţiausias limfocitų kiekis siekė 1,70x109/L manualiniu metodu ir 5,48x109/L kitu metodu. (1 lentelė).
Manualinis metodas LaserCyte Dx
Vidurkis Md Min-Max Vidurkis Md Min-Max p<0,05 LEU, x109/L 15,04±2,377 12,85 3,00-45,70 18,28±2,638 17,11 4,76-52,29 0,388 NEU, x109/L 13,70±2,225 11,45 2,00-45,15 13,08±1,983 12,32 2,42-41,44 0,843 EOS, x109/L 0,20±0,026 0,20 0,00-0,45 0,34±0,068 0,29 0,01-1,44 0,046* BASO, x109/L 0,03±0,008 0,00 0,00-0,10 0,07±0,010 0,06 0,01-0,18 0,000* LYM, x109/L 0,43±0,088 0,30 0,05-1,70 1,59±0,350 0,78 0,23-5,48 0,029* MONO , x109/L 0,65±0,129 0,55 0,00-2,15 2,01±0,427 1,61 0,33-7,88 0,243
Atlikus duomenų analizę, iš visos tiriamųjų grupės atrinktos dviejų tipų labiausiai tipiškos leukogramos – stresinė (n=4) ir uţdegiminė (n=6), toliau grupė 1 ir grupė 2. Abiejų grupių leukogramose paskaičiuotos kraujo rodiklių minimalios (min) ir maksimalios (max) reikšmės: leukocitų min reikšmė 12,55x109
/L grupėje 1 ir 19,05x109/L grupėje 2, max reikšmė grupėje 1 siekė 16,00x109
/L, grupėje 2 45,70x109/L. Išskirsčius neutrofilus į lazdelinius ir segmentuotus, paskaičiuotos jų medianos. Grupė 1: 11,88x109
/L segmentuotų ir 1,30x109/L lazdelinių neutrofilų. Grupė 2: 3,48x109
/L lazdelinių ir 16,35x109/L segmentuotų neutrofilų. Ryšiui tarp abiejų grupių leukocitų ir neutrofilų nustatyti paskaičiuotas koreliacijos koeficientas, jo patikimumas ir nubraiţyta linijinė diagrama (regresijos tiesė). Stresinės leukogramos leukocitai ir segmentuoti neutrofilai turėjo labai stiprų teigiamą koreliacinį ryšį (r=1,00), kuris buvo statistiškai patikimas su dviem reikšmingumo lygmenimis (p<0,05 ir p<0,01), tai reiškė, kad leukocitų kiekiui didėjant, daugės segmentuotų neutrofilų. Nubrėţus tiesę, matoma, kad leukocitų padidėjus 1 proc., segmentuotų neutrofilų padidės 0,958 proc. (14 pav.) Atlikus skaičiavimus su uţdegiminės leukogramos duomenimis, stebima panaši koreliacija tarp leukocitų ir segmentuotų neutrofilų. Ryšys buvo labai stiprus (r=0,995), teigiamas, statistiškai patikimas su dviem reikšmingumo lygmenimis (p<0,05 ir p<0,01),todėl leukocitų kiekiui didėjant segmentuotų taip pat didės. Kitokia koreliacija pastebėta tarp leukocitų ir lazdelinių neutrofilų ir vienoje, ir kitoje leukogramoje. Pastebėta, kad neigiamas stiprus ryšys (r=-0,809), statistiškai nepatikimas buvo stresinės leukogramos grupėje, o neigiamas silpnas ryšys (r=-0,185), statistiškai nepatikimas – uţdegiminės grupėje. Abiem atvejais reiškia, kad
1 lentelė. Kraujo rodiklių (leukocitų, neutrofilų, eozinofilų, bazofilų, limfocitų ir monocitų)
palyginimas manualiniu metodu ir hematologiniu analizatoriumi LaserCyte Dx. Md – mediana; Min – maţiausia reikšmė; Max – didţiausia reikšmė; *p<0,05.
leukocitų kiekiui didėjant, lazdelinių neutrofilų kiekis maţės. Nubrėţus tiesę, matoma, kad leukocitų skaičiui padidėjus 1 proc., lazdelinių neutrofilų sumaţės 1,738 proc. (15 pav.)
y = 1,043x - 2,992 R² = 0,999*** 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 Neut ro fila i, seg m ent uo ti, x 1 0 9/L Leukocitai
Segmentuotų neutrofilų priklausomybė nuo
leukocitų kiekio
y = -0,019x + 4,031 R² = 0,034 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 Ne u tr of il ai, lazdelin iai , x10 9/L LeukocitaiLazdelinių neutrofilų priklausomybė nuo
leukocitų kiekio
14 pav. Leukocitų ir segmentuotų neutrofilų priklausomybė stresinės
leukogramos šablone. p<0,05*, p<0,01**, p<0,05 ir p<0,01***.
