1
LETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Asta Dambrauskienė
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
VIRULENTIŠKUMO VEIKSNIŲ IR
ATSPARUMO KARBAPENEMAMS
MECHANIZMŲ SĄSAJOS SU
KLINIKINE LIGOS EIGA
Daktaro disertacija Biomedicinos mokslai,
medicina (06B)
2
Disertacija rengta 2010–2017 m. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Laboratorinės medicinos klinikoje.
Mokslinė vadovė
prof. dr. Astra Vitkauskienė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
Disertacija ginama Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos medicinos mokslo krypties taryboje:
Pirmininkas
prof. habil. dr. Albinas Naudžiūnas (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
Nariai:
prof. dr. Asta Baranauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
prof. dr. Inga Arūnė Bumblytė (Lietuvos sveikatos mokslų universite-tas, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
dr. Audronė Eidukaitė (Inovatyvios medicinos centras, biomedicinos mokslai, medicina – 06B)
dr. Marius Domeika (Upsalos universitetas, biomedicinos mokslai, me-dicina – 06B)
Disertacija bus ginama viešame medicinos mokslo krypties tarybos posė-dyje 2017 m. rugpjūčio 23 d. 14.00 val. Lietuvos sveikatos mokslų universi-teto ligoninės Kauno klinikų Laboratorinės medicinos klinikos salėje Nr. 217.
3
LITHUANIAN UNIVERSITY OF HEALTH SCIENCES MEDICAL ACADEMY
Asta Dambrauskienė
ASSOCIATION BETWEEN
PSEUDOMONAS AERUGINOSA
VIRULENCE FACTORS,
CARBAPENEM RESISTANCE
MECHANISMS AND CLINICAL
COURSE OF DISEASE
Doctoral Dissertation Biomedical Sciences,
Medicine (06B)
4
The Dissertation has been prepared at the Department of Laboratory Medicine of the Medical Academy of the Lithuanian University of Health Sciences during the period of 2010–2017.
Scientific Supervisor:
Prof. Dr. Astra Vitkauskienė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
The Dissertation is defended at the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences:
Chairperson
Prof. Dr. Habil. Albinas Naudžiūnas (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Members:
Prof. Dr. Asta Baranauskaitė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
Prof. Dr. Inga Arūnė Bumblytė (Lithuanian University of Health Sciences, Medical Academy, Biomedical Sciences, Medicine – 06B) Dr. Audronė Eidukaitė (Center for Innovative Medicine, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
Dr. Marius Domeika (Upsala University, Biomedical Sciences, Medicine – 06B)
Dissertation will be defended at the open session of the Medical Research Council of the Lithuanian University of Health Sciences on the 23rd of
August, 2017 at 2.00 PM in the auditorium 205 of the Laboratory Medicine Department of the Hospital of Lithuanian University of Health Sciences Kauno Clinics.
5
TURINYS
SANTRUMPOS ... 7
ĮVADAS ... 9
1. DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI ... 11
1.1. Darbo tikslas ... 11
1.2. Uždaviniai ... 11
1.3. Darbo mokslinis naujumas ... 11
2. LITERATŪROS APŽVALGA ... 12
2.1. Pseudomonas aeruginosa ir jų sukeliamos infekcijos ... 12
2.2. Virulentiškumo veiksniai ... 14
2.3. Pseudomonas aeruginosa atsparumo karbapenemams problema ... 17
2.4. Pseudomonas aeruginosa atsparumo karbapenemams mechanizmai, jų reikšmė infekcijos išsivystymui ... 18
2.4.1. Išorinės membranos baltymas ... 18
2.4.2. Daugiavaisčiai atsparumo siurbliai ... 19
2.4.3. Karbapenemazės ... 20
3. TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI ... 23
3.1. Tiriamoji imtis ir tyrimo etapai ... 23
3.2. Tyrimo eiga ... 24
3.2.1. Pseudomonas aeruginosa padermių identifikacija ... 24
3.2.2. Jautrumo antibiotikams nustatymas ... 25
3.2.3. Pseudomonas aeruginosa O serogrupių nustatymas ... 26
3.2.4. Bioplėvelių susidarymas ... 27
3.2.5. Serumo baktericidinio poveikio tyrimas ... 28
3.2.6. Atsparumo karbapenemams mechanizmų nustatymas ... 29
3.2.7. Paciento duomenų surinkimas ... 31
3.2.8. Statistinė analizė ... 32
4. REZULTATAI ... 33
4.1. Pseudomonas aeruginosa atsparumo antibiotikams dinamika 2003, 2008, 2011 metais ... 33
4.2. Rizikos veiksniai, lemiantys karbapenemams atsparių Pseudomonas aeruginosa padermių sukeltų infekcijų išsivystymą ... 39
4.3. Pseudomonas aeruginosa atsparumo karbapenemams mechanizmų išsivystymo rizikos veiksniai ... 44
4.4. Pseudomonas aeruginosa virulentiškumo veiksnių sąsajos su klinikine ligos eiga ... 47
6
5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS ... 58
5.1. Atsparumas karbapenemams ir rizikos veiksniai, lemiantys jo išsivystymą ... 58
5.2. MBL ... 59
5.3. Virulentiškumo veiksniai ir jų įtaka klinikinei ligos eigai ... 61
IŠVADOS ... 64
PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 65
BIBLIOGRAFIJOS SĄRAŠAS ... 66
PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS ... 83
SUMMARY OF DOCTORAL DISERTATION ... 96
PRIEDAI ... 107
BRIEF INFORMATION ABOUT THE AUTHOR (DOKTORANTO GYVENIMO APRAŠYMAS) ... 109
7
SANTRUMPOS
χ2 – chi kvadratas µg/ml – mikrogramai mililitre µM – mikromolis A – atsparuAKT – apatiniai kvėpavimo takai
BD – Becton Dickenson
BKT – bendrasis kraujo tyrimas bla – beta laktamazė
CLSI – Klinikinių ir laboratorinių standartų institutas (Clinical and Laboratory Standards Institute) CR – centrinė reanimacija
CV – centrinis veninis
DAA – dauginis atsparumas antibiotikams DMSO – dimetilsulfoksidas
DNR – dezoksiribonukleo rūgštis dNTP – deoksinukleotidų mišinys DPV – dirbtinė plaučių ventiliacija
EARS – Europos antimikrobinio atsparumo stebėsena (European Antimicrobial Resistance Surveillance) EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis
EUCAST – Europos antimikrobinio jautrumo nustatymo komitetas (European Committee on Antimicrobial Susceptibility
Testing)
F – Fišerio kriterijus HP – hospitalinė pneumonija
IMP – imipenemas
INF – inkstų funkcijos nepakankamumas ISBL – išplėsto spektro beta laktamazė ITS – intensyviosios terapijos skyrius
J – jautru
KarbA – atsparu karbapenemams KarbJ – jautru karbapenemams
KFN – kvėpavimo funkcijos nepakankamumas
KPC – Klebsiella pneumoniae karbapenemazė
LPS – lipopolisacharidas
LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas MBL – metalo-beta laktamazė
8
MEM – meropenemas
MgCl2 – magnio chloridas
MH – Miuleris-Hintonas
mM – milimoliai
MSK – minimali slopinamoji koncentracija
P. aeruginosa – Pseudomonas aeruginosa
PGR – polimerazės grandininė reakcija RDS – respiracinis distreso sindromas SN – standartinis nuokrypis
U – vienetas
VIM – Verona integrono koduojama metalo – beta laktamazė VP – ventiliacinė pneumonija
9
ĮVADAS
Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) yra vienas dažniausių
hospi-talinių infekcijų sukėlėjų [1]. P. aeruginosa sukeltos infekcijos sunkiai gydomos dėl sukėlėjo gebėjimo greitai įgyti atsparumą antibiotikams. Tačiau daugėja įvairių tyrimų duomenų, kurie įrodo, kad, net ir skiriant tinkamą antibakterinį gydymą, P. aeruginosa sukeltos infekcijos susijusios su dideliu pacientų mirštamumu [2–5]. Eksperimentinių ir epidemiologinių tyrimų duomenys įrodo, kad P. aeruginosa padermės geba sintetinti keletą virulentiškumo veiksnių, kurie sudaro palankias sąlygas sukėlėjui kolo-nizuoti įvairius makroorganizmo paviršius, dalyvauti infekcijų išsivystyme ir daryti įtaką ligos baigčiai [6–8]. P. aeruginosa padermės pasižymi dideliu gebėjimu prisitaikyti jas supančioje aplinkoje ir kartu įgyti įvairių apsaugos veiksnių. Šių veiksnių įtaka infekcijos eigai nėra iki galo ištirta. Įrodyta, kad
P. aeruginosa, kaip ir kitų sukėlėjų, atsparumas antibiotikams,
virulen-tiškumo veiksniai gali kisti, priklausomai nuo aplinkos, kurioje bakterija persistuoja. Dažnas antibiotikų vartojimas gali nulemti P. aeruginosa pader-mių transformaciją į labai virulentiškas padermes [9, 10]. Ypač tai būdinga padermėms, kurios įgyja atsparumą daugumai antibiotikų, kadangi tokios
