FARMACIJOS FAKULTETAS
NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS, NEUROTOKSIKOLOGIJOS LABORATORIJA
RENALDAS PAVYDIS
KARČIOJO KIEČIO (LOT. ARTEMISIA ABSINTHIUM)
VANDENINIO EKSTRAKTO PROTEKCINIO POVEIKIO
ĮVERTINIMAS EKSPERIMENTINIAME MODELYJE IN VIVO
VEIKIANT KADMIU
Magistro baigiamasis darbasDarbo vadovė Dr. Dalė Baranauskienė
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS FARMACIJOS FAKULTETAS NEUROMOKSLŲ INSTITUTAS, NEUROTOKSIKOLOGIJOS LABORATORIJA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof. Vitalis Briedis
Data
KARČIOJO KIEČIO (LOT. ARTEMISIA ABSINTHIUM) VANDENINIO EKSTRAKTO PROTEKCINIO POVEIKIO ĮVERTINIMAS EKSPERIMENTINIAME MODELYJE IN VIVO
VEIKIANT KADMIU Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovė
Dr. Dalė Baranauskienė Data
Recenzentas Darbą atliko
Vardas, pavardė, parašas Magistrantas Renaldas Pavydis
Data Data
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8 1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 101.1. Sunkieji metalai ir jų poveikis žmogaus organizmui ... 10
1.2. Kadmis ... 11
1.2.1. Kadmio patekimas į organizmą, absorbcija ir pasiskirstymas ... 12
1.2.2. Kadmio toksiškumo mechanizmas ir jo poveikis žmogaus organizmui ... 12
1.2.3. Kadmio intoksikacijos gydymas ... 14
1.3. Kartusis kietis ... 15
1.3.1. Karčiojo kiečio kaupiamos veikliosios medžiagos ... 16
1.3.2. Karčiojo kiečio preparatų poveikis ... 17
1.3.3. Karčiojo kiečio preparatų vartojimo indikacijos ir nepageidaujamas poveikis ... 18
2. TYRIMO METODAI ... 20
2.1. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos atranka tyrimui ... 20
2.1.1. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos surinkimas ir paruošimas ... 20
2.1.2. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos mineralizavimas ... 20
2.1.3. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos toksikologinė analizė ... 21
2.3. Eksperimentinis modelis ... 24
2.2. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto paruošimas ... 25
2.3.1. Laboratoriniai gyvūnai ir jų laikymo sąlygos ... 25
2.3.2. Kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas ... 26
2.3.3. Pasirengimas eksperimentui ... 26
2.3.4. Fiziologinių rodiklių vertinimas ... 27
2.3.5. Laboratorinių gyvūnų eutanazavimas ir organų mėginių paėmimas ... 27
2.3.6. Organų mėginių paruošimas analizei ... 28
2.4. Statistinė duomenų analizė ... 28
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 29
3.2. Laboratorinių gyvūnų imtis, charakteristika ir fiziologiniai rodikliai ... 31
3.3. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi kepenyse ... 32
3.4. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi inkstuose ... 34
3.5. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi smegenyse ... 35
3.6. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi širdyje ... 36
4. IŠVADOS ... 38
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 39
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 40
SANTRAUKA
R. Pavydžio magistro baigiamasis darbas. Karčiojo kiečio (lot. Artemisia Absinthium) protekcinio poveikio įvertinimas in vivo eksperimentiniame modelyje su laboratoriniais gyvūnais, veikiant sunkiuoju metalu kadmiu. Mokslinė vadovė dr. D. Baranauskienė. Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Neuromokslų institutas, Neurotoksikologijos laboratorija, Kaunas 2014.
Pagrindinis šio tyrimo tikslas buvo įvertinti karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto protekcinį poveikį kepenims, inkstams, širdžiai ir smegenims eksperimentiniame modelyje in vivo, veikiant kadmiu. Tyrimams atrinkta Švenčionių rajone surinkta karčiojo kiečio vaistinė augalinė žaliava, kurioje nustatyta mažiausia kadmio koncentracija (0,215±0,100 µg/g) lyginant su žaliavomis iš Vilkaviškio ir Ukmergės rajonų bei su augaline žaliava įsigyta vaistinėje. Siekiant įvertinti karčiojo kiečio protekcinį poveikį pasirinktas eksperimentinis modelis in vivo, kurį sudarė karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto paruošimas, kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas, fiziologinių rodiklių vertinimas, organų mėginių paėmimas, mineralizavimas ir toksikologinė analizė. Tyrimui pasirinkti subrendę Wistar linijos žiurkių patinai. Kontrolinės grupės žiurkės 30 d. iš eilės buvo girdomos geriamuoju vandeniu ad libitum, Cd grupės žiurkės - kadmio chlorido vandeniniu tirpalu (2 mg/l) ad libitum, Cd+KKVE grupės žiurkės - kadmio chlorido vandeniniu tirpalu (2 mg/l) ad libitum ir karčiojo kiečio vandeniniu ekstraktu 200 mg/kg/d per os. Eutanazija atlikta 31 eksperimento dieną. Paimti kepenų, inkstų, širdies ir smegenų mėginiai mineralizuoti naudojant mineralizatorių „Multiwave 3000“. Kadmio koncentracijos nustatymas atliktas „Perkin-Elmer Zeeman 3030“ elektroterminiu atominiu absorbciniu spektrofotometru.
Kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių kepenyse buvo 0,012±0,006 µg/g, Cd grupės – 0,245±0,185 µg/g, Cd+KKVE grupės – 0,094±0,065 µg/g. Kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių inkstuose buvo 0,055±0,013 µg/g, Cd grupės – 1,939±1,164 µg/g, Cd+KKVE grupės – 1,064±0,278 µg/g. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių inkstuose vidutiniškai 1,82 karto lyginant su Cd grupe. Kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių smegenyse buvo 0,016±0,012 µg/g, Cd grupės – 0,008±0,004 µg/g, Cd+KKVE grupės – 0,006±0,002 µg/g; kontrolinės grupės laboratorinių gyvūnų širdyje – 0,019±0,011 µg/g, Cd grupėje – 0,033±0,018 µg/g, Cd+KKVE grupėje – 0,025±0,020 µg/g. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas statistiškai reikšmingai (p=0,007) sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių kepenyse vidutiniškai 2,6 karto lyginant su Cd grupe, t.y. pasižymėjo hepatoprotekciniu poveikiu, kuris pasireiškė padidinta kadmio ekskrecija iš organizmo. Nors karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių inkstuose, smegenyse ir širdyje, tačiau statistiškai reikšmingų pokyčių nenustatyta (p>0,050).
SUMMARY
Master thesis of R. Pavydis. The Assessment of wormwood (Artemisia Absinthium) protective activity in experimental model in vivo with orally administrated heavy metal cadmium. Scientific supervisor PhD D. Baranauskiene. Lithuanian University of Health Sciences, Neuroscience Institute, Laboratory of Neurotoxicology. Kaunas 2014.
The main objective was to assess wormwood aqueous extract protective activity for rat liver, kidney, heart and brain in experimental model in vivo with orally administrated heavy metal cadmium.
Wormwood plant material selected for this study was collected in Švenčioniai region. Plant material had the lowest average cadmium concentration (0.215±0.100 µg/g) compared with plant materials of Vilkaviškis and Ukmergė regions and plant material purchased from pharmacy. We established experimental animal model in vivo, with the aim to evaluate protective effects of wormwood. Experimental model consisted of wormwood aqueous extract preparation, control and experimental groups formation, physiological parameters evaluation, organ sampling, mineralization and toxicological analysis. Adult male Wistar rats were selected for the study. Control group rats were administrated with drinking water ad libitum, Cd group rats - with cadmium chloride aqueous solution (2 mg/l) ad libitum, Cd+KKVE group rats - with cadmium chloride aqueous solution (2 mg/l) ad libitum and wormwood aqueous extract 200 mg/kg/day orally for 30 consecutive days. After euthanasia on the 31st day of the experiment, liver, kidney, heart, and brain samples were mineralized using mineralizator Multiwave 3000. Cadmium concentrations were estimated with Perkin – Elmer Zeeman 3030 electrothermal atomic absorption spectrophotometer.
Average cadmium concentration in control group rat liver was 0.012±0.006 µg/g, Cd group – 0.245±0.185 µg/g, Cd+KKVE group – 0.094±0.065 µg/g. Average cadmium concentration in control group rat kidney was 0.055±0.013 µg/g, Cd group – 1.939±1.164 µg/g, Cd+KKVE group – 1.064±0.278 µg/g. Wormwood aqueous extract reduced cadmium accumulation in rat kidney of 1.82 times compared to Cd group. Average cadmium concentration in control group rat brain was 0.016±0.012 µg/g, Cd group – 0.008±0.004 µg/g, Cd+KKVE group – 0.006±0.002 µg/g; in control group rat heart - 0.019±0.011 µg/g, Cd group – 0.033±0.018 µg/g, Cd+KKVE group – 0.025±0.020 µg/g. Wormwood aqueous extract significantly (p=0.007) reduced cadmium accumulation in rat liver of 2.6 times compared to the Cd group. This shows hepatoprotective effect of wormwood aqueous extract via increased cadmium excretion from the organism. Even though wormwood aqueous extract reduced cadmium accumulation in rat kidney, brain and heart, but these changes were not statistically significant (p>0.050).