15 pav. Leukocitų ir lazdelinių neutrofilų priklausomybė uţdegiminės
Vertinant leukogramos rūšį buvo tikslinga suţinoti, ar simptomai ir organų sistemos sutrikimai turi ryšį. Atlikus skaičiavimus, nustatyta, kad polidipsija ir poliurija (n=3) bei anemija (n=6) neturi ryšio su leukograma (p>0,05).Ryšys nustatytassuvėmimo ir apatijos (n=7), skausmingo pilvo (n=7) simptomais (p<0,05). (16 pav.) Tačiau ţvelgiant bendrai, abiejose leukogramų rūšyse šie simptomai pasitaikė bendrai, pavyzdţiui, vėmimas ir apatija pasitakė 50 proc. šunų stresinėje ir 83,3 proc. šunų uţdegiminėje leukogramoje, išskyrus viduriavimą (n=1) ir išliesėjimą (n=1), kuris pasitaikė tik uţdegiminės atveju. Kalbant apie organų sistemos sutrikimus, leukogramos ryšys buvo vien su gastrointestinaliniais sutrikimais (n=5) (p<0.05). Ryšys nebuvo nustatytas su endokrininiais (n=5), traumomis ir mechaniniais paţeidimais (n=2), infekcinėmis ligomis (n=2), ir navikais (n=2) (p>0,05). (17 pav.) Paţymėtina, kad kai kurie šunys turėjo kelias diagnozes, kurios buvo priskirtos kaţkuriems organų sistemos paţeidimams. Pavyzdţiui, du šunys uţdegiminės leukogramos grupėje turėjo 3 paţeistų organų sistemos sutrikimus (gastrointestinalinius, infekcinius ir navikus). Stresinės leukogramos grupėje 50 proc. atvejų turėjo mechaninius paţeidimus ir traumas, kiti 50 proc. – endokrininius sutrikimus. 0 1 2 3 4 5 6 7 At ve jų sk aičiu s Simptomai
Simptomų pasiskirstymas pagal leukogramos
tipą
Stress Uţdegiminė
17 pav. Diagnozių pasiskirstymas pagal leukogramos tipą. *p<0.05. 0 1 2 3 4 5 6 Gastrointestinaliniai sutrikimai* Endokrininiai sutrikimai Traumos ir mechaniniai paţeidimai
Infekcinės ligos Navikai
At ve jų sk aičiu s Sutrikimai
Diagnozių pasiskirstymas pagal leukogramos tipą
3. TYRIMO REZULTATŲ APTARIMAS
Pradėjus diferencijuoti visų tirtų šunų kraujo tyrimo rezultatus, nuspręsta iš visų tiriamųjų atrinkti labiausiai atitinkančius stresinės ir uţdegimo leukogramų kriterijus. Į stresinės leukogramos grupę pateko 4 šunys, į uţdegiminės – 6. Susijaudinimo leukogramos nebuvo stebėta. Lyties, amţiaus ir kilmės predispozicija stresinei leukogramai vertinta nebuvo, tačiau iš visų pasitaikiusių (n=4) 4-11 metų amţiaus patinų pusę sudarė veisliniai, pusę mišrūnai. Literatūroje nurodoma, kad didesnį polinkį į hiperadrenokorticizmą turi patelės nei patinai (šios ligos atveju labiausiai tikėtina, kad gyvūno kraujo tyrimas rodys tipinę stresinę leukogramą) (41). Uţdegiminės leukogramos grupėje didesnę dalį sudarė patelės – 67 proc., šunys buvo 4-10 metų amţiaus, pusę grupės sudarė įvairių veislių, pusę - mišrūnai. Išanalizavus visų šunų (n=21) anamnezes, 29 proc. pasireiškė kartu vėmimas ir apatija, 24 proc. turėjo skausmingą pilvą, 19 proc. buvo anemiški, polidipsija ir poliurija pasireiškė 14 proc., vėmimas ir viduriavimas - 9 proc., o padėję limfmazgiai 5 proc. šunų. Vertinant, kokius simptomus daţniausiai turėjo šunys, kuriems nustatyta stresinė leukograma, vėmimas ir apatija buvo pasireiškusi 50 proc. tiriamųjų, pavieniui pasireiškė polidipsija, poliurija, anemija ir skausmingas pilvas. Siejant simptomus su ligos diagnoze, 50 proc. šunų turėjo endokrininų sutrikimų (įtariamas hiperadrenokorticizmas ir hipotiroidizmas), likusieji pateko į traumų ir mechaninių paţeidimų kategoriją (kąstinės ţaizdos ir svetimkūnis stemplėje). Hiperadrenokorticizmas yra bene pagrindinė liga, kuria sergantis šuo turi stresinę leukogramą (limfocitozė, neutrofilija su poslinkiu į dešinę – subrendusiais neutrofilais, limfopenija, monocitozė ir eozinopenija). Kadangi vienam iš šunų buvo įtariamas hiperadrenokorticizmas, atlikus manualinį kraujo ląstelių skaičiavimą, stebėta stresinė leukograma – 16,00x109