P. aeruginosa padermės prisitaiko mutuodamos išlikti ilgesnį laiką [9, 10].
Ceftazidimas ir karbapenemai (meropenemas ir imipenemas) yra labai plataus veikimo spektro antibiotikai, skiriami kaip ankstyva empirinė terapija antibiotikais gydant sunkias hospitalines infekcijas, kol dar nėra nustatytas sukėlėjas [8]. Tačiau, didėjant P. aeruginosa atsparumui net šiems antibiotikams, iškyla grėsmė empiriškai paskirti netinkamą gydymą. Vis dažniau nustatomos P. aeruginosa padermės, kurios yra atsparios visiems antipseudomoniniams antibiotikams (ypatingo atsparumo antibio-tikams padermės) [9]. Laktamazių, atsakingų už karbapenemų hidrolizę, sintezė (pagal Ambler B klasės metalo laktamazės ir D klasės OXA tipo laktamazės), pasunkėjęs vaistų patekimas dėl nebuvimo ar per mažos OprD baltymų ekspresijos ir padidėjęs daugiavaisčių siurblių aktyvumas yra pagrindiniai P. aeruginosa atsparumo karbapenemams mechanizmai [11]. Daugelio Europos centrų duomenys rodo, kad P. aeruginosa padermių atsparumo karbapenemams didėjimą nulemia beta laktamazių sintezė [12– 14]. IMP ir VIM yra dvi dažniausiai sutinkamos metalo beta laktamazės (MBL), atsakingos už karbapenemų hidrolizę. IMP fermentai yra kilę iš Azijos, bet vėliau pasirodė ir Europoje, Amerikoje bei Australijoje. O VIM fermentas pirmiausia buvo aptiktas Europoje, bet greitai paplito ir po kitus žemynus. Tačiau, nepaisant VIM paplitimo, išlieka tendencija, kad IMP fermentai daugiau būdingi Azijos regionui, o VIM dominuoja Europoje
10
[15]. Didėjantis atsparumas karbapenemams, nulemtas MBL, kelia didelį susirūpinimą, kadangi MBL sintetinančios P. aeruginosa padermės yra svarbios hospitalinių infekcijų sukėlėjos, ir jos lemia klinikinę ligos baigtį bei didesnius gydymo kaštus [16]. Infekcijoms, sukeltoms MBL sinteti-nančių P. aeruginosa padermių, būdingas didesnis mirštamumas, palyginti su infekcijomis, sukeltomis P. aeruginosa nesintetinančių MBL padermių [17]. Rizikos veiksniai, susiję su MBL sintetinančių P. aeruginosa sukelto-mis infekcijosukelto-mis, yra: dabartinis beta laktaminių antibiotikų ir fluorochino-lonų vartojimas, inkstų nepakankamumas, šlapimo kateterių naudojimas, neurologinės ligos, chemoterapija, kortikosteroidų vartojimas ir hospitaliza-vimas intensyviosios terapijos skyriuje [18]. Ch. Soscia su bendraautoriais teigia, kad, nuo to, kokius virulentiškumo veiksnius įgijusios bakterijos paplitusios aplinkoje, priklauso, ar sukėlėjas taps tik kolonizuojančia mikroflora, ar infekcijos sukėlėju [19]. P. aeruginosa, kaip ir kitų gram-neigiamų bakterijų, virulentiškumą įrodo atsparumas serumo baktericidi-niam poveikiui. Bakterija anksti atpalaiduoja LPS kompleksus, kurie nukenksmina makroorganizmo komplemento suaktyvintus bakterijų sunai-kinimo mechanizmus. In vitro atliktų eksperimentų rezultatai rodo, kad
P. aeruginosa mutantai, nesintetinantys O antigeno, yra jautrūs žmogaus
serumo baktericidiniam poveikiui, o sintetinantys O antigeną dažniau atsparūs šiam poveikiui [20, 21]. Atsparumas serumui susijęs su O antigeno buvimu ant ląstelės paviršiaus, ir šis atsparumo laipsnis priklauso nuo O antigeno struktūros, grandinės ilgio ir O antigeno kiekio, esančio ant lipido A [22]. Vienas iš bakterijų adaptacinių mechanizmų yra bioplėvelių sudary-mas [23, 24]. Bakterijų, sudarančių bioplėveles, sukeliamos infekcijos siejamos su kateterių, protezų ir kitų svetimkūnių naudojimu gydymo tikslais [24, 25]. Eksperimentinių tyrimų in vitro ir in vivo rezultatai įrodo, kad P. aeruginosa padermės, sudarančios bioplėveles, yra daug atsparesnės antibiotikams ir makroorganizmo imuninės sistemos apsaugos mechaniz-mams nei nesudarančios bioplėvelių [25–28]. Agresyvus ir intensyvus gydymas antibiotikais dažniausiai yra veiksmingas tik lėtinės infekcijos paūmėjimo periodais, kuriuos sukelia atsipalaidavusios nuo bioplėvelių bakterijos. Tačiau bioplėvelę sudarančias bakterijas suardyti sunku [25, 29], nes pasiekti reikiamą minimalią slopinamąją antibiotiko koncentraciją in
vivo yra sudėtinga [27]. Dažnai mikroorganizmams nustatomas ne vienas
izoliuotas virulentiškumo veiksnys, bet jų kompleksas. Svarbu įvertinti, kokią įtaką ligos eigai ir baigčiai turi ne tik sukėlėjo atsparumas antibioti-kams, bet ir kartu įgyti virulentiškumo veiksniai. Nustačius atsparumo genų sąsajas su P. aeruginosa gaminamais virulentiškumo veiksniais, įvertinus jų įtaką infekcijos eigai, būtų naudinga įgytas žinias panaudoti šių sukėlėjų plitimo prevencijos ir naikinimo strategijai sudaryti.
11
1.
DARBO TIKSLAI IR UŽDAVINIAI
1.1. Darbo tikslas
Įvertinti P. aeruginosa padermių atsparumo karbapenemams dinamiką ir virulentiškumo veiksnių bei atsparumo karbapenemams mechanizmų įtaką klinikinei infekcinės ligos eigai.
1.2. Uždaviniai
1. Įvertinti P. aeruginosa padermių, išskirtų iš kvėpavimo takų, atspa-rumo antibiotikams dinamiką 2003–2008–2011 metais.