SANTRUMPOS
4,5-ODCQA – 4,5-O–dikafeoilkvininė rūgštisDMPS – 2,3-dimerkapto–1-propanesulfoninė rūgštis DMSA – dimerkaptosukcininė rūgštis
EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis
KKVE – karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas Ph. Eur. – Europos farmakopėja
SN – standartinis nuokrypis (angl. Standard deviation) TNF-α – tumoro nekrozės faktorius α
ĮVADAS
Sunkieji metalai – vieni toksiškiausių elementų. Esant didelėms jų koncentracijoms aplinkoje arba kumuliuojantis organizme, gali kilti rimtų sveikatos problemų ar net mirtis. Specifinį lėtinį toksinį poveikį organizmui esant mažoms sunkiųjų metalų koncentracijoms gali sukelti kadmis [16, 23, 48, 89], švinas [21, 90, 101] ir gyvsidabris [11, 17, 67, 91] ir kt. Jie neatlieka jokių būtinų funkcijų biocheminiuose organizmo procesuose, tačiau pasižymi įvairaus pobūdžio sunkiu toksiškumu skirtingose organų sistemose.
Tyrimais įrodyta, kad kadmis yra vienas toksiškiausių sunkiųjų metalų žmogaus organizmui. Pasireiškus kadmio toksiniam poveikiui atsiranda ląstelių bei organizmo metabolizmo procesų pokyčių įvairiuose organizmo audiniuose: kepenyse ir kasoje [65], inkstuose ir kauluose [29], antinksčiuose [5], sėklidėse [47].
Kadmis į žmogaus organizmą gali patekti natūralių gamtinių procesų metu ir dėl antropogeninės veiklos. Į aplinką kadmio patenka kartu su iškastinio kuro degimo produktais, fosforo trąšomis, pesticidais, tabako dūmais, automobilių padangų dulkėmis. Kadmis į organizmą patenka ne tik dėl pramonės taršos, bet ir per užterštą vandenį, maistą [53], taip pat per cigarečių dūmus [70].Kadmis pasižymi labai ilgu pusinės eliminacijos laiku (nuo 10 iki 30 metų) ir daugiausiai kaupiasi inkstuose ir kepenyse. Netgi labai maži kadmio kiekiai esant lėtiniam apsinuodijimui kadmiu gali sukelti inkstų nepakankamumą, kraujo spaudimo sutrikimus, kaulų struktūros pokyčius ir nulemti osteoporozės išsivystymą [49]. Toksinis kadmio poveikis taip pat yra siejamas su kvėpavimo takų uždegiminiais procesais, širdies ir kraujagyslių ligomis, diabetu [28, 32, 44], centrinės nervų sistemos bei neurologiniais sutrikimais [15]. Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra klasifikuoja kadmį kaip nustatytą/žinomą kancerogeną [82].
Literatūroje nėra bendro sutarimo, kaip kadmis turėtų būti šalinamas iš organizmo ar kaip gydyti jo toksiškumą [10]. Yra atlikti tik keli tyrimai su žmonėmis ir jų rezultatai yra abejotini. Klinikinėje praktikoje daugiausiai yra naudojami cheminiai junginiai, priskiriami cheluojančioms medžiagoms, taip pat vis plačiau tyrinėjami vaistinių augalų ekstraktai, kurie galėtų pasižymėti apsauginėmis savybėmis nuo kadmio toksinio poveikio.
Atlikta nemažai tyrimų, rodančių karčiojo kiečio ekstrakto poveikį įvairiems sveikatos sutrikimams gydyti [6, 9, 25, 36, 37]. Tyrinėjant sunkiųjų metalų intoksikacijos gydymą labai svarbus karčiojo kiečio ekstrakto antioksidacinis ir radikalus neutralizuojantis poveikis. Tyrimai parodė, kad šis ekstraktas pasižymi stipriu laisvuosius radikalus neutralizuojančiu poveikiu, taip pat gebėjimu užkirsti
kelią lipidų peroksidacijai ir laisvųjų radikalų grandininėms reakcijoms [9].Keliuose tyrimuose parodytas karčiojo kiečio ekstrakto hepatoprotekcinis poveikis esant chemiškai ir imunologiškai indukuotam kepenų funkcijos pažeidimui [6, 25]. Šis karčiojo kiečio apsauginis poveikis siejamas su ekstrakto antioksidaciniu aktyvumu ir imunomoduliacinėmis savybėmis. Moksliniuose tyrimuose nustatytas karčiojo kiečio protekcinis poveikis esant intoksikacijai švinu. Atliktos studijos rezultatai parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas atstatė fermentų veiklą, kuri buvo sutrikdyta švino poveikio, ir turėjo apsauginį poveikį nuo lipidų peroksidacijos [37]. Kita studija parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas atkūrė normalų membranos fermentų ir lipidų kiekį kraujyje, turėjo reikšmingą antioksidacinį aktyvumą ir apsaugojo laboratorinių gyvūnų kepenis ir inkstus nuo toksinio švino poveikio [36].
Remiantis atliktų tyrimų duomenimis iškelta hipotezė, kad karčiojo kiečio ekstraktas gali pasižymėti apsauginiu poveikiu esant intoksikacijai kadmiu. Pagrindinis šio tyrimo tikslas – įvertinti karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto protekcinį poveikį kepenims, inkstams, širdžiai ir smegenims eksperimentiniame modelyje in vivo, veikiant kadmiu.
DARBO TIKSLAS
Įvertinti karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto protekcinį poveikį kepenims, inkstams, širdžiai ir smegenims eksperimentiniame modelyje in vivo, veikiant kadmiu.
DARBO UŽDAVINIAI
1. Atrinkti tinkamiausią Karčiojo kiečio vaistinę augalinę žaliavą su mažiausiu sunkiųjų metalų kiekiu, tiriant Karčiojo kiečio žolę surinktą skirtinguose Lietuvos rajonuose ir vaistinę augalinę žaliavą, įsigytą vaistinėje;
2. Įvertinti Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto protekcinį poveikį žiurkių kepenims; 3. Įvertinti Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto protekcinį poveikį žiurkių inkstams;
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.1. Sunkieji metalai ir jų poveikis žmogaus organizmui
Sunkieji metalai – tai tokie metalai, kurių tankis yra didesnis kaip 5 g/cm3 [31]. Nors daugelio sunkiųjų metalų (kobalto, vario, mangano, molibdeno, vanadžio, stroncio ir cinko) nedideli kiekiai yra būtini organizmo vystymuisi bei gyvybinių procesų užtikrinimui, tačiau sunkieji metalai taip pat yra ir vieni toksiškiausių elementų. Esant didelėms sunkiųjų metalų koncentracijoms aplinkoje arba jiems kumuliuojantis organizme, gali kilti rimtų sveikatos problemų ar net mirtis.
Sunkiuosius metalus pagal jų pavojingumą organizmui galima suskirstyti į netoksiškus, mažo toksiškumo ir vidutinio/didelio toksiškumo elementus (1 lentelė) [99].
1 lentelė. Sunkieji metalai pagal jų toksiškumą žmogaus organizmui [99] Netoksiški sunkieji
metalai Mažo toksiškumo sunkieji metalai
Vidutinio/didelio toksiškumo sunkieji metalai Bismutas (Bi) Geležis (Fe) Manganas (Mn) Molibdenas (Mo) Auksas (Au) Baris (Ba) Ceris (Ce) Disprozis (Dy) Erbis (Er) Europis (Eu) Gadolinis (Gd) Galis (Ga) Germanis (Ge) Holmis (Ho) Iterbis (Yb) Neodimis (Nd) Prazeodimis (Pr) Prometis (Pr) Renis (Re) Rodis (Rh) Samaris (Sm) Terbis (Tb) Tulis (Tm) Aktinis (Ac) Arsenas (As) Berilis (Be) Boronas (Bo) Chromas (Cr) Cinkas (Zn) Cirkonis (Zr) Gyvsidabris (Hg) Hafnis (Hf) Indis (In) Iridis (Ir) Kadmis (Cd) Kobaltas (Co) Nikelis (Ni) Niobis (Nb) Osmis (Os) Paladis (Pd) Platina (Pt) Polonis (Po) Radis (Ra) Rutenis (Ru) Sidabras (Ag) Švinas (Pb) Talis (Tl) Tantalas (Ta) Toris (Th) Vanadis (V) Varis (Cu) Volframas (W)
Kaip minėta anksčiau, dauguma sunkiųjų metalų ir jų junginių pasižymi toksiniu poveikiu žmogaus organizmui. Yra žinoma, kad sunkieji metalai sukelia biomolekulių oksidacinį irimą,
inicijuodami laisvųjų radikalų medijuojamas grandinines reakcijas, kurios nulemia riebalų peroksidaciją, baltymų oksidaciją bei DNR ir RNR oksidacinius procesus [22].
Specifinį lėtinį toksinį poveikį organizmui esant mažoms sunkiųjų metalų koncentracijoms gali sukelti gyvsidabris, kadmis, berilis, manganas, švinas, volframas, cirkonis, vanadis, ir kt. Kadmis [16, 23, 48, 89], švinas [21, 90, 101] ir gyvsidabris [11, 17, 67, 91] neatlieka jokių būtinų funkcijų biocheminiuose organizmo procesuose, tačiau sukelia įvairaus pobūdžio sunkų toksiškumą skirtingose organų sistemose. Jie jungiasi prie audinių, sukelia oksidacinį stresą, paveikia endokrininę sistemą, trikdo esminių katijonų tokių kaip cinkas ir magnis funkcijas.
Sunkieji metalai kelia ypatingą pavojų jaunam organizmui [72]. Kūdikiams ir vaikams esant sunkiųjų metalų poveikiui gali pasireikšti vystymosi, fiziniai ir intelekto sutrikimai. Suaugusiems jie sukelia sunkias lėtines ligas [105], tokias kaip širdies ir kraujagyslių sistemos ligos, kepenų, inkstų ligos, neurologiniai sutrikimai, onkologinės ligos, urologiniai, reprodukcinių funkcijų sutrikimai, taip pat pažeidžiamas imunitetas [76]. Sunkiųjų metalų toksinis poveikis gali likti nenustatytas, nes jis gali pasireikšti tik po kelių ar keliasdešimties metų. Dėl ilgalaikės sunkiųjų metalų kumuliacijos organizme, jų poveikis gali pasireikšti kancerogeniniu, mutageniniu, ir embriotoksiniu veikimu [26].