/L leukocitų, 13,75x109/L segmentuotų neutrofilų, 0,00x109
/L eozinofilų, 0,00x109/L bazofilų, 0,5x109/L limfocitų ir 1,05x109/L monocitų). Kraujas, tirtas hematologiniu analizatoriumi, parodė 17,32x109/L leukocitų, 14,58x109/L neutrofilų, 0,01x109/L eozinofilų, 0,01x109/L bazofilų, 0,74x109/L limfocitų ir2,04x109/L monocitų. Šis atvejis sutapo su literatūroje aprašytais Kušingo sindromo atvejais, todėl įtarimas dėl ligos didėja. Literatūroje pastebėta, kad sergant hipotiroidizmu padidėja leukocitų ir segmentuotų neutrofilų kiekis, tai aiškinama antrinės kilmės infekcijų atsiradimu (pioderma,
Malassezia spp. sukeltas dermatitas), kuris daţniausiai išsivysto esant nepakankamam sisteminiam
imuniniam atsakui, ir dėl to susilpnėja vietinis imunitetas (patogeniniai mikroorganizmai lengviau praeina odos barjerą) (42,43,44). Kiti du šunys, kuriems nustatyta stresinė leukograma, jautė ilgalaikį skausmą, o literatūroje skausmas nurodomas kaip viena prieţasčių tokio tipo leukogramos atsiradimui (24,37).
Pradėjus diferencijuoti visų į imtį patekusių šunų kraujo tyrimo rezultatus, nuspręsta iš visų tiriamųjų atrinkti labiausiai atitinkančius stresinės ir uţdegimo leukogramų kriterijus. Į stresinės
leukogramos grupę pateko 4 šunys, į uţdegiminės – 6. Susijaudinimo leukogramos stebėta nebuvo. Lyties, amţiaus ir kilmės predispozicija stresinei leukogramai vertinta nebuvo, tačiau iš visų pasitaikiusių (n=4) 100 proc. sudarė patinai, 4-11 metų amţiaus, pusę sudarė veisliniai, pusę mišrūnai. Literatūroje nurodoma, kad didesnį polinkį į hiperadrenokorticizmą turi patelės nei patinai (šios ligos atveju labiausiai tikėtina, kad gyvūno kraujo tyrimas rodys tipinę stresinę leukogramą) (41). Uţdegiminės leukogramos grupėje didesnę dalį sudarė patelės 67 proc., šunys buvo 4-10 metų amţiaus, pusę grupės sudarė įvairių veislių, pusę - mišrūnai. Išanalizavus visų šunų (n=21) anamnezes, 29 proc. pasireiškė kartu vėmimas ir apatija, 24 proc. turėjo skausmingą pilvą, 19 proc. buvo anemiški, polidipsija ir poliurija pasireiškė 14 proc., vėmimas ir viduriavimas - 9 proc., o padėję limfmazgiai 5 proc. šunų. Vertinant, kokius simptomus daţniausiai turėjo šunys, kuriems nustatyta stresinė leukograma, vėmimas ir apatija buvo pasireiškusi 50 proc. tiriamųjų, pavieniui pasireiškė polidipsija, poliurija, anemija ir skausmingas pilvas. Siejant simptomus su ligos diagnoze, 50 proc. šunų turėjo endokrininius sutrikimus (įtariamas hiperadrenokorticizmas ir hipotiroidizmas), likę pateko į traumų ir mechaninių paţeidimų kategoriją (kąstinės ţaizdos ir svetimkūnis stemplėje). Hiperadrenokorticizmas yra bene pagrindinė liga, kuria sergantis šuo turi stresinę leukogramą (limfocitozė, neutrofilija su poslinkiu į dešinę – subrendusiais neutrofilais, limfopenija, monocitozė ir eozinopenija). Kadangi vienam iš šunų buvo įtariamas hiperadrenokorticizmas, atlikus manualinį kraujo ląstelių skaičiavimą, stebėta stresinė leukograma – 16,00x109/L leukocitų, 13,75x109/L segmentuotų neutrofilų, 0,00x109/L eozinofilų, 0,00x109/L bazofilų, 0,5x109