2. Nustatyti karbapenemams atsparių P. aeruginosa padermių sukeltų infekcijų išsivystymo rizikos veiksnius.
3. Nustatyti P. aeruginosa atsparumo karbapenemams mechanizmų išsivystymo rizikos veiksnius.
4. Nustatyti P. aeruginosa padermių, išskirtų iš įvairios klinikinės medžiagos, virulentiškumo veiksnių – atsparumo karbapenemams, MBL gamybos, gebėjimo sudaryti bioplėveles, priklausomybės serogrupei, atsparumo baktericidiniam serumo poveikiui – sąsajas su klinikine ligos eiga.
1.3. Darbo mokslinis naujumas
P. aeruginosa atsparumo karbapenemams problema pasaulyje ir
Lietuvoje egzistuoja jau ne vienerius metus ir išlieka aktuali iki šių dienų. Kartais net ir tinkamai gydant antibiotikais sunkiai sergantiems ligoniams dėl tobulėjančių mikroorganizmo adaptacijos mechanizmų (pvz., bioplėvelių sudarymo) ir kitų gaminamų virulentiškumo veiksnių nepavyksta pasiekti gerų rezultatų. Dėl nuolat augančio atsparumo antibakteriniams vaistams gydymo taikiniu tampa ne pati bakterija, bet jos gaminamų virulentiškumo veiksnių slopinimas [30]. P. aeruginosa atsparumo karbapenemams mecha-nizmai Lietuvoje nustatyti ir paskelbti tik 2016 metais [31]. P. aeruginosa klinikinių padermių, išskirtų iš kvėpavimo takų, virulentiškumo veiksnius – priklausomybę O serogrupei ir atsparumą baktericidiniam serumo poveikiui – aprašė A. Vitkauskienė savo disertaciniame darbe, tačiau bakterijų gebėjimas sudaryti bioplėveles nagrinėtas nebuvo [32]. Tai yra pirmasis darbas, kuriame nagrinėjama P. aeruginosa padermių, išskirtų iš įvairios klinikinės tiriamosios medžiagos, virulentiškumo veiksnių ir atspa-rumo karbapenemams mechanizmų reikšmė bei įtaka infekcinės ligos eigai.
12
2.
LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Pseudomonas aeruginosa ir jų sukeliamos infekcijos
P. aeruginosa yra Pseudomonadaceae šeimai priklausanti
gramnei-giama tiesi arba lengvai lenkta 1–3 µm ilgio, 0,5–1,0 µm pločio lazdelė.
P. aeruginosa išskiria pioverdino ir piocino pigmentus, kurie nudažo
mity-binį agarą žalia arba mėlyna spalva ir padaro P. aeruginosa lengvai atpažįs-tama bakterija. Kolonijos gali būti labai įvairios morfologijos: nuo lygių, turinčių metalinį blizgesį, smulkių kolonijų iki labai gleivėtų, stambių, išsidėsčiusių per visą lėkštelę kolonijų. Didžioji dauguma padermių išskiria specifinį jazminų, muilo kvapą. P. aeruginosa turi vieną žiuželį, o ląstelės paviršius padengtas pilėmis ir fimbrijomis. Beveik visos padermės turi biosintetinį geną, kuris atsakingas už ekstraceliulinio polisacharido gamybą. Padidėjusi šio polisacharido gamyba nulemia gleivėtą padermių fenotipą [33]. Ekstraląsteliniai Pel ir Psl polisacharidai yra susiję su bioplėvelių sudarymu ir yra svarbūs veiksniai infekcinės ligos patogenezėje [34].
P. aeruginosa aptinkama dirvoje, vandenyje, augaluose ir kartais gali
kolonizuoti sveikus žmones ir gyvūnus. Ligoninėje P. aeruginosa koloni-zuoja drėgnus paviršius: vandens čiaupus, praustuvus, tualetus, dušus. Pato-geninės padermės yra išskirtos net iš vandens, kuriame buvo pamerktos pa-cientams atneštos gėlės. P. aeruginosa šaltinis gali būti ir ligoninės įranga, kuri turi kontaktą su vandeniu: šluostės, valymo tirpalai, drėkintuvai ir kt.
P. aeruginosa kaip visuomenėje įgytos infekcijos sukėlėjas mažai
reikš-mingas. Šis mikroorganizmas dažniausiai sukelia infekcijas tiems žmonėms, kurie naudojasi baseinais, sūkurinėmis voniomis [35, 36]. P. aeruginosa sukelia ulcerozinį keratitą tiems, kurie naudoja ilgalaikius kontaktinius lęšius. Šiems pacientams yra didesnė rizika įgyti infekciją dėl kontaktiniams lęšiams naudojamame skystyje esančių P. aeruginosa bakterijų [37, 38].
P. aeruginosa yra dažnas išorinės ausies uždegimo sukėlėjas [39],
endoftal-mito po akies operacijos ar traumos [40] ir endokardito sukėlėjas intraveni-nius narkotikus vartojantiems asmenims [41].
P. aeruginosa sukelia hospitalines infekcijas pacientams, kuriems
taiko-ma dirbtinė plaučių ventiliacija, kurie gydomi antibiotikais, chemoterapija ar chirurginiu būdu [42]. Pacientams, kuriems atsivėrusios didelės nudegimų žaizdos, taip pat yra didesnė P. aeruginosa sukeltų infekcijų rizika. Tačiau pastaraisiais metais, taikant efektyvų vietinį antimikrobinį gydymą ir atliekant nudegimo žaizdos eksciziją, pavyko smarkiai sumažinti P. aeruginosa sukeltų infekcijų dažnį [43]. Apie 7 proc. sveikų žmonių nešioja P. aeruginosa nosia-ryklėje arba ant odos. 24 proc. žmonių P. aeruginosa yra išskiriama iš išmatų
13
[8]. 50 proc. pacientų, kuriems yra rizikos veiksnių, galima nustatyti koloni-zaciją P. aeruginosa prieš invazinės infekcijos išsivystymą [44]. P.
aeru-ginosa sukeltos infekcijos gali pasireikšti įvairiais klinikiniais sindromais, toli
peržengdamos savo pirminio tropizmo vietą.
Bakteriemija. Ankstesnių tyrimų duomenimis, P. aeruginosa
bakterie-mijų atvejais buvo nustatytas 50 proc. mirštamumas [45–47]. Iki antipseu-domoninių beta laktaminių antibiotikų atsiradimo pacientų, kuriems buvo neutropenija, mirštamumas siekė net 70 proc. Dabartinių tyrimų duome-nimis, priklausomai nuo pacientų klinikinės būklės sudėtingumo ir skiriamo antibakterinio gydymo adekvatumo, mirštamumas svyruoja nuo 28 iki 44 proc. [48]. P. aeruginosa bakteriemija aptinkama 10 proc. pacientų, ku-riems yra neutropenija [49]. Vis rečiau nustatoma P. aeruginosa bakterie-mija pacientams, kuriems atsivėrusios nudegimų žaizdos. Paskutiniais me-tais dažniausiais bakteriemijos šaltiniais tampa kvėpavimo ir šlapimo takai dėl ilgalaikės dirbtinės plaučių ventiliacijos ir šlapimo kateterių naudojimo.
Ūminė pneumonija. Tai dažniausiai sukeliama P. aeruginosa infekcija.
Ši bakterija yra pirmas arba antras pagal dažnį ventiliacinių pneumonijų sukėlėjas [50, 51]. Bet duomenys dažnai gaunami remiantis skreplių arba trachėjos aspiratų pasėlių rezultatais ir gali tiesiog rodyti trachėjos arba intubacinio vamzdelio kolonizaciją arba tracheobronchito sukėlėją. Miršta-mumas nuo ventiliacinės pneumonijos, sukeltos P. aeruginosa, siekia 70– 80 proc., tačiau labai sunku įvertinti, kokią įtaką daro jau esama plaučių liga [51]. Jeigu ventiliuojamam ligoniui, kuriam yra neutropenija, P. aeruginosa infekcija komplikuojasi bakteriemija, mirštamumas siekia 90 proc. [48, 52].