1.2. Kadmis
Kadmis (Cd) - 48-asis IIB grupės periodinės elementų lentelės elementas, minkštas ir tąsus sunkusis metalas, metališkas, sidabriškai pilkas [103]. Kadmio fizikocheminės savybės pateiktos 2 lentelėje.
2 lentelė. Kadmio fizikocheminės savybės [98]
Grupė 12 Lydymosi temperatūra 321ºC
Periodas 5 Virimo temperatūra 767ºC
Atominis skaičius 48 Šiluminis laidumas 96,60 W/(m·K)
Atominė masė 112,41 g/mol Lydymosi šiluma 6,21 kJ/mol
Tankis 8,65 g/cm³ Garavimo šiluma 99,87 kJ/mol
Kadmis yra vienas plačiausiai pramonėje naudojamų sunkiųjų metalų. Jis yra naudojamas atominėje pramonėje, įvairių dažų, liuminoforų, šarminių akumuliatorių gamyboje [69]. Kadangi kadmis
yra atsparus korozijai, jis yra naudojamas galvaninių elementų padengimui. Kadmis taip pat gali būti naudojamas ir lydiniuose su kitais metalais. Šie lydiniai plačiai naudojami automobilių pramonėje.
1.2.1. Kadmio patekimas į organizmą, absorbcija ir pasiskirstymas
Kadmis į žmogaus organizmą gali patekti natūralių gamtinių procesų metu ir dėl antropogeninės veiklos. Į aplinką kadmio patenka kartu su iškastinio kuro degimo produktais, fosforo trąšomis, pesticidais, tabako dūmais, automobilių padangų dulkėmis. Pagrindiniai kadmio patekimo į organizmą keliai yra per burną ir per kvėpavimo sistemą, su užterštu vandeniu bei maistu [53]. Kadmiu gali būti užteršti tokie maisto produktai kaip lapinės daržovės, gyvūnų vidaus organai (inkstai, kepenys), žuvis [104], jūros gėrybės, vėžiagyviai bei žvėriena [93]. Taip pat kadmio yra ir cigarečių dūmuose, kadangi augalas Paprastasis tabakas (lot. Nicotiana tabacum) iš kurio daugiausiai gaunamas tabakas cigarečių gamybai, yra linkęs kaupti kadmį, esantį dirvožemyje [70].
Po kadmio absorbcijos, jis yra transportuojamas į skirtingas organizmo vietas ir dažniausiai prisijungia prie sieros grupę turinčių baltymų, tokių kaip metalotioneinai. Apie 20–30 proc. kadmio nusėda kepenyse, dar 30 proc. – inkstuose. Likęs kadmio kiekis pasiskirsto kituose organizmo audiniuose ir organuose [8].
Kadmis pasižymi labai ilgu pusinės eliminacijos laiku, kuris svyruoja nuo 10 iki 30 metų, ir vidutiniškai yra 25 metai [8]. Kadmio pusinės eliminacijos laikas kraujyje yra apie 75–128 dienos, tačiau jis neparodo realaus kadmio klirenso [30]. Taigi kadmio kiekis kraujyje, plaukuose bei šlapime negali gerai atspindėti apsinuodijimo kadmiu, o tik atspindi neseną kadmio ekspoziciją.
1.2.2. Kadmio toksiškumo mechanizmas ir jo poveikis žmogaus organizmui
Kadmio toksinis poveikis organizmui pasireiškia dėl šio sunkiojo metalo sukeliamo oksidacinio streso [19, 48, 61], epigenetinių DNR ekspresijos pokyčių [45, 46, 85], taip pat dėl medžiagų transporto kelių blokavimo ar slopinimo [79, 81, 84] proksimaliniuose inkstų kanalėliuose. Kadmis konkurenciniu būdu keičia cinko ir magnio fiziologinius procesus [52, 74], blokuoja hemo sintezę [71], pakeičia mitochondrijų funkcijas sukeldamas ląstelių apoptozę [14]. Kadmis taip pat jungiasi prie baltymų sulfidinių grupių ir keičia baltymų struktūrą [80].
Kaip jau minėta, pagrindiniai organai, kuriuose kaupiasi kadmis, yra inkstai ir kepenys. Kadmiui kaupiantis inkstuose, stebimi baltymų, aminorūgščių, gliukozės, bikarbonatų ir fosfatų reabsorbcijos pokyčiai. Juos sukelia baltymų transporto sutrikimus lemiantis oksidacinis stresas, kuris nulemia baltymų transporto sutrikimus bei inkstų kanalėlių ląstelių apoptozę sąlygojantys pokyčiai mitochondrijose [24, 66].
Kadmis taip pat gali paveikti normalią kaulų homeostazę, pablogindamas vitamino D metabolizmą inkstuose [39]. Dėl poveikio vitamino D metabolizmui, neigiamos įtakos kalcio absorbcijai žarnyne bei kolageno metabolizmo sutrikdymo, kadmis gali sukelti osteomaliaciją arba osteoporozę, o esant didelėms kadmio koncentracijoms organizme – abu šiuos kaulų homeostazės sutrikimus kartu [55]. Tyrimais įrodyta, kad kadmis yra vienas toksiškiausių sunkiųjų metalų žmogaus organizmui. Esant kadmio toksiniam poveikiui atsiranda ląstelių bei organizmo metabolizmo procesų pokyčių įvairiuose organizmo audiniuose: kepenyse ir kasoje [65], inkstuose ir kauluose [29], antinksčiuose [5], sėklidėse [47].
Kaip jau minėta, kadmis pasižymi labai ilgu pusinės eliminacijos laiku, kuris gali trukti nuo 10 iki 30 metų. Daugiausiai kadmis kaupiasi inkstuose ir kepenyse. Netgi labai maži kadmio kiekiai esant lėtiniam apsinuodijimui kadmiu gali sukelti inkstų nepakankamumą, kraujo spaudimo sutrikimus, diabeto komplikacijas. Taip pat toksinis kadmio poveikis gali sukelti kaulų struktūros pokyčius ir nulemti osteoporozės išsivystymą [49]. Toksinis kadmio poveikis taip pat yra siejamas su kvėpavimo takų uždegiminiais procesais, širdies ir kraujagyslių ligomis, diabetu [28, 32, 44].
Kadmis gali paveikti ir centrinę nervų sistemą bei sukelti neurologinius sutrikimus [15]. Pagrindiniai su šiais sutrikimais susiję simptomai yra galvos skausmas ir svaigimas, vertigo, pusiausvyros sutrikimai, uoslės sutrikimai, ekstrapiramidiniai, į Parkinsono ligą panašūs simptomai, vazomotorinės funkcijos sulėtėjimas, periferinės neuropatijos, sumažėjęs sugebėjimas susikaupti, mokymosi sutrikimai [38, 50, 95].
Tarptautinė vėžio tyrimų agentūra (angl. International Agency for Research on Cancer) klasifikuoja kadmį kaip nustatytą/žinomą kancerogeną [82]. Epidemiologiniai ir eksperimentiniai tyrimai parodė, kad toksinis kadmio poveikis yra tiesiogiai susijęs su plaučių vėžiu, taip pat ir su kitais onkologiniais susirgimais tokiais kaip prostatos, krūties, inkstų, kepenų, kraujodaros sistemos, šlapimo pūslės, kasos, sėklidžių ir skrandžio vėžiu [2, 33, 63].
1.2.3. Kadmio intoksikacijos gydymas
Literatūroje nėra jokio bendro sutarimo, kaip kadmis turėtų būti šalinamas iš organizmo ar kaip gydyti jo toksiškumą [10]. Yra atlikti tik keli tyrimai su žmonėmis ir jų rezultatai yra abejotini. Klinikinėje praktikoje daugiausiai yra naudojami cheminiai junginiai, priskiriami cheluojančioms medžiagoms. Vis plačiau tyrinėjami vaistinių augalų preparatai, ypač ekstraktai, kurie galėtų pasižymėti apsauginėmis savybėmis nuo toksinio kadmio poveikio. Atlikti tyrimai plačiau aptarti 1.2.3.1 ir 1.2.3.2 skirsniuose.
1.2.3.1. Kadmio intoksikacijos gydymas cheluojančiomis medžiagomis
Kaip jau minėta, esant apsinuodijimui kadmiu daugiausiai yra naudojami cheluojančioms medžiagoms priskiriami junginiai, tokie kaip etilendiamintetraacto rūgštis (EDTA), 2,3-dimerkapto–1-propanesulfoninė rūgštis (DMPS) ir dimerkaptosukcininė rūgštis (DMSA) [4, 7], didinantys kadmio ekskreciją su šlapimu. Iš jų didžiausią pritaikymą turi EDTA. Šių medžiagų naudojimas yra patvirtintas remiantis ikiklinikinių tyrimų patirtimi in vitro ir in vivo su laboratoriniais gyvūnais [12]. Manoma, kad pašalinto iš organizmo kadmio kiekis yra tiesiogiai proporcingas toksinio poveikio mažėjimui organizme. Kaip bebūtų, yra duomenų įrodančių, kad net ir šalinant kadmį iš organizmo, chelavimo terapija gali dar labiau pabloginti kadmio toksinį poveikį inkstams dėl kadmio šalinimo per inkstus [56].