/L limfocitų ir 1,05x109/L monocitų). Kraujas, tirtas hematologiniu analizatoriumi, parodė 17,32x109
/L leukocitų, 14,58x109/L neutrofilų, 0,01x109/L eozinofilų, 0,01x109/L bazofilų, 0,74x109/L limfocitų ir2,04x109/L monocitų. Šis atvejis sutapo su literatūroje aprašytais Kušingo sindromo atvejais, todėl įtarimas dėl ligos didėja. Literatūroje pastebėta, kad sergant hipotiroidizmu padidėja leukocitų ir segmentuotų neutrofilų kiekis, tai aiškinama antrinės kilmės infekcijų atsiradimu (pioderma, Malassezia spp. sukeltas dermatitas), kuris daţniausiai išsivysto esant nepakankamui sisteminiam imuniniam atsakui, ir dėl to susilpnėja vietinis imunitetas (patogeniniai mikroorganizmai lengviau praeina odos barjerą) (42,43,44). Kiti du šunys, kuriems nustatyta stresinė leukograma,jautė ilgalaikį skausmą, o literatūroje skausmas nurodomas kaip viena prieţasčių tokio tipo leukogramos atsiradimui (24,37).
Lyginant manualiniu metodu ir hematologiniu analizatoriumi LaserCyte Dx gautus duomenis, stebėta, kad metodai buvo panašūs leukocitų, neutrofilų ir monocitų kiekiais, o skyrėsi eozinofilų, limfocitų
ir bazofilų skaičiavimuose. Vertinant hematologinio analizatoriaus LaserCyte Dx rodiklius, nurodoma, kad galimos vertinimo klaidos, kai prastai diferencijuojami: limfocitai ir monocitai, monocitai ir neutrofilai, neutrofilai ir eozinofilai. (45). Literatūroje viename tyrime nurodoma, kad LaserCyte buvo rasti didesni kiekiai monocitų ir maţesni neutrofilų lyginant su manualiniu metodu, tokia tendencija buvo apie 45 proc. atvejų (46). Kitame šaltinyje teigiama, kad analizatorius neparodė limfopenijos 26 atvejams iš 34, kas sudaro 76,4 proc., taip pat patikslinamas limfopenijos buvimas kitais analizavimo metodais (47). Dar minima prielaida, kuriai išsiaiškinti reiktų išsamesnių tyrimų, kad galimas analizatoriaus klaidingai maţas leukocitų kiekio paskaičiavimas dėl agliutinacijos mėgintuvėlyje su EDTA (48). Atliekant tyrimą hemocitometru, rezultatas gali turėti nemaţai paklaidų dėl tyrėjo kompetencijos ir įgūdţių trūkumo, dėl netaisyklingai paruoštos Neubauerio kameros ir mėginio, taip pat ląstelių atpaţinimas gali būti painesnis dėl granulių nusidaţymo ne pagal normą (gali būti per trumpas ar per ilgas laikymo laikas Thoma-style pipetėje, daţų kokybė) ir tyrėjo klaidų, ţmogiškojo faktoriaus, pavyzdţiui, akimis prasčiau skiriamo spalvų spektro. Mėginį veikia laikas, kada kraujas paimtas ir kada atliktas tyrimas, ir temperatūra. Artefaktai, atsiradę dėl šių veiksnių, yra vieni daţnesnių klaidų tyrime, įrodymai. Kambario temperatūroje paliktas mėginys 2-4 valandoms arba šaldytuve 12 ir daugiau valandų, pasikeičia, vyksta degeneraciniai kraujo ląstelių (pirmiausia neutrofilų, monocitų) pokyčiai. Paveiktų ląstelių branduoliai kondensuojasi, ryškėja segmentiškumas, vėliau branduoliai jie darosi piknotiški ir fragmentuojasi, gali atsirasti neutrofilų ir monocitų citoplazmų vakuolėtumas. Teigiama, kad mėginys tikslumą praranda esant jame 10 proc. tokio tipo artefaktų. Diferencijuojant segmentuotus ir lazdelinius neutrofilus irgi galimos klaidos, ir dėl tyrėjo patirties stokos, ir dėl branduolio morfologijos, nes pasitaiko nemaţai tokių, kurie nėra tipinės C ar U formos, jų branduoliai ilgi, gali matytis panašumas į sąsmaukas (31).