Lėtinės kvėpavimo takų infekcijos. P. aeruginosa kolonizuoja pažeistus
bronchus bronchektazijų atvejais, kai yra struktūrinių kvėpavimo takų pažei-dimų ir juose kaupiasi gleivės. Tai yra viena dažniausiai išskiriamų patoge-nų cistine fibroze sergantiems pacientams.
Kaulų ir sąnarių infekcijos. P. aeruginosa nėra tipinis šių infekcijų
sukėlėjas, tačiau iš kvėpavimo ar šlapimo takų ar kitų organų jis lengvai išsisėja ir infekuoja stuburo slankstelių diskus. Durtinių žaizdos atvejais, kai, pvz., praduriamas sportinis batelis, gali būti sukeliamas pėdos kaulų osteo-mielitas, nes sportiniame batelyje tarp gumos sluoksnių yra randama P.
aeru-ginosa bakterijų. Šio pobūdžio infekcijos būdingesnės vaikams [53, 54].
Intraveninių narkotikų vartotojams P. aeruginosa sukelia krūtinkaulio osteomielitą.
Akių ir ausų infekcijos. P. aeruginosa sukelia akių infekcijas, kai
traumos metu tiesiogiai inokuliuojamas sukėlėjas, pažeidžiant akies paviršių kontaktinius lęšius naudojantiems asmenims, arba bakteriemijos metu, kai, išsisėjus bakterijoms, išsivysto endoftalmitas.
14
P. aeruginosa gali sukelti lengvos eigos ausų infekcijas, tokias kaip
„plaukiko ausis“, besimaudantiems nechloruoto vandens baseinuose [55]. Bet sukelia ir labai sunkias ausų infekcijas, ilgai persistuojančias, sukelian-čias neurologines komplikacijas, kurios gali baigtis mirtimi.
Šlapimo takų infekcijos. P. aeruginosa sukelia šlapimo takų infekcijas,
kai šlapimo takuose yra svetimkūnių – akmenų, stentų, kateterių arba kai yra šlapimo takų obstrukcija, arba pacientui buvo taikytas chirurginis gydymas. Taip pat asmenims, kuriems yra paraplegija, didesnė P. aeruginosa sukeltų šlapimo takų infekcijų išsivystymo rizika dėl dažnai vartojamų antibiotikų, išselekuojamos P. aeruginosa padermės. Didžioji dalis P. aeruginosa šlapi-mo takų infekcijų yra priskiriamos komplikuotoms, kurias reikia ilgiau gydyti antibiotikais.
Odos ir minkštųjų audinių infekcijos. Esant neutropenijai, P. aeruginosa
sukelia ecthyma gangrenosum, labai specifinį odos pažeidimą [56, 57]. Taip pat sukelia antrines trofinių opų, nudegimo žaizdų infekcijas, gali sukelti folikulitą, kuris dažniausiai būna susijęs su maudymusi bendrose voniose ir baseinuose.
Endovaskulinės infekcijos. Yra aprašyta protezuoto vožtuvo infekcinio
endokardito, sukelto P. aeruginosa, atvejų, tačiau dažniau pasitaiko natūra-laus vožtuvo infekcinis endokarditas intraveninius narkotikus vartojantiems pacientams. Būdingas daugelio vožtuvų pažeidimas. Jeigu pacientui nustato-ma P. aeruginosa bakteriemija, o chirurginis gydymas taikytas nebuvo, nėra traumos ar trofinės opos, tokiam pacientui reikėtų įtarti endokarditą, kaip bakteriemijos šaltinį.
Dėl didėjančio P. aeruginosa gebėjimo įgyti dauginį atsparumą antibio-tikams galima teigti, jog ir ateityje ši bakterija išliks vienu iš svarbiausių hospitalinių infekcijų sukėlėjų, nulemiančių letalią baigtį.
2.2. Virulentiškumo veiksniai
P. aeruginosa dalyvauja įvairių infekcijų – tiek lėtinių (cistinė fibrozė),
tiek hospitalinių (ventiliacinių pneumonijų) – patogenezėje. Svarbesnį vaid-menį atlieka imlaus infekcijai organizmo imuninė būklė nei mikroorganiz-mo nulemti virulentiškumikroorganiz-mo veiksniai. Neutropenija yra viena iš svarbiausių būklių, lemiančių tiek visuomenėje, tiek ligoninėje įgytų P. aeruginosa sukeltų infekcijų išsivystymą. Tyrimų su gyvūnais metu nustatyta, kad jeigu nėra funkciškai veikiančių polimorfonuklearinių neutrofilų, netgi labai maži
P. aeruginosa kiekiai gali sukelti infekciją plaučių ir kituose audiniuose
[58]. Įgimtas imuninis atsakas į infekciją pasireiškia pažeidus apsauginę barjerinę funkciją – odos ir gleivinių vientisumą. Tai nutinka esant
nudegi-15
mo ir kitokioms žaizdoms, taip pat naudojant šlapimo takų kateterius, endotrachėjinius vamzdelius. Vėliau P. aeruginosa, gebėdama mutuoti ir keisti DNR, panaudodama turimus beveik visų pagrindinių grupių bakterijų virulentiškumo veiksnius, prisitaiko prie aplinkos ir išplinta. P. aeruginosa išskiria egzotoksinus, endotoksinus, III tipo sekrecinius toksinus, proteazes, fosfolipazes, geležį jungiančius baltymus, egzopolisacharidus, suteikiančius galimybę sudaryti bioplėveles, turi piles, žiuželius (2.2.1 lentelė).
2.2.1 lentelė. P. aeruginosa virulentiškumo veiksniai
Virulentiškumo veiksnys Funkcija Literatūros
šaltinis
Žiuželiai Judrumas; bioplėvelių sudarymas; prikibimas prie šeimininko audinių ir mucino komponentų
[44, 59]
Pilės Judrumas; bioplėvelių sudarymas;
prikibimas prie šeimininko audinių [44, 59] Lipopolisacharidas Endotoksinis / antifagocitinis / išvengti
susiformavusių O antigenų antikūnų [44] Alginatas Bakterijų apsauga, sąveika su epitelio
ląstelėmis [44, 59]
Išskiriami virulentiškumo veiksniai: Piocianinas Pioverdinas Šarminė proteazė Proteazė IV Elastazė Fosfolipazė C Egzotoksinas A
IL-8 ↑ , sukelia neutrofilų apoptozę, slopina imuninį atsaką
Reguliuoja egzotoksino A išsiskyrimą, prijungia šeimininko geležį
Fibriną lizuojanti proteazė, slopina neutrofilus
Ardo šeimininko audinius ir plazmos baltymus
Ardo šeimininko audinius ir plazmos baltymus, slopina neutrofilus Inaktyvuoja surfaktantą, slopina neutrofilų funkciją
Slopina baltymų sintezę
[59] [59] [60] [60] [60] [59] [59] III tipo sekrecinė sistema
Exo S Exo T Exo Y Exo U Suardo citoskeletą Suardo citoskeletą
Patenka į ląstelės citoplazmą Pagrindinis citotoksinas
[44, 59] [44, 59] [44, 59] [44, 59] Kvorumo jutimo sistema
(angl. Quorum sensing) las
rhl
Bioplėvelių sudarymas; virulentiškumo
16
P. aeruginosa naudoja komunikacijos sistemą, kuri vadinasi kvorumo
jutimu (angl. quorum sensing), ji, sinchronizuodama genų ekspresiją, padeda prisitaikyti prie išorės sąlygų. Šia sistema yra reguliuojama bakterijų virulentiškumo veiksnių gamyba, judrumas, bioplėvelių sudarymas, protea-zių gamyba ir kiti [61]. N. Hoiby, J. W. Costertonas pirmieji įtarė, kad yra tiesioginis ryšys tarp P. aeruginosa bioplėvelių sudarymo ir plaučių koloni-zacijos cistine fibroze sergantiems pacientams [62, 63]. Ir tik po kelių dešimtmečių pavyko įrodyti bioplėvelių reikšmę infekcijos procese [64]. Bioplėveles sudarančios bakterijos sukelia arba invazinių prietaisų infekci-jas (kateterių, intubacinių vamzdelių, protezų, stimuliatorių, lęšių ir kitų), arba audinių infekcijas (plaučių, cistinės fibrozės atveju, lėtinį osteomielitą, lėtinį vidinės ausies uždegimą, endokarditą, lėtinį prostatitą, gingivitą) [65]. Vieną iš didesnių problemų bioplėvelės sudaro esant lėtinių žaizdų infekcijoms (pragulos, trofinės opos, diabetinės pėdos), nes dėl pažeisto odos vientisumo susidaro palankios sąlygos bakterijų kolonizacijai [66, 67]. Lėtinės žaizdų infekcijos, sukeltos P. aeruginosa, yra didesnės, gilesnės ir sunkiau gyjančios dėl sudaromų bioplėvelių ir kitų virulentiškumo veiksnių, apsaugančių bakterijas nuo imuninių mechanizmų [68]. Bioplėveles suda-rančios bakterijos gali būti šimtus kartų atsparesnės antibiotikams ir dezinfe-kuojamosioms medžiagoms nei planktoninės bakterijos [25]. Infekcijos, sukeltos bioplėveles sudarančių bakterijų, metu planktoninės bakterijos patenka į kraujotaką ir gali būti neutralizuotos antibiotikų ir imuninės sistemos. Tačiau bioplėvelę sudarančios bakterijos pasižymi didele toleran-cija antibiotikams ir ląsteliniam bei humoraliniam imunitetui, todėl jos išlieka ir nulemia infekcijos pasikartojimą [69, 70]. Lieka tik vienintelis gydymo būdas – pašalinti kolonizuotą medicinos prietaisą arba chirurginiu būdu pašalinti infekuotus audinius [69].