EDTA naudojimas, esant apsinuodijimui švinu ir kitais sunkiaisiais metalais, yra patvirtintas Jungtinių Amerikos Valstijų Maisto ir vaistų administracijos (angl. Food and Drug Administration). EDTA neturėtų būti skiriamas didesne doze nei 1 g/val. ir ne daugiau kaip 3 g vieno vartojimo metu. Tarp EDTA vartojimo turėtų būti ne mažesnė nei 5 dienų pertrauka [4, 7].
1.2.3.2. Kadmio intoksikacijos gydymas augaliniais vaistiniais preparatais
Pastaruoju metu atliekama vis daugiau tyrimų, kuriuose tiriamas vaistinių augalų apsauginis poveikis skirtingiems laboratorinių gyvūnų organams ar organų sistemoms esant apsinuodijimui kadmiu. Nustatytas kvapiojo baziliko (lot. Ocimum basilicum) [68], valgomojo svogūno (lot. Allium cepa) [27, 59], valgomojo česnako (lot. Allium sativum) [59] bei gvaraninės paulinijos, geriau žinomos kaip guarana (lot. Paullinia cupana) [43] ekstraktų protekcinis poveikis laboratorinių gyvūnų sėklidėms ir
reprodukcinei funkcijai. Taip pat nemažai autorių tyrė vaistinių augalų apsaugines savybes inkstams bei kepenims. Nustatyta, kad esant kadmio toksiškumui, didžiosios ugniažolės (lot. Chelidonium majus) lapų metanolinis ekstraktas pasižymėjo nefroprotekciniu poveikiu [40], o kininio ženšenio (lot. Panax ginseng) bei plokščiosios vingrūnės (lot. Spirulina platensis) ekstraktai [35, 60, 75] - hepatoprotekciniu poveikiu. Apsauginį poveikį tiek laboratorinių gyvūnų kepenims, tiek inkstams turėjo valgomojo svogūno (lot. Allium cepa) [57, 58], valgomojo česnako (lot. Allium sativum) [57, 58, 77] bei kvapiojo mairūno (lot. Origanum majorana) ekstraktai [73]. Karčiojo kiečio (lot. Artemisia absinthium) gydomosios ir protekcinės savybės aptartos skirsnyje 1.3.2. Karčiojo kiečio preparatų poveikis.
1.3. Kartusis kietis
Kartusis kietis (lot. Artemisia absinthium) - astrinių (lot. Asteraceae) šeimos vaistinis augalas (1 pav.), plačiai paplitęs daugelyje Lietuvos rajonų. Tai sidabriškai žalios spalvos daugiametis krūminis augalas, užaugantis iki 1–1,5 metrų aukščio. Šakniastiebis trumpas, šakotas, antžeminė augalo dalis apaugusi sidabriniais plaukeliais, kurie augalui suteikia šviesiai pilką spalvą. Stiebas iš dalies sumedėjęs, status, briaunotas, šakotas viršutinėje dalyje. Lapai 2–3 kartus plunksniškai perskirti. Žiedai vamzdiški, smulkūs, geltoni, sukrauti rutuliškuose graižuose [64].
Kartusis kietis žydi liepos – rugpjūčio mėn., veda lukštavaisius. Vaistinė augalinė žaliava – karčiojo kiečio žolė, kuri yra renkama ir ruošiama augalo žydėjimo pradžioje. Nupjaunamos 25–30 cm ilgio augalo stiebų viršūnės. Žaliava džiovinama, paskleidus plonu sluoksniu, gerai vėdinamoje patalpoje 35–40 ºC temperatūroje. Išdžiūvusi žaliava yra 20–25 cm ilgio šakutės su lapais ir žiedais, pilkai žalios spalvos, charakteringo, aromatingo kvapo ir aitraus, stipriai kartaus skonio [86].
1.3.1. Karčiojo kiečio kaupiamos veikliosios medžiagos
Karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje turi būti apie 0,15–0,40 % kartumynų ir 0,20– 1,5 % eterinių aliejų, kurie rodo, kad žaliava yra kokybiška [86]. Pagal Europos farmakopėją, kartumo reikšmė vaistinėje augalinėje žaliavoje turi būti ne mažesnė nei 10.000, eterinių aliejų - ne mažiau nei 0,20 %. Kartumynai, esantys žaliavoje, yra seskviterpenų laktonai, iš kurių pagrindinis – absintinas (0,20-0,28 %) (2 pav. A), guianolido artabsino (2 pav. C) dimeras. Kiti dimeriniai seskviterpenų laktonai yra izoabsintinas, absintolidas, artenlidas [86].
(A) (B) (C)
2 pav. Karčiojo kiečio kaupiamos veikliosios medžiagos. A - absintinas [88], B - β-tujonas [106], C - artabsinas [92].
Karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje taip pat yra ir monomerinių seskviterpenų laktonų tokių kaip artanolidas, deacetilglobicinas, parišinas B ir C bei matricinas. Daugelis iš šių junginių yra nestabilūs ir distiliacijos garais metu virsta mėlynos spalvos junginiu – chamazulenu [86].
Eterinius aliejus, esančius vaistinėje augalinėje žaliavoje, daugiausiai sudaro terpenai. Priklausomai nuo žaliavos kilmės, šie cheminiai junginiai gali sudaryti iki 40 % eterinių aliejų turinio.
Terpenai, esantys karčiojo kiečio eteriniuose aliejuose daugiausiai yra β-tujonas (2 pav. B), trans-sabinilacetatas, cis-epoksiocimenas, chrizantenilacetatas [86].
Karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje nustatyta 50 kitų seskviterpenų ir monoterpenų, iš kurių svarbiausi yra tujanas, tujilo alkoholis, linalolis, cineolis, α-bisabololis, β-kurkuminas ir spatulenolis. Taip pat identifikuoti ir tokie flavonoidai kaip kampferolio ir kvercitino glikozidai bei lipofiliniai flavonai, tokie kaip artemisitinas. Be kavos rūgšties ir kitų fenolinių karboksilinių rūgščių, vaistinėje augalinėje žaliavoje taip pat aptinkama kumarinų ir lignanų [86].
1.3.2. Karčiojo kiečio preparatų poveikis
Atlikta daug tyrimų rodančių karčiojo kiečio poveikį įvairiems sveikatos sutrikimams gydyti. Tirtas karčiojo kiečio ekstrakto (dozė 1,80 g/d. 6 mėn. iš eilės), kurio sudėtyje nebuvo β-tujono, poveikis pacientams, sergantiems IgA nefropatija. Įrodyta, kad karčiojo kiečio preparatų skyrimas pagerino proteinurijos valdymą, t.y. statistiškai patikimai sumažino baltymų/kreatinino santykį šlapime. Taip pat nustatytas reikšmingas arterinio kraujo spaudimo vidurkio sumažėjimas [41].
Įrodytas karčiojo kiečio ekstrakto antibakterinis aktyvumas. Atliktas ikiklinikinis tyrimas su Sprague–Dawley linijos žiurkių patinėliais, kuriems buvo padarytos žaizdos ir į žaizdos vietą buvo sušvirkšta Auksinio stafilokoko (lot. Staphylococcus aureus) bakterijų (1X104
kolonijas formuojančių vienetų). Rezultatai parodė, kad tepant karčiojo kiečio ekstraktą ant žaizdos, jis pasižymėjo statistiškai reikšmingu antimikrobiniu poveikiu [51]. Kitame tyrime iš karšiojo kiečio žolės buvo išskirta ir charakterizuota 4,5-O–dikafeoilkvininė rūgštis (4,5-ODCQA), kuri pasižymėjo plataus spektro antimikrobinėmis savybėmis prieš gramteigiamus mikroorganizmus [20]. Įrodytas ir karčiojo kiečio antimikrobinės savybės prieš Micrococcus flavus, Bacillus subtilis, Penicillium chrysogenum ir Aspergillus fumigatus [34]. Taip pat įrodytas ir karčiojo kiečio ekstrakto antihelmintinis [78] bei antimaliarinis [87] poveikis.
Kelios studijos parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas pasižymi uždegiminių citokinų, tokių kaip tumoro nekrozės faktorius α (TNF-α), gamybą slopinančiu poveikiu tiek in vitro, tiek in vivo ir dėl šių savybių yra tinkami Krono ligos gydymui. Kontroliuojamo klinikinio tyrimo metu pacientams, sergantiems Krono liga prie įprastinio gydymo 6 savaites papildomai buvo skiriama karčiojo kiečio preparatų. Per šį gydymo laikotarpį TNF-α kiekis tiriamosios grupės pacientų kraujo serume statistiškai patikimai sumažėjo 3 kartus, lyginant su kontroline grupe, kur TNF-α kiekis sumažėjo tik 1,2 karto. Taip pat žymiai pagerėjo pacientų žaizdų gijimas ir nuotaika [42].
Taip pat labai svarbus karčiojo kiečio ekstrakto antioksidacinis ir radikalus neutralizuojantis poveikis. Tyrimai parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas pasižymi stipriu laisvuosius radikalus neutralizuojančiu poveikiu, taip pat gebėjimu užkirsti kelią lipidų peroksidacijai ir laisvųjų radikalų grandininėms reakcijoms [9]. In vitro tyrimais įrodyta, kad metanolinis karčiojo kiečio ekstraktas reikšmingai neutralizavo superoksido anijono, vandenilio peroksido, hidroksilo ir azoto oksido radikalus, ir reikšmingai sumažino jų energiją [13, 18]. Šie rezultatai parodė, kad kartusis kietis turi stiprių antioksidacinių savybių, ir gali būti naudojamas kaip apsauginis agentas nuo sutrikimų, susijusių su oksidaciniu stresu. Keliuose tyrimuose parodytas karčiojo kiečio ekstrakto hepatoprotekcinis poveikis esant chemiškai ir imunologiškai indukuotam kepenų funkcijos pažeidimui [6, 25]. Šis karčiojo kiečio apsauginis poveikis buvo siejamas su ekstrakto antioksidaciniu aktyvumu ir imunomoduliacinėmis savybėmis.