Pastebėta, kaip du rodikliai – neutrofilų ir leukocitų skaičius – koreliuoja tarpusavyje. Stresinės leukogramos atvejų grupėje leukocitai statistiškai patikimai koreliavo su segmentuotais neutrofilais, o taireiškia didėjantį segmentuotų neutrofilų kiekį didėjant leukocitų kiekiui. Tai paaiškina faktą, kad stresinė leukograma neturi „poslinkio į kairę― ir cirkuliacijoje vyrauja segmentuoti, subrendę neutrofilai (33). Uţdegiminės leukogramos grupėje leukocitų kiekiui didėjant lazdelinių neutrofilų maţėjo. Tokia tendencija prieštarautų ūmaus ir chroniško uţdegimo atvejais, tačiau kalbant apie pernelyg stiprų uţdegimą (angl. overwhelming inflammation), toks rezultatas būtų tinkamas, nes įvyksta kraujodaros organų perdirginimas, dėl to kaulų čiulpai nebeišleidţia tokio didelio kiekio jaunų neutrofilų į cirkuliaciją. Tačiau tyrimo imtis ir tikslas nebuvo apie tai, todėl reikėtų kito tyrimo, didesnio tikslumo ir imties. Vienas atliktų tyrimų parodė, kad esant sepsiui, pastebėta neadekvati neutrofilų reakcija – negebėjimas migruoti link infekcijos ţidinio dėl chemokinų receptoriaus (CXCR2) praradimo/sumaţėjimo neutrofilų paviršiuje (tai
veikia desensibilizuojančiai) ir ląstelės negali būti veikiamos chemotaksio. Tokiu būdu neutrofilai negeba pereiti kraujagyslių barjero link infekcijos vietos ir akumuliuojasi kraujagyslėse (49).
Stresinė ir uţdegiminė leukograma sieta su gyvūno ligos simptomais ir diagnoze. Neutrofilija, kai daugiau lazdelinių nei segmentuotų neutrofilų, vadinama degeneraciniu poslinkiu į kairę ir stebima esant ūmesniems susirgimams, tokiems kaip piometra, bakterinė pneumonija, prostatitas, kartu daţnai atsiranda toksiniai neutrofilų pokyčiai. Tokio tipo poslinkis tyrime nebuvo stebėtas. Literatūros duomenimis esant tokiam poslinkiui tokie šunys turėjo didesnę tikimybę gaišti arba būti eutanazuoti, todėl teigta, kad tai gali būti svarus kriterijus prognozuojant pasveikimo tikimybę, ypač vyresnio amţiaus šunų (17). Neutrofilija, kai subrendusių neutrofilų daugiau nei lazdelinių, vadinama regeneraciniu poslinkiu į kairę (trump. RLS). Teigiama, kad pankreatito atveju 38 proc. gyvūnų turėjo RLS, tačiau ne vien esant infekcinėmis ligomis sergant tai pasireiškia, taip pat nurodoma, kad 43 proc. atvejų su RLS sirgo įgimtu širdies funkcijos nepakankamumu (50). Tyrime tiek stresinės leukogramos grupėje (didţiausias to paties gyvūno segmentuotų skaičius 13,75x109
/L, o lazdelinių 0,70x109
/L), tiek uţdegiminės (didţiausias lazdelinių skaičius 5,10x109/L, segmentuotų 12,95x109/L) segmentuotų neutrofilų kiekis buvo didesnis nei lazdelinių. Kalbant apie monocitozę, nurodoma, kad ji išsivysto itin daţnai esant babeziozei (apie 40 proc.) (50). Uţdegiminės leukogramos grupėje buvo šuo, kuriam diagnozuota bebziozė (manualiai suskaičiuoti monocitai siekė 2,00x109
/L). Stresinės leukogramos tiriamųjų grupėje infekcinių ligų nebuvo. Limfopenija stebima esant Kušingo sindromui (51 proc.), cukriniam diabetui ir sergant inkstų ligomis (apie 50 proc.), kepenų fukcijos sutrikimams (50). Kušingo sindromas pasitaikė stresinės leukogramos grupėje, o uţdegiminės – cukrinis diabetas (LYM 0,2 x109
/L). Vėmimas ir apatija – simptomai, kurie abiejose grupėse pasitaikė. Esant virškinamojo trakto problemoms, tai pasitaiko daţnai, nurodoma, kad net 70 proc. atvejų sergant cholangiohepatitu vėmimas ir apatija buvo, taip pat 60 proc. šunų, sirgusių pankreatitu irgi vėmė ir buvo apatiški (51,52).