Lipopolisacharidas yra pagrindinė P. aeruginosa išorinės membranos sudedamoji dalis. Šis virulentiškumo veiksnys lemia bakterijų prikibimą prie makroorganizmo audinių ir apsaugą nuo komplemento aktyvintų gyny-binių mechanizmų [71, 22]. Jis susideda iš trijų dalių: lipido A, šerdinio oligosacharido ir O antigeno, pasikartojančio vieneto. Yra žinomi du LPS tipai: paprastasis ir O antigeno. Paprastasis tipas yra polimeras, o O antigeno tipas turi serogrupei specifines grandines [72]. Pagal Tarptautinę antigeninę sistemą, yra nustatyta 20 skirtingų P. aeruginosa O antigenų serogrupių, kurių O antigeninė struktūra yra žinoma [73]. Pasaulyje protrūkių atvejais dažniausiai nustatoma P. aeruginosa O12 serogrupė, priklausanti ST111 klonui, kuris pasižymi dauginiu atsparumu antibiotikams. Todėl daugelis mokslininkų ieško sąsajų tarp P. aeruginosa priklausomybės O antigeno serogrupės ir dauginio atsparumo antibiotikams [32, 74–76]. Lipopolisacha-ridai apsaugo bakteriją nuo žmogaus serumo baktericidinio poveikio.
17
A. Vitkauskienės atlikto tyrimo metu nustatyta, kad P. aeruginosa pader-mės, išskirtos iš apatinių kvėpavimo takų, dažniau buvo jautrios serumo baktericidiniam poveikiui nei vidutiniškai atsparios ar atsparios. Tačiau pacientų AKT kolonizavusios P. aeruginosa padermės dažniau buvo seru-mui jautrios, palyginti su P. aeruginosa padermėmis, sukėlusiomis HP. Pastarojoje P. aeruginosa padermių grupėje beveik pusė išskirtų padermių buvo vidutiniškai atsparios ar atsparios serumui. Buvo nustatyta, kad serumo baktericidiniam poveikiui atsparios P. aeruginosa padermės dažniau gali sukelti HP nei kolonizuoti pacientų AKT [32].
2.3. Pseudomonas aeruginosa atsparumo karbapenemams problema Karbapenemai yra beta laktaminių grupei priklausantys plačiausio
spekt-ro antibiotikai, veikiantys gramteigiamas ir gramneigiamas bakterijas.
Daž-niausiai jie yra paskutinės eilės vaistai, rezerviniai, skiriami gydyti sunkias, keliančias grėsmę gyvybei infekcijas, kurias sukelia atsparūs mikroorga-nizmai [77–79, 80]. Tačiau visame pasaulyje mikroorganizmų atsparumas karbapenemams didėja [81–88]. P. aeruginosa padermių atsparumas
karbape-nemams JAV svyruoja nuo 7,4 proc. iki 35,4 proc. [89]. Kai kuriuose Pietų
Amerikos regionuose siekia net 60 proc. [90]. Europos užkrečiamųjų ligų
kontrolės ir centro duomenimis, Europoje atsparumas karbapenemams
nusta-tomas apie 17 proc. iš kraujo ir likvoro išskirtų P. aeruginosa padermių
pastaruosius 5 metus. Šis dažnis svyruoja nuo 2,4 proc. Jungtinėje karalystėje, 4 proc. Olandijoje, 6,5 proc. Švedijoje, 12,5 proc. Estijoje, 15,4 proc. Latvijoje, 22,7 proc. Ispanijoje, 26,8 proc. Lietuvoje, 37 proc. Lenkijoje, 51,9 Slovakijoje iki 66,3 proc. Graikijoje [91]. Pastebima, kad pastaraisiais metais
atsparumas karbapenemams didėja, o tai lemia prastesnes baigtis, ilgesnį
hospitalizacijos laiką, didesnes gydymo išlaidas [92–94]. Dėl sunkios paciento pagrindinės ligos, sukėlėjo virulentiškumo veiksnių sunku įvertinti tiesioginį atsparumo karbapenemams poveikį pacientų mirštamumui [95, 96]. Kai kurie tyrėjai teigia, kad matomas didesnis pacientų, kuriems infekciją sukėlė karbapenemams atsparios P. aeruginosa padermės, mirštamumas, tačiau kiti šios tendencijos nenustatė [97, 98]. Diskusija dėl karbapenemams atsparių P. aeruginosa padermių įtakos pacientų mirštamumui išlieka. Liu ir bendraautorių tyrimo metu pastebėta tik kiek didesnė mirštamumo rizika pa-cientams, kuriems išskirtos karbapenemams atsparios P. aeruginosa pader-mės [99]. Greičiausiai karbapenemams atsparių P. aeruginosa infekcijų atve-jais didesnį mirštamumą galima paaiškinti tuo, kad tokiems pacientams dažniau skiriamas netinkamas pirminis gydymas antibiotikais [48]. Taip pat, daugelio tyrimų duomenimis, sunki pagrindinė liga gali nulemti letalią baigtį
18
[48]. Tačiau yra ir priešingų duomenų, kad pagrindinė pacientų liga neturi įtakos pacientų mirštamumui karbapenemams atsparių ir karbapenemams jautrių P. aeruginosa grupėje [97]. Neaiški ir atsparių bakterijų virulentiš-kumo reikšmė pacientų baigtims. Vieni autoriai teigia, kad atsparios karbape-nemams padermės pasižymi didesniu virulentiškumu ir dėl to nulemia
pras-tesnes baigtis [48]. Bet Bjorkmanas ir bendraautoriai nustatė, jog
karbepen-emams atsparių padermių sukeltų infekcijų atvejais pacientų išgyvenamumo trukmė buvo ilgesnė nei karbapenemams jautrių padermių, praėjus 48 val.
nuo bakteriemijos pradžios. Tai galėtų reikšti mažesnį karbapenemams
atspa-rių padermių virulentiškumą [100]. In vitro tyrimai įrodo, kad atsparumo genai ar mutacijos gali pažeisti mikroorganizmų būklę ir sumažinti jo gebė-jimą sukelti makroorganizmo uždegiminį atsaką. Tai paneigia hipotezę, jog atsparesni mikroorganizmai yra virulentiškesni [101].