Nustatytas karčiojo kiečio protekcinis poveikis esat švino sukeltam toksiškumui. 2008 m. atliktos studijos rezultatai parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas atstatė dėl švino poveikio sutrikdytą fermentų veiklą, ir turėjo apsauginį poveikį nuo lipidų peroksidacijos [37]. Kita studija parodė, kad karčiojo kiečio ekstraktas atkūrė normalų membranos fermentų ir lipidų kiekį kraujyje, turėjo reikšmingą antioksidacinį aktyvumą ir apsaugojo laboratorinių gyvūnų kepenis ir inkstus nuo toksinio švino poveikio [36].
1.3.3. Karčiojo kiečio preparatų vartojimo indikacijos ir nepageidaujamas poveikis
Pagrindinės karčiojo kiečio preparatų indikacijos yra apetito stoka ir virškinamojo trakto sutrikimai, tokie kaip gastritas, esant skrandžio rūgšties trūkumui, taip pat esant lėtiniam gastritui. Preparatai yra skiriami tinktūrų, vaistinių arbatų formomis. Karčiojo kiečio preparatai pasižymi tulžies išskyrimą skatinančiu poveikiu, ir yra skiriami esant virškinamojo trakto ir tulžies pūslės sutrikimams [86]. Kartusis kietis taip pat įeina į alergenų ekstraktų, skirtų specifinei imunoterapijai, sudėtį.Karčiojo kiečio preparatų nepageidaujamas poveikis ir toksiškumas daugiausiai yra siejamas su vienintele toksine šio augalo kaupiama veikliąja medžiaga – terpenu tujonu (2 pav. B). Šis toksiškas junginys iš karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto gali būti pašalintas panaudojant superkritinio aukšto slėgio CO2 ekstrakciją.
Kai tujonas nėra pašalintas iš karčiojo kiečio ekstrakto, gali pasireikšti tokios nepageidaujamos reakcijos kaip vėmimas, virškinamojo trakto spazmai ir diegliai, šlapimo retencija. Esant sunkiam toksiškumui gali sutrikti sąmonė, pasireikšti sumišimas, išsivystyti inkstų pažeidimas [86]. Atlikta tyrimų,
kuriuose tirtas tujono toksiškumas ir kancerogeniškumas. Nustatyta, kad α ir β-tujonas sukelia apyvarpės liaukų vėžį ir antinksčių navikų padidėjimą žiurkių patinams, kuriems buvo skirtas šis cheminis junginys. Šis preparatas taip pat sukėlė traukulius beveik visiems laboratoriniams gyvūnams, kuriems buvo paskirtos didžiausios α ir β-tujono dozės [54]. Plačiai ištirtas tujono neurotoksinis poveikis in vitro ir in vivo [54, 62, 83].
2. TYRIMO METODAI
2.1. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos atranka tyrimui
Siekiant įgyvendinti pagrindinį šio tyrimo tikslą, t.y. įvertinti karčiojo kiečio protekcinį poveikį skirtingiems žiurkės organams, pirmiausia buvo atlikta tinkamiausios Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos atranka. Pagrindinis atrankos kriterijus buvo kuo mažesnis sunkiųjų metalų kiekis vaistinėje augalinėje žaliavoje. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos atrankos metodika apžvelgta 2.1.1. ir 2.1.2 skirsniuose.
2.1.1. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos surinkimas ir paruošimas
2011 m. liepos – rugpjūčio mėn. žydėjimo metu buvo surinkta karčiojo kiečio žolė (stiebas, lapai, žiedai) iš Vilkaviškio, Švenčionių ir Ukmergės rajonų. Taip pat buvo pasirinkta vaistinė augalinė žaliava iš vaistinės, norint palyginti gautus rezultatus su skirtinguose Lietuvos rajonuose surinkta medžiaga.
Žaliava buvo renkama laikantis farmakopėjos reikalavimų. Nupjaunamos 25–30 cm ilgio augalo stiebų viršūnės. Žaliava džiovinama, paskleidus plonu sluoksniu, gerai džiovykloje 35–40 ºC temperatūroje. Išdžiūvusi žaliava – 20–25 cm ilgio šakutės su lapais ir žiedais, pilkai žalios spalvos, charakteringo, aromatingo kvapo ir aitraus, stipriai kartaus skonio [86].
2.1.2. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos mineralizavimas
Prieš analizę sausa augalinė žaliava iš kiekvieno rajono ir vaistinėje pirktos žaliavos susmulkinta ir atsverta po 0,1 g. Iš kiekvienos rajono ir vaistinėje pirktos žaliavos atsverta po 8 bandinius. Bandiniai mineralizuoti naudojant ypač švarių druskos rūgšties (HCl), azoto rūgšties (HNO3) ir vandenilio peroksido (H2O2) reagentų mišinį santykiu 4:8:1.
Atsverti bandiniai patalpinti į kvarcinius indus „XQ80“ („Anton Paar GmbH“, Austrija), ant jų užpilta 5 ml mineralizavimo mišinio. Kvarciniai indai užkimšti tefloniniais kamščiais. Mineralizavimas atliktas naudojant mineralizatorių „Multiwave 3000“ (3 pav.) („Anton Paar GmbH“, Austrija).
Mineralizavimo metu 8 mėginiai po 100 mg veikti 12 barų slėgiu, 150°C temperatūra ir 800 W mikrobangų galia. Mineralizavimo laikas - 1 val. Po mineralizavimo mėginiai perkelti į sterilius plastikinius mėgintuvėlius.
3 pav. Mineralizatorius „Multiwave 3000“ [100]
2.1.3. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos toksikologinė analizė
Karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje buvo nustatomos švino (Pb), kadmio (Cd), vario (Cu) ir cinko (Zn) koncentracijos. Sunkiųjų metalų koncentracijų nustatymas buvo atliekamas „Perkin– Elmer Zeeman 3030“ (4 pav.) elektroterminiu atominiu absorbciniu spektrofotometru („ETG AAS/Zeeman“, Vokietija).
Atominė absorbcinė spektrinė analizė – patogus ir greitai atliekamas metodas, skirtas nustatyti tam tikrų elementų kiekį/koncentraciją įvairios kilmės medžiagose. Kiekybinės analizės metu stebima, ar tam tikro elemento būdingam bangos ilgiui vyksta elektromagnetinės spinduliuotės absorbcija. Atominė absorbcinė spektrinė analizė pagrįsta elektromagnetinės spinduliuotės srauto atrankine absorbcija analizuojamosios medžiagos nesužadintaisiais atomais. Elektromagnetinės spinduliuotės kvanto absorbcijos metu valentinis atomo elektronas sužadinamas ir peršoka iš pagrindinio energijos lygmens į artimiausią leistiną energijos lygmenį. Atominė absorbcinė spektroskopija yra tinkamiausia elementams, kurių rezonansinės linijos yra tarp 200 ir 330 nm [1].
Atominės absorbcinės spektrinės analizės rezultatai, gauti anksčiau minėta įranga, yra perskaičiuojami ir išreiškiami koncentracija µg/g. Koncentracija apskaičiuojama pagal šią formulę:
m
V
D
A
C
C - koncentracija (µg/g) A - optinis tankis/absorbcija D - tirpalo praskiedimas (kartais) V - mineralizato tūris (ml) m - mėginio masė (g)Sunkusis metalas kadmis nustatomas esant 228,8 nm šviesos bangos ilgiui, taikant temperatūrinį rėžimą, kaip nurodyta 3 lentelėje.
3 lentelė. Temperatūrinis režimas, naudojamas kadmio nustatymui
Etapo Eil. Nr. Temperatūra (°C) Laikas (s) Pakėlimas Išlaikymas 1 100 1 20 2 120 20 3 3 300 3 10 4 900 2 10 5 1600 0 4 6 2600 2 4 7 20 1 1
Sunkusis metalas švinas nustatomas esant 283,3 nm šviesos bangos ilgiui, taikant temperatūrinį rėžimą, kaip nurodyta 4lentelėje.
4 lentelė. Temperatūrinis režimas, naudojamas švino nustatymui
Etapo Eil. Nr. Temperatūra (°C) Laikas (s) Pakėlimas Išlaikymas 1 100 3 30 2 130 25 5 3 600 5 3 4 1900 1 7 5 2600 1 5 6 20 1 1 7 2600 2 5 8 20 1 1
Sunkusis metalas varis nustatomas esant 324,8 nm šviesos bangos ilgiui, taikant temperatūrinį rėžimą, kaip nurodyta 5 lentelėje.
5 lentelė. Temperatūrinis režimas, naudojamas vario nustatymui
Etapo Eil. Nr. Temperatūra (°C) Laikas (s) Pakėlimas Išlaikymas 1 90 5 20 2 100 10 10 3 200 3 2 4 1000 3 10 5 2500 0 4 6 2650 1 7 7 20 1 1 8 2650 1 3 9 20 1
--Sunkusis metalas cinkas nustatomas esant 213,9 nm šviesos bangos ilgiui, taikant temperatūrinį rėžimą, kaip nurodyta 6 lentelėje.