Yra duomenų, kad navikiniai susirgimai gali daryti įtaką stresinės leukogramos pasireiškimui. Pavyzdţiui, vokiečių aviganiui, kuriam diagnozuota inkstų karcinoma, pirmąją dieną buvo matoma stresinė leukograma, kurioje nefiksuota jaunų lazdelinių neutrofilų, fiksuoti segmentuoti neutrofilai, leukocitozė, monocitozė (62). Šiame tyrime dėl maţos imties tiriamųjų ir stresinės leukogramos grupėje nepasitaikiusių navikinių susirgimų tai nebuvo tirta. Kalbant apie subrendusių ir nesubrendusių neutrofilų cirkuliavimą esant navikams, išskiriami su naviku susiję neutrofilai (angl.
tumor-associated neutrophils, TAN). TAN cirkuliuoja kelių tipų, pagal tai, kaip vyksta naviko
progresavimas. Skiriami nesubrendę neutrofilai (N2, pronavikiniai) ir subrendę neutrofilai (N1, antinavikiniai). N1 neutrofilai pasiţymi citotoksiškumu naviko ląstelėms, imunine atmintimi prieš navikines ląsteles ir geba stabdyti metastazių formavimąsi. N2 neutrofilai skatina naviko
angiogenezę ir augimą, tačiau tokiu būdu jie veikia kaip antigenus didinantis veiksnys, ir taip skatina T imuninių ląstelių, kartu N1 neutrofilų, proliferaciją ir aktyvaciją (63). Būtų galima kitame tyrime ištirti navikinių susirgimų ir stresinės leukogramos ryšį, nustatyti, koks jis, taip pat ir tai, ar padaugėja tik segmentuotų neutrofilų, ar stebima ir monocitozė, limfopenija.
Leukogramos vertinimas mikroskopuojant yra naudingas metodas rutininiuose laboratoriniuose tyrimuose, kurį atlikus galima įvertinti šuns būklės pokyčius nuo pirminio apsilankymo iki pasveikimo, pastebėti pakitimus, kurių hematologinis analizatorius negeba identifikuoti, ir vertinti ligos eigą. Tipinės stresinės leukogramos aptikimas atlikto tyrimo metu nebuvo daţnas. Daroma išvada, kad stresinė leukograma praktikoje nėra sutinkama daţnai.
4.IŠVADOS
1. Surinkus 21 šuns kraujo mėginį, diferencijuotos ir sudarytos dvi leukogramų grupės – stresinės ir uţdegiminės. Uţdegiminės leukogramos grupėje lyginant su stresinės leukogramos grupe buvo didesni šie rodikliai: leukocitų 1,9 karto, segmentuotų neutrofilų 1,8 karto, lazdelinių neutrofilų 2,7 karto, eozinofilų 2,8 karto, monocitų 1,7 karto, limfocitų 1,7 karto.
2. Iš 4 stresinės leukogramos atvejų 50 proc. pasitaikė endokrininiai sutrikimai (hiperadrenokorticizmas ir įtariamas hipotiroidizmas), 50 proc. traumos ir mechaniniai paţeidimai (kąstinės ţaizdos ir svetimkūnis stemplėje). Uţdegiminės leukogramos grupėje daţniausiai nustatyti gastrointestinaliniai susirgimai, su dominuojančiais simptomais – skausmingas pilvas, vėmimas ir apatija.
3. Nei gyvūnui pasireiškę klinikiniai simptomai, nei automatinio hematologinio analizatoriaus pateikiamas rezultatas, kai nevertinami lazdeliniai neutrofilai, nesuteikia galimybės įvertinti, ar hemogramoje matoma stresinė leukograma. Šią leukogramą galima identifikuoti, tik papildomai skaičiuojant lazdelinius neutrofilus. Gyvūnui nustačius stresinę leukogramą reikėtų tęsti diagnostiką ir įvertinti, ar nėra endokrininės sistemos ligų.
5. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Kritsepi-Konstantinou M., Oikonomidis I. L. The interpretation of leukogram in dog and cat. Ιατρική Ζώων Σσντροφιάς, 5 (2), 2016; p.1-7. Prieiga internetu: https://www.researchgate.net/profile/Ioannis_L_Oikonomidis/publication/320467243_The_i
nterpretation_of_leukogram_in_dog_and_cat_-_E_ermeneia_tou_leukokyttarogrammatos_sto_skylo_kai_ste_gata/links/59e7337fa6fdcc0e
882d8098/The-interpretation-of-leukogram-in-dog-and-cat-E-ermeneia-tou-leukokyttarogrammatos-sto-skylo-kai-ste-gata.pdf (2019-11-15)
2. Ţelvytė R., Ţymantienė J., Pamparienė I., Oberauskas V. Gyvūnų kraujo, širdies ir kraujotakos fiziologija, LSMU, Kaunas, 2015, p.7-16, 29-34.
3. Tobón-Castaño A, Mesa-Echeverry E, Miranda-Arboleda AF. Leukogram Profile and Clinical Status in vivax and falciparum Malaria Patients from Colombia. J Trop Med. 2015;2015:796182. Prieiga internetu: doi: 10.1155/2015/796182(2019-11-15)
4. Stephen D. G. 10 - INTERPRETATION OF THE LEUKOGRAM, Veterinary Clinical
Pathology Secrets, Mosby, 2004; p.38-44. Prieiga internetu:
https://doi.org/10.1016/B978-1-56053-633-8.50012-7 (2019-11-15)
5. Ahmed NH, Samantaray JC. Quantitative buffy coat analysis-an effective tool for diagnosing blood parasites. J Clin Diagn Res. 2014;8(4):DH01. Prieiga internetu: doi: 10.7860/JCDR/2014/7559.4258(2019-11-18)
6. Dr. Muhlnickel C. Interpretation of the Leukogram, AUSTRALIAN SPECIALISED ANIMAL
PATHOLOGY, ASAP Laboratory. Prieiga internetu:
http://www.asaplab.com.au/Portals/0/PDF/Webinars/ASAP%20leukocyte%20notes.pdf(201 9-11-18)
7. Tvedten H, Raskin RE. Leukocyte Disorders. Small Animal Clinical Diagnosis by
Laboratory Methods. 2012;63‐91. Prieiga internetu:doi:
https://doi.org/10.1016/B978-1-4377-0657-4.00004-1 (2019-11-15)
8. Charles W. B. Chapter 61 - Interpreting the Leukogram,Consultations in Feline Internal
Medicine (Fifth Edition),W.B. Saunders, 2006; p.585-594. Prieiga internetu: https://doi.org/10.1016/B0-72-160423-4/50064-0 (2019-11-15)
9. Papasouliotis K, Cue S, Crawford E, Pinches M, Dumont M, Burley K. Comparison of white blood cell differential percentages determined by the in-house LaserCyte hematology analyzer and a manual method. Vet Clin Pathol. 2006;35(3):295‐302.Prieiga internetu: DOI: 10.1111/j.1939-165x.2006.tb00134.x(2019-11-15)
10. Khan SA, Epstein JH, Olival KJ, et al. Hematology and serum chemistry reference values of stray dogs in Bangladesh. Open Veterinary Journal. 2011;1(1):13-20.Prieiga internetu: https://europepmc.org/article/PMC/4655752 (2019-11-19)
11. Katica M, Celebicic M, Gradascevic N, et al. Morphological Changes in Blood Cells After Implantation of Titanium and Plastic Clips in the Neurocranium - Experimental Study on Dogs. Medical Archives (Sarajevo, Bosnia and Herzegovina). 2017 Apr;71(2):84-88. Prieiga internetu: DOI: 10.5455/medarh.2017.71.84-88 (2019-11-18)
12. Fujino Y, Nakamura Y, Matsumoto H, et al. Development and evaluation of a novel in-clinic automated hematology analyzer, ProCyte Dx, for canine erythrocyte indices, leukogram, platelet counts and reticulocyte counts. J Vet Med Sci. 2013;75(11):1519‐1524. Prieiga internetu: DOI: 10.1292/jvms.13-0264 (2019-11-18)
13. Iazbik MC, Couto CG. Morphologic characterization of specific granules in Greyhound eosinophils. Vet Clin Pathol. 2005;34(2):140‐143. Prieiga internetu: DOI: 10.1111/j.1939-165x.2005.tb00027.x (2019-11-18)
14. Paul W. S. Chapter 5 - Diseases of Immunity1, Pathologic Basis of Veterinary Disease
(Sixth Edition), Mosby, 2017; p.242-285.e5. Prieiga
15. Cowell R.L., Tyler R.D., Meinkoth J.H., DeNicola D.B. Diagnostic cytology and hematology of the dog and cat, Mosby Elsevier, 2008;p.391,395,397.