2.4. Pseudomonas aeruginosa atsparumo karbapenemams mechanizmai, jų reikšmė infekcijos išsivystymui
P. aeruginosa turi įgimtą atsparumą kai kuriems beta laktaminiams
antibiotikams ir gali greitai jį įgyti mutacijų metu arba dėl perduodamų genetinių elementų. P. aeruginosa išskiria chromosomų koduojamą AmpC beta laktamazę ir keletą svarbių išstūmimo siurblių, kurie išstumia iš bakterijos ląstelės antibiotikus, biocidus, dažus, skalbiklius, metabolinių procesų slopiklius, organinius tirpiklius ir molekules, kurios dalyvauja vienai ląstelei perduodant informaciją kitai [102, 103]. Pradėjus plačiau vartoti ligoninėse karbapenemus, atsparumo karbapenemams mechanizmai išplito. Visus karbapenemams mechanizmus būtų galima suskirstyti į fermentinius (karbapenemazes) ir nefermentinius [104]. P. aeruginosa gali turėti keletą atsparumo karbapenemams mechanizmų vienu metu: išorinės membranos D kanalo pažeidimus (OprD), padėjusią chromosomose koduo-jamos cefalosporinazės AmpC gamybą, daugiavaisčių išmetimo siurblių (MexAB-OprM ir kt.) ir gaminti A, B, D klasių beta laktamazes [105–107].
2.4.1. Išorinės membranos baltymas
Mažas išorinės membranos pralaidumas nulemia P. aeruginosa atsparu-mą daugeliui antibiotikų. OprD yra baltymas porinas, formuojantis išorinės membranos kanalus. OprD baltymo trūkumas gali smarkiai sumažinti bakte-rijos jautrumą karbapenemams, ypač imipenemui. Eksperimentai su mutan-tais, kurie turi padidėjusį OprD baltymų pralaidumą, parodė stipriai padidėjusį jautrumą tokiems vaistams, kaip cefotaksimas ir karbenicilinas [108]. Funkci-niai tyrimai nustatė, kad OprD baltymo 2 ir 3 kilpų sudėtyje yra vietų, kurios
19
pririša imipenemą, ir bet kokia įvykusi mutacija šiose kilpose gali nulemti atsparumą karbapenemams [109]. OprD baltymas yra kanalas, per kurį į ląstelę patenka ir kai kurios aminorūgštys, peptidai, kurie gali konkuruoti su karbapenemais. OprD baltymas transkripcijos metu yra stipriai reguliuojamas kai kurių metalų, mažų biologiškai veiklių molekulių, aminorūgščių ir išstū-mimo siurblių reguliatorių. Dėl sudėtingų reguliavimo mechanizmų ir didelės mutacijos OprD gali būti vienas dažniausiai sutinkamų P. aeruginosa atspa-rumo karbapenemams mechanizmų. Castanheira ir bendraautorių tyrimo metu buvo nustatyta, kad vyraujantis atsparumo karbapenemams mechanizmas buvo OprD baltymo sumažėjimas ar netektis, jis nustatytas 94,9 proc. karba-penemams atsparių P. aeruginosa padermių [110]. Vienų tyrimų duomenimis, mutacijos porinus koduojančiose genuose dažniausiai randamos imipenemui atspariose P. aeruginosa padermėse, kiti autoriai nustato šį atsparumo mechanizmą ir meropenemui atspariose padermėse, taip pat netgi ir jautriose meropenemui ir imipenemui padermėse [111–114]. Greičiausiai tai lemia, jog
P. aeruginosa gali turėti kelis atsparumo mechanizmus vienu metu, ne tik
OprD baltymo trūkumą, bet ir chromosomose koduojamus mechanizmus: AmpC padidėjusią gamybą ar daugiavaisčius atsparumo siurblius [115, 116].
2.4.2. Daugiavaisčiai atsparumo siurbliai
Daugiavaisčiai atsparumo siurbliai yra baltymai, koduojami genų, esan-čių chromosomose ar plazmidėse [117, 118]. Pagal sudėtį, energijos šaltinius ir substratus apimtų transmembraninių regionų skaičių daugiavaisčiai siurbliai skirstomi į 5 šeimas [117–119]. P. aeruginosa genomo sekoskaitos rezultatai parodė, kad šiai bakterijai yra būdingos visos penkios išstūmimo siurblių šeimos, tačiau didžiausią dalį sudaro RND šeima [120]. RND šeima yra sudaryta iš siurblio baltymo, kertančio vidinę membraną, periplazminės membranos baltymo ir baltymo, formuojančio kanalą išorinėje membranoje [121]. Ši trišalė sistema leidžia tiesiogiai iš ląstelės citozolio ar periplazminės erdvės išstumti įvairius vaistus [122].P. aeruginosa turi 10 rūšių RND
išme-timo siurblių, kurie skiriasi išstumiamais substratais. MexAB-OprM siurblys gali iš ląstelės išstumti skirtingų klasių antibiotikus: fluorochinolonus, tetra-ciklinus, chloramfenikolį, beta laktamus, beta laktamazių inhibitorius, makro-lidus, novobiociną, trimetoprimą ir sulfonamidus [123]. MexAB-OprM, palyginti su kitais RND daugiavaisčiais siurbliais, išstumia daugiausia beta laktaminių antibiotikų klasės antibiotikų, tokių kaip karboksipenicilinai, aztreonamas, plataus spektro cefalosporinai, karbapenemai (bet ne imipene-mas). MexcD-OprJ siurblys pašalina fluorochinolonus, beta aktamus, chloramfenikolį, tetraciklinus, novobiociną, trimetoprimą ir makrolidus [123]. Priešingai nei MexAB-OprJ, MexCD-OprJ neišstumia tiek daug beta
lakta-20
minių antibiotikų, tačiau gali pašalinti ketvirtos kartos cefalosporinus (cefepi-mą) [123]. Substratai, kuriuos geba pašalinti MexEF-OprN, yra fluorochino-lonai, chloramfenikolis ir trimetoprimas [123], bet negali pašalinti šiuo metu prieinamų beta laktaminių antibiotikų. Fluorochinolonai, specifiniai beta laktamai (cefepimas), aminoglikozidai, tetraciklinai, eritromicinas yra išstu-miami MexXY siurblio [124, 125]. MexJK-OprM eksportuoja iš ląstelės eritromiciną ir tetracikliną, o MexJK-Opmh pašalina triklozaną [126, 127]. Kiti RND išstūmimo siurbliai yra nagrinėjami, jų šalinamos iš ląstelės medžiagos nėra iki galo išaiškintos.
2.4.3. Karbapenemazės
Karbapenemazės yra specifinės beta laktamazės, kurios gali hidrolizuoti karbapenemus, cefalosporinus ir penicilinus, išskyrus monobaktamus. Visos beta laktamazės gali būti skirstomos pagal struktūrinę arba funkcinę klasifi-kaciją [128]. Pagal Ambler struktūrinę klasifiklasifi-kaciją išskiriamos 4 beta lakta-mazių klasės: A – išplėsto spektro beta laktamazės (ISBL), B – metalo-beta laktamazės (MBL), C – cefalosporinazės (AmpC), D – oksacilinazės. A, C, D klasių beta laktamazės beta laktaminio žiedo hidrolizei naudoja seriną, o B klasės beta laktamazės hidrolizei naudoja vieną ar du dvivalenčius cinko jonus [129, 130]. Visos perduodamos karbapenemazės išplito po pasaulį, išskyrus SIM-1 (Seoul imipenemazę) [131, 132]. MBL yra kliniškai reikšmin-giausia P. aeruginosa [133]. Dauguma genų, koduojančių MBL, yra genų kasetėse integronuose ir yra lengvai perduodami [134]. Tame pačiame in-tegrone gali būti ir daugiau genų, koduojančių atsparumą kitų klasių antibioti-kams, ir ši savybė nulemia DAA pasižyminčių padermių fenotipą [135]. Pir-masis MBL tipas buvo IMP (imipenemazė), aptiktas Japonijoje 1988 metais. O antrasis – VIM (Verona integrone koduojama MBL) tipas buvo nustatytas Italijoje 1999 metais [136, 137]. Vėliau buvo nustatyti: SPM, GIM-, SIM-, KHM-, NDM-, AIM-, DIM-, SMB-, TMB- ir FIM-tipo fermentai [138, 139]. IMP ir VIM tipo MBL išplito po visus žemynus, o kiti MBL tipai pasireiškia sporadiškai. SPM-1 (Sao Paolo MBL) sukelia protrūkius Brazilijoje [140]. GIM-1 (Vokiečių imipenemazė) ir AIM-1 (Australijos imipenemazė) nusta-tytos Vokietijoje ir Austrijoje, tačiau kitur neišplito [141, 142]. P. aeruginosa gali būti nustatomi 33 iš 55 žinomų IMP variantų [143], paskutinysis nustatytas IMP-8 Vokietijoje [144, 145]. IMP tipo fermentai pagal aminorūgščių struktūrą skirstomi į pogrupius, juose aminorūgščių sutapimas yra 90–99 proc. [134]. VIM tipo fermentai yra panašūs į IMP, aminorūgščių sutapimas apie 40 proc. [146]. Pastaruoju metu VIM-2 subtipo MBL yra labiausiai išplitusi pasaulyje (2.4.1 lentelė) [134]. 24 iš 46 VIM variantų randami JAV.
21
2.4.1 lentelė. Verona integrone koduojamo metalo-beta laktamazės
fermentų paplitimas pasaulyje
VIM variantas Geno vieta Šalis, kuriame nustatytas Literatūros šaltinis
VIM-1 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas Nežinoma Italija Prancūzija Graikija Vokietija [137, 147–150]
VIM-2 1 klasės integronas Nežinomas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas Nežinoma Nežinoma 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas Nežinoma 1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas Nežinoma 1 klasės integronas Nežinoma Nežinoma Nežinoma 1 klasės integronas 1 klasės integronas Tunisas Tailandas Austrija Meksika Indija Kenija Vengrija Malaizija Pietų Korėja Japonija Prancūzija Graikija Italija Portugalija Ispanija Kroatija Lenkija Čilė Venesuela Argentina JAV Belgija Vokietija Turkija Egiptas Lietuva [134, 150–169]
VIM-3 Nežinoma Taivanas [170]
VIM-4 1 klasės integronas Nežinoma 1 klasės integronas 1 klasės integronas Nežinoma Graikija Švedija Lenkija Vengrija Prancūzija [134, 150, 157, 171] VIM-5 Nežinoma
1 klasės integronas Indija Turkija
[134, 155] VIM-6 1 klasės integronas
1 klasės integronas 1 klasės integronas 1 klasės integronas Indija Indonezija Pietų Korėja Filipinai [155, 172]
22
2.4.1 lentelės tęsinys
VIM variantas Geno vieta Šalis, kuriame nustatytas Literatūros šaltinis
VIM-8 Nežinoma Kolumbija [174]
VIM-9 Nežinoma Jungtinė Karalystė [143]
VIM-10 Nežinoma Jungtinė Karalystė [175] VIM-11 1 klasės integronas
Nežinoma Nežinoma 1 klasės integronas Indija Argentina Italija Malaizija [155, 158, 176]
VIM-13 1 klasės integronas Ispanija [177] VIM-14 Nežinoma
1 klasės integronas Ispanija Italija
[178] VIM-15 1 klasės integronas Bulgarija [179] VIM-16 1 klasės integronas Vokietija [179] VIM-17 1 klasės integronas Graikija [179]
VIM-18 1 klasės integronas Indija [155]
VIM-20 Nežinoma Ispanija [114]
VIM-28 1 klasės integronas Egiptas [180] VIM-30 1 klasės integronas Prancūzija [180]
VIM-36 Nežinoma Belgija [150]
VIM-37 Nežinoma Lenkija [150]
VIM-38 1 klasės integronas Turkija [181] NDM-1 buvo išskirtas Klebsiella pneumoniae ir Escherichia coli pader-mėse pacientams, kurie prieš tai buvo patekę į ligoninę Naujajame Delyje, Indi-joje, 2009 metais [182]. NDM-1 P. aeruginosa padermėse buvo išskirtas 2011 m. Serbijoje [183], po metų Prancūzijoje pacientams, kurie prieš tai buvo hospitalizuoti Serbijoje, po to išplito pasaulyje [184–187]. FIM-1 buvo išskirtas DAA pasižyminčia P. aeruginosa padermėje Florencijoje (Italijoje). FIM-1 variantas yra panašus į NDM-1, nes aminorūgštis sutampa 40 proc. [188].
A klasės karbapenemazė KPC (Klebsiella pneumoniae karbapenemazė)
P. aeruginosa padermėse buvo išskirta Kolumbijoje ir, priešingai nei Klebsiella pneumoniae, gaminančios KPC, neišplito po pasaulį ir yra
išskiriamos tik Pietų Amerikoje [189]. Fermentai GES (Gviana išplėsto spektro) tampa kliniškai reikšmingi tik tada, jeigu yra derinyje su pažeistu išorinės membranos pralaidumu arba padidėjusiu išmetimo siurblių aktyvumu [132]. Panašiai veikia C klasės beta laktamazės ir karbapenemus hidrolizuoja kartu su kitais atsparumo mechanizmais [190]. O D klasės karbapenemazės yra itin retos P. aeruginosa padermėse ir neturi tokios klinikinės reikšmės, kaip Acinetobacter baumannii padermėms [191].
23
3.
TYRIMO MEDŽIAGA IR METODAI
Atliktas retrospektyvusis tyrimas Lietuvos sveikatos mokslų universi-teto Laboratorinės medicinos klinikoje, gautas Kauno regioninio biomedi-cininių tyrimų etikos komiteto leidimas (protokolo Nr. BE-2-3). Šiam tyrimui vykdyti buvo gautas Lietuvos mokslo tarybos finansavimas (Nr. MIP 047/2012).
3.1. Tiriamoji imtis ir tyrimo etapai
Tyrimas buvo vykdomas dviem etapais. Tyrimo etapų schema pateikta 3.1.1 paveiksle. Pirmo etapo metu į tyrimą buvo įtrauktos 2003 m., 2008 m. ir 2011 m. iš Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninėje Kauno klini-kose (toliau – Kauno kliniklini-kose) gydytų pacientų kvėpavimo takų išskirtos
P. aeruginosa padermės. Buvo nustatytas jų jautrumas antibiotikams ir
metalo-beta laktamazės gamyba. Antro etapo metu tiriamąjį kontingentą sudarė nuo 2011 m. sausio 1 d. iki 2012 m. birželio 31 d. Kauno klinikose gydytų pacientų įvairių klinikinių tiriamųjų medžiagų išskirtos P.
aerugi-nosa padermės. Taip pat buvo įtrauktos jau pirmoje dalyje tirtos 2011 m. iš
kvėpavimo takų išskirtos padermės. To paties paciento buvo įtraukta tik po vieną padermę. Išskirtos padermės buvo užšaldytos –80°C temperatūroje. Buvo nustatomi šių padermių virulentiškumo veiksniai, jautrumas antibio-tikams ir molekuliniais genetiniais metodais – atsparumo karbapenemams mechanizmai. Taip surinkti ir išanalizuoti pacientų klinikiniai duomenys.