6 lentelė. Temperatūrinis režimas, naudojamas cinko nustatymui Etapo Eil. Nr. Temperatūra (°C) Laikas (s) Pakėlimas Išlaikymas 1 90 5 10 2 100 5 10 3 120 3 2 4 1800 3 10 5 1800 0 3 6 2650 1 7 7 20 1 1 8 2650 1 3 9 20 1
--2.3. Eksperimentinis modelis
Siekiant įvertinti karčiojo kiečio protekcinį poveikį kepenims, inkstams, širdžiai ir smegenims, pasirinktas eksperimentinis modelis su laboratoriniais gyvūnais. Jį sudarė šios pagrindinės dalys:
Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto paruošimas
Kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas, eksperimento atlikimas
Fiziologinių rodiklių vertinimas
Laboratorinių gyvūnų eutanazavimas ir organų mėginių paėmimas
2.2. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto paruošimas
Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto paruošimui naudota augalinė žaliava, kurioje po toksikologinės analizės nustatyta mažiausia kadmio koncentracija (kaip aprašyta skyriuje Rezultatai, skirsnyje 3.1.). Karčiojo kiečio ekstraktas buvo ruošiamas kaip aprašyta N. Amat ir kitų mokslininkų metodikoje [6]. 100 g Karčiojo kiečio augalinės žaliavos buvo susmulkinta, sudėta į stiklinį indą, užpilta 1 l distiliuoto vandens ir maceruota 12 val. kambario temperatūroje. Po to maceratas virtas 1 val. ir nufiltruotas į sterilų tamsaus stiklo butelį ir laikytas 4ºC temperatūroje šaldytuve.
2.3.1. Laboratoriniai gyvūnai ir jų laikymo sąlygos
Tyrimas su laboratoriniais gyvūnais atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto (LSMU) Veterinarijos akademijos vivariume. Tyrimui atlikti pasirinkti subrendę Wistar linijos žiurkių patinai. Eksperimentai su laboratoriniais gyvūnais atlikti vadovaujantis laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos reikalavimais, laikantis „Gyvūnų, skirtų eksperimentams ir kitiems mokslo tikslams, laikymo, priežiūros ir naudojimo reikalavimų“, patvirtintų 2008 12 18 Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos direktoriaus įsakymu Nr. B1–639 (Žin., 2009, Nr. 287). Leidimas Nr. 0217 eksperimentiniams tyrimams atlikti gautas iš Lietuvos laboratorinių gyvūnų naudojimo etikos komisijos prie Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos.
Laboratoriniai gyvūnai viso eksperimento metu buvo laikomi specialiuose individualiuose narvuose (5 pav.) (Techniplast, Italija) esant pastoviai patalpos temperatūrai (21.0±2.5°C) ir pastoviai santykinei oro drėgmei (50–55 proc.).
Paros apšvietimo ciklas (šviesa/tamsa) buvo keičiamas kas 12 val. Šviesa buvo įjungiama kiekvieną rytą 8 val. Gyvūnų adaptacijos periodas narvuose prieš eksperimentą truko dvi paras.
Žiurkės buvo šeriamos įprastu, graužikams skirtu granuliuotu pašaru ad libitum. Graužikų pašaro sudėtis: ląsteliena – ne daugiau 4,5 proc., 45,0 g/kg, ~0,18 g/granul.; kalcis – 0,85–1,2 proc., 8,5–12,0 g/kg, ~0,034–0,048 g/granul.; fosforas – 0,85–1,2 proc., 8,5–12,0 g/kg, ~0,034–0,048 g/granul.; natrio chloridas – 0,45–0,7 proc., 4,5–7,0 g/kg, ~0,018–0,028 g/granul.; natris – ne daugiau 0,2 proc., 2,0 g/kg, 0,008 g/granul.; kalis – 0,45–0,8 proc., 4,5–8,0 g/kg, ~0,018–0,032 g/granul.; magnis – 0,12–0,2 proc., 1,2–2,0 g/kg, ~0,0048–0,008 g/granul.
2.3.2. Kontrolinės ir tiriamųjų grupių sudarymas
Tirti Wistar linijos žiurkių patinai, kurių amžius eksperimento pradžioje buvo 12–16 sav., svorio vidurkis 249,78 g (SN=19,64, mediana 252,0, ribos 215,0–273,0). Eksperimentai atlikti su 18 laboratorinių gyvūnų (po 6 kiekvienoje grupėje). Laboratoriniai gyvūnai buvo suskirstyti į tris grupes (kontrolinė, Cd arba Cd+KKVE):
Kontrolinė grupė – geriamojo vandens grupė;
Cd grupė – kadmio grupė;
Cd+KKVE grupė – Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto grupė.
Kontrolinės grupės žiurkės 30 dienų iš eilės gavo geriamojo vandens ad libitum. Cd grupės žiurkės 30 dienų iš eilės gavo kadmio chlorido vandeninio tirpalo, kurio koncentracija 2 mg/l, ad libitum. Cd+KKVE grupės žiurkės 30 dienų iš eilės gavo kadmio chlorido vandeninio tirpalo, kurio koncentracija 2 mg/l, ad libitum ir joms papildomai buvo skiriama Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto 200 mg/kg/d per os. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas buvo girdomas kiekvienam Cd+KKVE grupės gyvūnui individualiai, švirkštu į burną suleidžiant tikslią ekstrakto dozę.
2.3.3. Pasirengimas eksperimentui
Prieš eksperimentą narvai buvo sužymėti, užrašomas žiurkės identifikacijos numeris, grupė, į kurią priskirtas gyvūnas (kontrolinė, Cd arba Cd+KKVE). Kiekvienos žiurkės kasdieniniam rutininiam stebėjimui buvo sukurtas specialus protokolas.
Pirmąją eksperimento dieną kiekvieno laboratorinio gyvūno protokole buvo žymimas gyvūno identifikacijos numeris, lytis, amžius (sav.), svoris (g), grupė, į kurią priskirtas gyvūnas (kontrolinė, Cd arba Cd+KKVE), eksperimento pradžios data. Nustatytuose eksperimento taškuose buvo stebimas ir protokoluose fiksuojamas žiurkių suvartoto vandens (ml/24val.) kiekis, svoris (g), kitos, kiekvienam gyvūnui individualios pastabos, kurios buvo reikšmingos eksperimentui.
2.3.4. Fiziologiniai rodikliai
Vertinti laboratorinių gyvūnų svorio pokyčiai ir suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekiai.
Svoris. Žiurkės buvo sveriamos laboratorinėmis elektroninėmis analitinėmis svarstyklėmis Kern
PLJ 3500–2NM (KERN & SOHN GmbH, Vokietija) prieš eksperimentą, vėliau po 15 ir 30 dienų. Tikslus gyvūno svoris prieš eksperimentą buvo reikalingas tiksliai Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto dozei apskaičiuoti (jei jis girdomas), taip pat svorio pokyčiams stebėti tolimesniuose eksperimento etapuose. Vertinti žiurkių svorio pokyčiai kiekviename eksperimento etape.
Vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekis. Žiurkių suvartoto vandens ar kadmio
chlorido vandeninio tirpalo kiekis vertintas kiekvieną eksperimento dieną 30 dienų iš eilės. Matuotas suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandenio tirpalo kiekis (ml/24val.). Suvartotas vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekis visada buvo vertinamas tuo pačiu metu, 8 val. ryte, pamatuojant tirpalų tūrį matuojamuoju cilindru.
2.3.5. Laboratorinių gyvūnų eutanazavimas ir organų mėginių paėmimas
Laboratoriniams gyvūnams eutanazija atlikta 31 eksperimento dieną, praėjus parai po paskutinės Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto dozės skyrimo Cd+KKVE grupės gyvūnams. Prieš kepenų, inkstų, širdies ir smegenų mėginių paėmimą, laboratoriniams gyvūnams atlikta eutanazija ketamino hidrochlorido 10 proc. injekciniu tirpalu (dozė – 80 mg/kg, i.p.) ir ksilazino 20 mg/1ml injekciniu tirpalu (dozė – 5 mg/kg, i.p.). Po eutanazijos žiurkėms atlikta laparotomija. Organų mėginiai buvo paimti į vienkartinius sterilius mėgintuvėlius, ir užšaldyti -80°C laipsnių temperatūrojeir laikomi iki jų toksikologinės analizės.
2.3.6. Organų mėginių paruošimas analizei
Prieš analizę organų mėginiai buvo atšildyti kambario temperatūroje, susmulkinti ir atsverti po 0,4–0,5 g į aštuonis bandinius iš kiekvieno organo. Mėginiai mineralizuoti naudojant druskos rūgšties (HCl), azoto rūgšties (HNO3) ir vandenilio peroksido (H2O2) reagentų mišinį santykiu 1,67:15:1. Atsverti bandiniai talpinami į kvarcinius indus, o ant jų pilama 5,3 ml mineralizavimo mišinio. Kvarciniai indai užkemšami tefloniniais kamščiais. Mineralizavimas atliktas naudojant mineralizatorių „Multiwave 3000“ („Anton Paar GmbH, Austrija). Mineralizavimo metu 8 mėginiai veikiami 11 barų slėgiu, 120°C temperatūra ir 750 W mikrobangų galia. Mineralizavimo laikas 1 val. Kadmio koncentracijos nustatymas organų mėginiuose atliktas kaip aprašyta skirsnyje 2.1.3. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos toksikologinė analizė.
2.4. Statistinė duomenų analizė
Aprašomoji ir lyginamoji statistinė duomenų analizė atlikta statistiniu paketu SPSS Statistics 17.0. Vertinant sunkiųjų metalų koncentracijas, žiurkių svorį, suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekį apskaičiuotas kiekvieno parametro vidurkis, standartinis nuokrypis (SN). Apskaičiuotos iš anksto parinktų kintamųjų dažnių ir kryžminės lentelės, atliktas χ2 testas su priklausomu kintamuoju – Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto doze (0 mg/kg/d; 200 mg/kg/d). Eksperimento in vivo rezultatams įvertinti taikyta vienfaktorinė dispersinė analizė (One-way ANOVA). Taikytas Bonferroni Post Hoc kriterijus. Rezultatai laikyti statistiškai patikimais, kai patikimumo koeficientas p<0,050.
3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS
3.1. Karčiojo kiečio vaistinės augalinės žaliavos atranka
Nustatytos kadmio, švino, vario ir cinko koncentracijos (µg/g) karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje, surinktoje Ukmergės, Švenčionių ir Vilkaviškio rajonuose bei karčiojo kiečio maisto papilde, įsigytame vaistinėje. Sunkiųjų metalų koncentracijos pateiktos 7 lentelėje.
7 lentelė. Kadmio, švino, vario ir cinko koncentracijų vidurkiai (µg/g) ± SN karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje iš skirtingų Lietuvos rajonų ir maisto papildo įsigyto vaistinėje
Sunkusis metalas
Ukmergės rajonas Švenčionių rajonas Vilkaviškio rajonas
Maisto papildas įsigytas vaistinėje Kadmis 0,249±0,085 0,215±0,100 0,224±0,015 1,156±0,145 Švinas 0,076±0,051 0,046±0,028 1,640±0.878 1,054±0,537 Varis 11,100±2,225 13,920±4,400 13,718±6,258 6,853±0,621 Cinkas 65,889±8,712 47,420±7,084 55,64±26,985 34,489±7,469
Ištyrus vaistines augalines žaliavas, didžiausia kadmio koncentracija nustatyta vaistinėje įsigytame karčiojo kiečio maisto papilde (1,156±0,145 µg/g). Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas, lyginant kadmio koncentracijų vidurkius tarp maisto papildo vaistinės augalinės žaliavos ir žaliavų, surinktų Ukmergės (p<0,001), Švenčionių (p<0,001) ir Vilkaviškio (p<0,001) rajonuose. Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių rajonų, lyginant juos tarpusavyje, nenustatyta (p>0,050), todėl tolimesniems tyrimams buvo pasirinkta vaistinė augalinė žaliava, kurioje kadmio koncentracijos vidurkis buvo mažiausias, t.y. Švenčionių rajone surinkta vaistinė augalinė žaliava, kurioje kadmio koncentracijos vidurkis buvo 0,215±0,100 µg/g. Kadmio koncentracijų vidurkių karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje iš skirtingų Lietuvos rajonų ir maisto papildo, įsigyto vaistinėje, palyginimas pateiktas 6 paveiksle.
Švino koncentracijų vidurkiai buvo statistiškai reikšmingai didesni Vilkaviškio rajone surinktoje (p>0,050) ir vaistinėje įsigytoje augalinėje žaliavoje (p>0,050), lyginant su Ukmergės ir Švenčionių rajonais. Priešingai, nustatyti statistiškai reikšmingai mažesni cinko ir vario koncentracijų
vidurkiai vaistinėje įsigytoje augalinėje žaliavoje (p>0,050), lyginant su koncentracijų vidurkiais, nustatytais Ukmergės, Švenčionių ir Vilkaviškio rajonuose surinktoje vaistinėje augalinėje žaliavoje. Toks metalų koncentracijų pasiskirstymas galimai atsiranda dėl jų tarpusavio sąveikos. Kadmis ir švinas gali patochemiškai sąveikauti su cinku ir variu (t.y. jų junginiais) ir sutrikdyti šių sunkiųjų metalų dalyvavimą augalo biocheminiuose procesuose.
6 pav. Kadmio koncentracijų vidurkių (µg/g±SN) karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje iš skirtingų Lietuvos rajonų ir maisto papildo įsigyto vaistinėje palyginimas
Lyginant su kitais vaistiniais augalais, kartusis kietis nepasižymi didesniu sunkiųjų metalų sukaupiamu kiekiu. 2003 metais V. Žitkevičiaus ir kitų mokslininkų atlikto tyrimo duomenimis gudobelių vaisiuose (lot. Crataegi fructus), sukatžolių žolėje (lot. Leonuri herba) ir ežiuolių žolėje (lot. Echinaceae herba), kadmio koncentracija buvo atitinkamai 0,41±0,11, 0,32±0,12 ir 0,24±0,11 µg/g±SN [3]. Mūsų tyrimų duomenimis, kadmio koncentracija karčiojo kiečio vaistinėje augalinėje žaliavoje buvo visais atvejais mažesnė, lyginant su anksčiau minėtais trimis vaistiniais augalais, išskyrus karčiojo kiečio maisto papildą, įsigytą vaistinėje.
3.2. Fiziologinių rodiklių vertinimas
Per pirmąsias 15 eksperimento dienų visų grupių gyvūnų svoris didėjo. Kontrolinės grupės žiurkių svoris vidutiniškai padidėjo 3,50±4,23 g (1,42 proc.), Cd grupės - 10,83±5,15 (4,20 proc.), Cd+KKVE grupės - 2,33±7,81 (0,95 proc.). Nuo 15 iki 30 eksperimento dienos kontrolinės grupės gyvūnų svoris toliau didėjo, vidutiniškai 5,00±0,89 g (2,00 proc.). Cd ir Cd+KKVE grupių gyvūnų svoris iki eksperimento pabaigos ėmė mažėti vidutiniškai 5,67±10,52 g (2,11 proc.) ir 6,33±13,00 g (2,56 proc.) atitinkamai.
7 pav. Svorio vidurkio kitimas (g)
Žiurkių svorio kitimas viso eksperimento metu pavaizduotas 7 paveiksle. Nors nuo 15 iki 30 eksperimento dienos Cd ir Cd+KKVE grupių gyvūnų svoris mažėjo, tačiau nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų lyginant laboratorinių gyvūnų svorio pokyčius su kontrolinės grupės žiurkių svoriu (p>0,050).
Lyginant laboratorinių gyvūnų suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekį (ml/24val.) tarp visų trijų grupių statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (p>0,050). Kontrolinės grupės žiurkės per parą vidutiniškai suvartojo 19,51±2,10 ml vandens, Cd grupės - 21,84±3,58 ml ir Cd+KKVE grupės - 21,60±2,52 ml kadmio chlorido vandeninio tirpalo. Žiurkių vidutinio suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo kiekio kitimas (ml/24val.) per 30 eksperimento dienų pavaizduotas 8 paveiksle.
8 pav. Suvartoto vandens ar kadmio chlorido vandeninio tirpalo vidutinio kiekio kitimas (ml/24val.)
3.3. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi kepenyse
Po 30 eksperimento dienų kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių kepenyse buvo 0,012±0,006 µg/g, Cd grupės - 0,671±0,150 µg/g, Cd+KKVE grupės - 0,436±0,096 µg/g. Cd grupėje kadmio koncentracija kepenyse buvo vidutiniškai 55,92 karto didesnė nei kontrolinėje grupėje. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių kepenyse vidutiniškai 1,54 karto lyginant su Cd grupe, tačiau nepasiekė kontrolinės grupės kadmio koncentracijos ribų ir buvo vidutiniškai 36,33 karto didesnė.
Kadmio koncentracija laboratorinių gyvūnų kepenyse statistiškai patikimai skyrėsi tarp grupių. Nustatytas statistiškai reikšmingas skirtumas lyginant kontrolinę ir Cd grupes (p<0,001) bei Cd ir
Cd+KKVE grupes (p=0,005). Tai rodo, kad karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas turėjo teigiamą poveikį laboratorinių gyvūnų kepenims. Kadmio koncentracija kepenyse reikšmingai sumažėjo, dėl to galima teigti, kad karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas pasižymėjo hepatoprotekciniu poveikiu, kuris pasireiškė padidinta šio sunkiojo metalo ekskrecija iš organizmo. Kadmio koncentracijos vidurkių žiurkių kepenyse skirtumai pavaizduoti 9 paveiksle.
9 pav. Kadmio koncentracijos vidurkių (µg/g±SN) skirtumai žiurkių kepenyse
N. Amat ir kitų mokslininkų 2010 metais atliktas tyrimo rezultatai yra palyginami su mūsų gautais rezultatais. Tyrimas parodė, kad karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas statistiškai reikšmingai ir priklausomai nuo dozės (50, 100 ir 200 mg/kg/d) apsaugojo peles nuo chemiškai ar imunologiškai sukelto kepenų fermentų padidėjimo kraujo serume. Be to, karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas žymiai sumažino kepenų audinio lipidų peroksidaciją ir atkūrė antioksidantinių fermentų superoksiddismutazės ir gliutationperoksidazės veiklą. Kepenų histologiniai tyrimai atskleidė, kad karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kepenų ląstelių nekrozę ir uždegiminių ląstelių infiltraciją [6]. Analogišku hepatoprotekciniu poveikiu pasižymėjo kininio ženšenio bei plokščiosios vingrūnės ekstraktai [35, 60, 75], valgomojo svogūno [57, 77], valgomojo česnako [57, 58, 77], kvapiojo mairūno ekstraktai [73]. Tai
rodo, kad karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto hepatoprotekcinis poveikis pasireiškia ne tik dėl padidėjusios kadmio ekskrecijos iš organizmo, bet ir dėl jo antioksidacinių bei imunomoduliacinių savybių.
3.4. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi inkstuose
Eksperimento pabaigoje kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių inkstuose buvo 0,055±0,013 µg/g, Cd grupės - 1,515±0,592 µg/g, Cd+KKVE grupės - 1,064±0,278 µg/g. Kadmio koncentracijos vidurkių žiurkių inkstuose skirtumai pavaizduoti 10 paveiksle.