16. Canine blood. Prieiga internetu: http://eclinpath.com/atlas/k9comp/
17. Burton, A.G. & Harris, L.A. & Owens, Sean & Jandrey, KarlThe Prognostic Utility of Degenerative Left Shifts in Dogs. Journal of veterinary internal medicine / American
College of Veterinary Internal Medicine,2013.27(6). Prieiga internetu: DOI: 10.1111/jvim.12208(2019-11-18)
18. Khatat SE, Culang D, Gara-Boivin C. Granulocytic anaplasmosis in 2 dogs from Quebec. Can Vet J. 2018;59(6):663‐667. Prieiga internetu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5949946/ (2019-11-25)
19. Rossi S, Gelain ME, Comazzi S. Disseminated histiocytic sarcoma with peripheral blood involvement in a Bernese Mountain dog. Vet Clin Pathol. 2009;38(1):126‐130. Prieiga internetu: DOI: 10.1111/j.1939-165X.2008.00104.x(2019-11-25)
20. Neel J.A. Blood smear basics, CLINICAL PATHOLOGY NC STATE COLLEGE OF
VETERINARY MEDICINE RALEIGH, NC, 2016.Prieiga internetu:
https://cvm.ncsu.edu/wp-content/uploads/2016/09/Blood-Smear-Basics-2016.pdf (2019-11-25)
21. Tizard I.R. et. al. Veterinary immunology, Ninth Edition, Elsevier, 2013; p.222-224.
22. Mesarcova L., Kottferova J., Skurkova L., Leskova L., Kmecova N. Analysis of cortisol in dog hair – a potential biomarker of chronic stress: a review, Veterinarni Medicina, 62, 2017; (07): 363–376. Prieiga internetu: https://www.agriculturejournals.cz/publicFiles/19_2017-VETMED.pdf (2020-01-20)
23. Archer T. Top 5 suggestions of canine hyperadrenocorticism, Mississippi State University, 2018. Prieiga internetu: https://files.brief.vet/2018-09/Top%205%20Suggestions%20of%20Canine%20Hyperadrenocorticism.pdf (2019-12-20)
24. Lake-Bakaar G.A. Aortic trombosis in dogs: 31 cases (2000-2010), Journal of the American
Veterinary Medical Association, 2012; 241(7), p.910-915. Prieiga internetu: https://doi.org/10.2460/javma.241.7.910 (2019-12-20)
25. Sadykova Y.R., Krylova I.O., Kornilova E.A., Tikhonova T.V. Hematologic markers of stress resistance of service Belgian Shepherd Dog (Malinois), IOP Conf. Series: Earth and
Environmental Science 421, 2019. Prieiga internetu:
https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1755-1315/421/2/022021/pdf (2020-01-20) 26. https://d45jl3w9libvn.cloudfront.net/jaypee/static/books/9789386107961/Chapters/images/5
5-1.jpg(2020-01-20)
27. https://i.pinimg.com/originals/47/aa/e7/47aae70f27b29ad6eda0b731ac0c8d8e.jpg
28. Banasic J.L. Inflammation and Imunity, Basic Medical Key, 2016. Prieiga internetu: https://basicmedicalkey.com/inflammation-and-immunity/(2020-01-21)
29. Honda T, Uehara T, Matsumoto G, Arai S, Sugano M. Neutrophil left shift and white blood cell count as markers of bacterial infection. Clin Chim Acta, 2016;457:46-53. Prieiga internetu: DOI: 10.1016/j.cca.2016.03.017(2020-01-21)
30. Garland M.Common morphological changes seen in canine and feline haematology — leukocytes, Veterinary Nursing Journal, 2014; Vol. 26/3. Prieiga internetu: https://doi.org/10.1111/j.2045-0648.2010.00024.x(2020-01-21)
31. Zabolotzky, SM, Walker, DB. Peripheral Blood Smears. In: Valenciano, AC, Cowell, RL (eds). Cowell and Tyler’s diagnostic cytology and hematology of the dog and cat. 4th ed. St
Louis, MO: Elsevier, 2014, p. 438–467. Prieiga internetu: DOI:
doi.org/10.1016/B978-0-323-53314-0.00026-2(2020-01-21)
32. Zaldívar-López, S., Marín, L. M., Iazbik, M. C., Westendorf-Stingle, N., Hensley, S., & Couto, C. G. Clinical pathology of Greyhounds and other sighthounds. Veterinary clinical
pathology, 2011; 40(4), 414–425. Prieiga internetu:
