DIAGNOSI DELLE INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE

Slide Presentation by O E. Varnier!

Oliviero E. Varnier

USD di Microbiologia – IRCCS Hsan Martino

…. più di 100 virus sono noti per causare encefaliti acute nell’uomo ....

DIAGNOSI DELLE

INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE

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INFETTIVOLOGO MICROBIOLOGO

NEUROLOGO

PAZIENTE

INDICE

! Encefaliti virali

! Meningiti batteriche

! Riattivazione di virus latenti

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1. A. Giovanni 70 anni

! Diagnosi clinica: encefalite

! Liquor: 2 linfociti, proteine elevate, danno di barriera, bande oligoclonali addizionali in liquor e siero

! Virologia: 125.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor

! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa

2. L. Paola 42 anni

! Ricovero: sospetta encefalite

! Liquor: 160 GB (80% linfo) proteine, glucosio normali danno di barriera, bande oligoclonali in liquor e siero

! Virologica: 33.000 copie di HSV-1 DNA/ml nel liquor

! Terapia: aciclovir iv, risoluzione clinica

! Riflessioni: l’esame liquorale standard quantifica la gravità dell’encefalite. La PCR identifica l’eziologia e indirizza la terapia

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3. M. Ileana 27 anni

! Ricovero: Sospetta meningite

! Liquor: 20 GB (100% linfo), citochimico, immunochimico nella norma, bande assenti in liquor e siero

! Virologica: 175 copie di VZV DNA/ml nel liquor

! Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa

! Riflessioni: l’esame liquorale standard identifica un lieve

danno iniziale; la PCR identifica una lieve infezione virale

e indirizza al trattamento specifico con risoluzione

completa

4. C. Emanuela 19 anni

! Cefalea ingravescente accompagnata da nausea, vomito e rigidità nucale.

! Pronto soccorso: EEG e TAC negative

! Liquor: 230 linfociti, danno di barriera, assenza di bande oligoclonali su liquor e siero all’immunoblot

! Virologia: anticorpi antivirus assenti

4,800 copie di VZV DNA/ml nel liquor

! Terapia con aciclovir iv e valaciclovir per os

! Rapida guarigione senza sofferanza assonale del facciale e conseguente deficit funzionale.

! Diagnosi: meningite in sindrome di Ramsay Hunt pauci- sintomatica con riattivazione di VZV

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5. M. Francesca 23 anni

! A 5 anni, sindrome linfoistocitica post infezione da EBV

! A 17 anni, sindrome cerebellare subacuta con probabile riattivazione di EBV

! Terapia: Rituximab

! Nel gennaio 2005 ospedalizzata: quadro clinico invariato.

! Liquor: 3 linfociti, es citochimico, immunochimico normali, bande oligoclonali assenti in liquor e siero.

! Virologia: 700 copie di EBV DNA/ml nel liquor

! Diagnosi: ematofagocitosi maligna con infezione cronica da EBV e cerebellite subacuta ricorrente

! Trapianto di Midollo

ID Data Diagnosi Clinica HSV 1 HSV 2 VZV CMV EBV HHV6

4238 14-01-05 Sindrome Cerebrale NEG NEG NEG NEG NEG NEG

4248 31-01-05 Sindrome Cerebrale NEG NEG NEG NEG 700 NEG

6. S. Gabriele 54 anni

! Ricovero: lievo sindrome psicorganica, turbe espressione verbale, cefalea

! TAC encefalo e doppler TSA nella norma; EEG: alterazioni discrete temporale sx

! Liquor: completamente negativo

! Virologia: 538.000 copie BKV DNA/ml nel liquor

! Terapia: nessuna

! Risoluzione completa del quadro clinico e normalizzazione dell’EEG in circa 72 ore

! Diagnosi: ?

! Riflessioni: interdisciplinarietà

! Possibile errore diagnostico da contaminazione del campione

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7. donna 69 anni

! Ricovero: stato confusionale e febbre elevata

! Liquor: 100 cellule (90% linfociti), glucosio e proteine non alterate

v  Virologica: 80,000 HSV1 DNA copie per ml

v Terapia: aciclovir iv, risoluzione completa

… include amplificazione (PCR), ibridizzazione e il rilevamento del segnale in una singola fase …… in Real Time

RealTime PCR: LightCycler

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Sequenza DNA bersaglio

cDNA

LightCycler Real Time PCR: Piattaforma

cDNA

Biotina Primer

Biotina

cDNA ^Biotina

Primer Biotina

rTth DNA Polimerasi

NEO AMPLICONE

min 02:48 9 Cicli in min 08:38

LightCycler Real Time PCR: Rapidità

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LightCycler Real Time PCR:

Accuratezza, Intervallo di Calcolo, Linearità

AMPLICON

AMPLICON

tipo 1

tipo 2

tipo 1 tipo 2

tipo 2 tipo 1

LightCycler Real Time PCR:

Analisi delle Curve di Melting

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LightCycler Real Time PCR: Virus

CMV

BKV

VZV

Virus ID Primers & Probes Tm

HSV1/2 ^{HSV pol f} TCgAgTgCgAAAAAACgTTC 57,4 °C

  ^{HSV pol a} CggTTgATAAACgCgCAgT 58,9 °C

  ^{HSV-2 3FL} gCgCACCAgATCCACgCCCTTgATgAgC X 76,2 °C

  ^{HSV-2 5LC} CTTgCCCCCgCAgATgACgCC p 71,6 °C

VZV 29F TgTCCTAgAggAggTTTTATCTg 52,8 °C

  29R CATCgTCTgTAAAgACTTAACCAg 53,8 °C

  29FLU gggAAATCgAgAAACCACCCTATCggAC X 68,1 °C

  29LCR LC-AAgTTCgCggTATAATTgTCAgTggCg p 65,2 °C

CMV ^{gB For} ATAggAggCgCCACgTATTC

57,6 °C

  ^{gB Rev} TACCCCTATCgCgTgTgTTC

57,1 °C   ^{gB 3FL} CgTTTCgTCgTAgCTACgCRTACAT X

62,0 °C   ^{gB 5LC} LC-ACACCACTTATCTYCTgggCAgC p

59,4 °C EBV ^EB-30 gAgggTggTTTggAAAgC

54,9 °C

  ^EB-40 AACAgACAATggACTCCCTTAg

54,0 °C   ^{EBNA 3FL} AgTCgTCTCCCCCTTTggAATggC X

64,9 °C   ^{EBNA 5LC} LC-CTggACCCggCCCACAACTg ph

69,9 °C

HHV-6 101K-01 ACCCgAgAgATgATTTTgCg 52,8 °C

  101K-02 gCAgAAgACAgCAgCgCgAT 53,8 °C

L ig ht C yc le r R E A L T IM E P C R

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LightCycler Real Time PCR:

RICERCA di 11 VIRUS DIVERSI in CAMPIONI di LIQUOR

224 liquor analizzati 1287 test eseguiti

33 campioni positivi

QUANTIFICAZIONE? 33 INFEZIONI VIRALI NEUROLOGICHE

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AD OGGI

! Abbiamo sperimentato protocolli diagnostici di LightCycler Real Time PCR (incluso HHV-6 e HHV-8) da impiegare in parallelo in una unica seduta.

! Gli acidi nucleici sono estratti dai campioni (liquor, sangue, urine, biopsie, ecc., purificati ed eventualmente concentrati in meno di 60 min

! Ogni campione può essere analizzato per la presenza di sei herpesvirus umani (HSV-1, HSV-2, VZV, EBV, CMV e HHV-6) in circa 60 min. La presenza di DNA virale può essere quantificata ed espressa come copie di DNA per ml.

! Lo stesso campione può essere testato anche per HHV-8, Poliomavirus (JCV e BKV) e Adenovirus.

! In circa 120-180 min dall’arrivo del campione, i risultati sono comunicati per telefono, inviati per e-mail (file pdf) e stampati per l’invio cartaceo.

LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti

Test LightCycler RealTime PCR per:

! Identificazione e quantificazione di Neisseria meningitidis

! Tipizzazione di N. meningitidis A, B e C

! Identificazione di N. meningitidis, S. pneumoniae e H. influenzae

! Identificazione e quantificazione di Listeria monocytogenes

! Identificazione di Mycobacterium spp

! Tipizzazione di M. tuberculosis e M. avium

! Identificazione e quantificazione di Borrelia burgdorferi sensu lato

! Tipizzazione di B.afzelii, B.garinii e B. burgdorferi sensu stricto

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LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti

LightCycler Real Time PCR: Sepsi e Meningiti

388 CAMPIONI 44 POSITIVI

19 MARZO 2007

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SEPSI E MENINGITI BATTERICHE

! marzo 2004 – marzo 2007

! 20 casi di sospetta meningite batterica e 2 di sepsi:

! 12 maschi e 10 femmine di età da 4 mesi ad 80 anni

! 12 deceduti

! Neisseria meningitidis è stata identificata in 11 pazienti:

6 ceppi erano di tipo B e i rimanenti 5 di tipo C

! Streptococcus pneumoniae è stato identificato in 8 pazienti.

! 25 pazienti sono risultati negativi per la presenza di patogeni infettivi, ad esempio:

! S.C. è deceduto per una causa violenta non ancora identificata

! IJ è deceduto per una polmonite ab ingestis

! ZAM di 80 anni è deceduta per decadimento generale

RIFLESSIONI CONCLUSIVE

Disponibili le Conoscenze e le Biotecnologie per una Diagnosi Avanzata delle Infezioni Neurologiche

! Identificazione

! Tipizzazione

! Quantificazione

! Referto rapido in 1,5 – 6 ore