10 pav. Kadmio koncentracijos vidurkių (µg/g±SN) skirtumai žiurkių inkstuose
Cd grupėje kadmio koncentracija inkstuose buvo vidutiniškai 27,55 karto didesnė lyginant su kontroline grupe. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių inkstuose
vidutiniškai 1,42 karto lyginant su Cd grupe, tačiau nepasiekė kontrolinės grupės kadmio koncentracijos ribų ir buvo vidutiniškai 19,35 karto didesnė.
Kadmio koncentracija laboratorinių gyvūnų inkstuose statistiškai patikimai skyrėsi tarp kontrolinės ir Cd grupių (p<0,001). Nors kadmio koncentracija tarp Cd ir Cd+KKVE grupių skyrėsi beveik du kartus, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių grupių nenustatyta (p=0,168).
Tikėtina, kad reikšmingas skirtumas negautas tik dėl to, jog karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas padidino bendrą kadmio ekskreciją iš organizmo. Kadangi kadmis daugiausiai yra ekskretuojamas su šlapimu, dėl to šio proceso metu jo koncentracija inkstuose didėjo ir šis sunkusis metalas galėjo mažiau pasišalinti iš inkstų, lyginant su kitais organais. Dėl to tikslinga atlikti tolimesnius didesnės apimties tyrimus, siekiant įvertinti karčiojo kiečio nefroprotekcinį poveikį. Lyginant su kitais vaistiniais augalais ir kitų mokslininkų atliktais tyrimais, apsauginį poveikį laboratorinių gyvūnų inkstams turėjo valgomojo svogūno [57, 77], valgomojo česnako [57, 58, 77] bei kvapiojo mairūno ekstraktai [73].
3.5. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi smegenyse
Kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės žiurkių smegenyse eksperimento pabaigoje buvo 0,016±0,004 µg/g, Cd grupės - 0,008±0,002 µg/g, Cd+KKVE grupės - 0,006±0,003 µg/g. Kadmio koncentracijos vidurkių žiurkių smegenyse skirtumai pavaizduoti 11 paveiksle.Nenustatyta statistiškai patikimo ryšio tarp kadmio koncentracijos laboratorinių gyvūnų smegenyse lyginant visas tris grupes (p>0,050). Nors kontrolinės grupės gyvūnų smegenyse nustatyta netgi didesnė kadmio koncentracija, nei Cd ir Cd+KKVE grupių, tačiau tai lėmė pakankamai didelis koncentracijų išsibarstymas kontrolinėje grupėje (vidurkis - 0,016 µg/g; SN=0,004) ir kaip minėta anksčiau, skirtumų tarp visų grupių koncentracijų vidurkių nėra. Taip pat šie rezultatai gali būti paremti ir tuo, jog smegenys nėra pagrindinė kadmio kaupimosi vieta organizme ir didžioji kadmio, patekusio į organizmą, dalis (50–60 proc.) pasiskirsto inkstuose ir kepenyse.
11 pav. Kadmio koncentracijos vidurkių (µg/g±SN) skirtumai žiurkių smegenyse
3.6. Karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikis kadmio kaupimuisi širdyje
Po 30 eksperimento dienų kadmio koncentracijos vidurkis kontrolinės grupės laboratorinių gyvūnų širdyje buvo 0,019±0,003 µg/g, Cd grupėje - 0,033±0,009 µg/g, Cd+KKVE grupėje - 0,025±0,007 µg/g. Kadmio koncentracijos vidurkių žiurkių širdyje skirtumai pavaizduoti 12 paveiksle.
Cd grupėje kadmio koncentracija širdyje buvo vidutiniškai 1,74 karto didesnė nei kontrolinėje grupėje. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių širdyje vidutiniškai 1,32 karto lyginant Cd+KKVE grupę su Cd grupe.
12 pav. Kadmio koncentracijos vidurkių (µg/g±SN) skirtumai žiurkių širdyje
Nors ir gauti kadmio koncentracijų skirtumai laboratorinių gyvūnų širdyje, tačiau nerasta statistiškai patikimo ryšio lyginant visas tris grupes tarpusavyje (p>0,50). Tai galėjo nulemti didelis koncentracijų išsibarstymas ir pakankamai mažas kadmio kaupimasis šiame organe lyginant su kepenimis ir inkstais.
4. IŠVADOS
1. Tyrimams in vivo atlikti atrinkta Švenčionių rajone surinkta karčiojo kiečio vaistinė augalinė žaliava, kurioje nustatytas mažiausias kadmio koncentracijos vidurkis (0,215±0,100 µg/g) lyginant su žaliavomis surinktomis Vilkaviškio ir Ukmergės rajonuose bei su vaistine augaline žaliava, įsigyta vaistinėje.
2. Karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas statistiškai reikšmingai (p=0,005) sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių kepenyse, t.y. pasižymėjo hepatoprotekciniu poveikiu, kuris pasireiškė padidinta šio sunkiojo metalo ekskrecija iš organizmo.
3. Nors karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas sumažino kadmio kaupimąsi žiurkių inkstuose beveik du kartus lyginant su kadmio grupe, statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių grupių nenustatyta (p>0,050).
4. Vertinant kadmio kaupimąsi žiurkių smegenyse ir širdyje, nenustatyta statistiškai reikšmingų skirtumų, lyginant kontrolinę, kadmio ir karčiojo kiečio grupes.
5. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
1. Mūsų tyrimo rezultatai atskleidė protekcinį karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto poveikį kepenims, apsaugant nuo sunkiųjų metalų. Remiantis atliktais tyrimais ir analogiškais kitų mokslininkų duomenimis, rekomenduojame toliau vystyti šio vaistinio augalo tyrimus.
2. Siekiant nustatyti, kurie aktyvieji karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto junginiai pasižymėjo teigiamu poveikiu laboratorinių gyvūnų kepenims, būtų tikslinga atlikti kokybinę ir kiekybinę šio ekstrakto analizę bei pakartoti eksperimentus, naudojant išskirtus aktyvius junginius ar jų mišinius.
3. Vystant karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto tyrimus in vivo rekomenduojame įtraukti ir kepenų fermentų kiekio matavimus, kadangi daugelis kitų tyrėjų nurodė, jog šio vaistinio augalo vandeninis ekstraktas pasižymi antioksidaciniu ir imunomoduliaciniu poveikiu bei daro teigiamą poveikį kepenų fermentų kiekio pokyčiams, esant chemiškai ar imunologiškai indukuotam kepenų pažeidimui.
5. Nors kadmio koncentracija inkstuose tarp kadmio ir kadmio – karčiojo kiečio vandeninio ekstrakto grupių skyrėsi beveik du kartus, tačiau statistiškai reikšmingų skirtumų tarp šių grupių nenustatyta. Tikėtina, kad reikšmingas skirtumas negautas tik dėl to, jog karčiojo kiečio vandeninis ekstraktas padidino bendrą kadmio ekskreciją iš organizmo. Kadangi kadmis daugiausiai yra ekskretuojamas su šlapimu, dėl to šio proceso metu jo koncentracija inkstuose didėjo ir šis sunkusis metalas galėjo mažiau pasišalinti iš inkstų, lyginant su kitais organais. Dėl to, rekomenduojame atlikti tolimesnius didesnės apimties tyrimus, siekiant įvertinti karčiojo kiečio nefroprotekcinį poveikį.
6. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Mickevičius D. Cheminės analizės metodai. Vilnius, 1998.2. Strumylaite L, Bogusevicius A, Abdrachmanovas O, Baranauskiene D, Kregzdyte R, Pranys D, Poskiene L. Cadmium concentration in biological media of breast cancer patients. Breast Cancer Res Treat 2011; 125(2):511-7.
3. Žitkevičius V, Savickienė N, Abdrachmanovas O, Ryselis S, Masteikova R, Chalupova Z, Dagilytė A, Baranauskas A. Estimation of maximum acceptable concentration of lead and cadmium in plants and their medicinal preparations. Medicina 2003; 39(2):117-21.
4. Advanced Medical Education and Services Physician Associatio (AMESPA). Introduction To Clinical Metal Toxicology. Advanced Medical Education and Services Physician Association; San Antonio, Tex, USA, 2007.
5. Al-Motabagani MAH. Effect of cadmium on the morphology of adrenal gland in mice. J Anat Soc India. 2002; 51(2):212-6.
6. Amat N, Upur H, Blazeković B. In vivo hepatoprotective activity of the aqueous extract of Artemisia absinthium L. against chemically and immunologically induced liver injuries in mice. J Ethnopharmacol 2010; 131(2):478-84.
7. American College for Advancement in Medicine (ACAM). Chelation Module. American College for Advancement in Medicine; Irvine, Calif, USA, 2010.
8. Argonne National Laboratories. Cadmium, Human Health Fact Sheet. Argonne National Laboratories; Lemont, Ill, USA, 2001.
9. Asghar MN, Khan IU, Bano N. In vitro antioxidant and radical-scavenging capacities of Citrullus colocynthes (L) and Artemisia absinthium extracts using promethazine hydrochloride radical cation and contemporary assays. Food Sci Technol Int. 2011; 17(5):481-94.
10. Bernhoft RA. Cadmium toxicity and treatment.J Scientific World 2013; 2013:394652.
11. Bernhoft RA. Mercury toxicity and treatment: a review of the literature. Journal of Environmental and Public Health. 2012; 2012:10:460-508.
12. Blanuša M, Varnai VM, Piasek M, Kostial K. Chelators as antidotes of metal toxicity: therapeutic and experimental aspects. Current Medicinal Chemistry 2005; 12(23):2771-94. 13. Bora KS, Sharma A. Evaluation of antioxidant and free-radical scavenging potential of