24
3.1.1 pav. Tyrimo schema
AKT – apatiniai kvėpavimo takai, MSK – minimali slopinamoji koncentracija, IMP – imipenemas, EDTA – etilendiamintetraacto rūgštis.
3.2. Tyrimo eiga
3.2.1. Pseudomonas aeruginosa padermių identifikacija
Visos tiriamosios medžiagos buvo paimtos gydančių gydytojų spren-dimu ir pristatytos į mikrobiologijos laboratoriją įprasta Kauno klinikose nustatyta tvarka. Čia išsėtos pagal tiriamosios medžiagos pobūdį ant 5 proc. kraujo agaro („BBL“, JAV), Mac Conkey („Oxoid“, Didžioji Britanija) agaro ir / ar šokolado agaro („BBL“, JAV). Kolonijos, panašios į P. aeruginosa kolonijas, buvo išsėtos ant Pseudomonas Cetrimide agaro („Liofilchelm“, Italija), kuris slopina kitų bakterijų, taip pat ir kitų Pseudomonas rūšių, augimą. P. aeruginosa dėl gaminamo piocianino ir fluoresceino nudažo šią terpę mėlynai žaliu pigmentu. Atrinktos P. aeruginosa padermės galutinai
25
patvirtintos naudojant BD PhoenixTM ID automatinę mikrobiologinę sistemą
(„Becton Dickinson“, JAV).
3.2.2. Jautrumo antibiotikams nustatymas
P. aeruginosa padermių jautrumas antibiotikams buvo įvertintas pagal
nustatytas minimalias slopinamąsias koncentracijas. Paruošta iš trijų keturių 12–18 val. augintų kolonijų bakterijų suspensija buvo užsėta ant Muller-Hinton agaro („BBL“, JAV). Ant užsėto agaro buvo uždėtos E-testų juostelės, impregnuotos skirtingomis antibiotiko koncentracijomis („Liofilchelm“, Italija). Petri lėkštelės inkubuotos 35 °C temperatūroje. Po 18–24 val. vertin-tos mikroorganizmų augimą slopinančios koncentracijos. 2003 ir 2008 m. išskirtų padermių minimalios slopinamosios koncentracijos interpretuotos pagal CLSI rekomenduojamas lūžio taškų lenteles, o 2011 ir 2012 m. išskirtų padermių pagal EUCAST rekomenduojamas lūžio taškų lenteles (3.2.2.1 ir 3.2.2.2 lentelės) [192, 193]. Tyrimo metu buvo atsižvelgta į standartų rekomenduojamų lūžio taškų skirtumus. Rast skirtumai esminės įtakos tyrimo galutiniams tyrimo rezultatams neturėjo.
3.2.2.1 lentelė. Minimalios slopinamosios koncentracijos lūžio taškai pagal
CLSI Antibiotikas Koncentracija, µg/ml MSK, µg/ml Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu Piperacilinas / tazobaktamas 0,016–256 ≤ 8 12–24 > 32 Meropenemas 0,016–32 ≤ 4 6–12 >16 Imipenemas 0,016–32 ≤ 4 8 >16 Amikacinas 0,016–256 ≤ 16 32 > 64 Ciprofloksacinas 0,016–256 ≤ 1 2 >4
26
3.2.2.2 lentelė. Minimalios slopinamosios koncentracijos lūžio taškai pagal
EUCAST Antibiotikas Koncentracija, µg/ml MSK, µg/ml Jautru Vidutiniškai jautru Atsparu Piperacilinas 0,016–256 ≤ 16 – >16 Ceftazidimas 0,016–256 ≤ 8 – > 8 Meropenemas 0,002–32 ≤ 2 – > 8 Imipenemas 0,002–32 ≤ 4 – > 8 Gentamicinas 0,016–256 ≤ 4 – > 4 Amikacinas 0,016–256 ≤ 8 – > 16 Ciprofloksacinas 0,002–32 ≤ 0,5 – > 0,5 MSK – minimali slopinamoji koncentracija.
Siekiant užtikrinti tyrimo kokybę, jautrumo antibiotikams nustatymo metu buvo naudotas P. aeruginosa ATCC 27853 etaloninis štamas. Padermės, kurioms buvo nustatytas vidutinis jautrumas, buvo priskirtos atsparių grupei. Karbapenemams atsparių padermių grupei buvo priskirtos tos P. aeruginosa padermės, kai buvo nustatytas atsparumas nors vienam karbapenemui (mero-penemui arba imi(mero-penemui). Karbapenemams jautrių P. aeruginosa padermių grupei priskirtos tik to padermės, kurios buvo jautrios abiem tiriamiems karba-penemų grupės antibiotikams. Dauginiu atsparumu antibiotikams pasižymin-čioms padermėms buvo priskirtos tos P. aeruginosa padermės, kurios buvo atsparios bent vienam antibiotikui iš trijų ar daugiau skirtingų antibiotikų grupių [194]. Aukšto atsparumo lygio padermėms buvo priskirtos padermės, kurioms imipenemo ir meropenemo MSK buvo 32 µg/ml ir daugiau.
3.2.3. Pseudomonas aeruginosa O serogrupių nustatymas
P. aeruginosa padermių serogrupių nustatymo metodas aprašytas
Vit-kauskienės ir bendraautorių [32, 195]. P. aeruginosa padermių serogrupėms nustatyti naudoti serumai, turintys O grupės antigenų antikūnų („Bio-Rad“, Prancūzija). Serogrupės nustatytos taikant agliutinacijos metodą pagal gamin-tojo aprobuotą metodiką. Buvo naudojamas žymėjimas arabiškais skaitmeni-mis nuo O:1 iki O:16. 0,01 ml sterilia kilpele paimta per naktį auginta ant neselektyvaus agaro P. aeruginosa kolonija, ištirpinta steriliame fiziologinia-me tirpale, ir paruošta bakterijų suspensija. Vienas lašas specifinio O grupės serumo ir viena pilna bakterijų suspensijos kilpelė sumaišyta ant stiklelio ir vertinta įvykusi agliutinacija. Fiziologinis tirpalas be serumo naudotas kaip neigiama kontrolė. Jei bakterijų suspensijos agliutinacija su specifiniu serumu
27
įvyko per 1 minutę ir nebuvo agliutinacijos ant kontrolinio stiklelio, reakcija vertinta kaip teigiama. Jei agliutinacija įvyko po 1 min. arba bakterijų suspensija agliutinavo su daugiau nei 1 specifiniu serumu, tyrimas buvo pakartotas, prieš tai bakterijų suspensiją pakaitinus 121 °C temperatūroje 90 min. Rezultatų interpretacija pateikta 3.2.3.1 lentelėje.
3.2.3.1 lentelė. Agliutinacijos testo rezultatų vertinimas
Fiziologinio tirpalo ir
antigeno reakcija antigeno reakcija Antikūno ir Rezultatas
Spontaniška agliutinacija
neįvyko Aiški agliutinacija per 1 min. Teigiamas Spontaniška agliutinacija
neįvyko Nėra agliutinacijos per 1 min. Neigiamas Spontaniška agliutinacija
įvyko Agliutinacija nevertinama Abejotinas, kartojama pakaitinus bakterijų suspensiją 121 °C temperatūroje 90 min.
3.2.4. Bioplėvelių susidarymas
Bioplėvelių susidarymui nustatyti buvo naudotas mėgintuvėlių metodas, aprašytas Christensen ir bendraautorių [196, 197]. Viena arba dvi per naktį ant neselektyvaus agaro išaugusios P. aeruginosa kolonijos buvo perkeltos į triptozės sojos buljoną („EMAPOL“, Lenkija). Mėgintuvėliai inkubuoti termostate 37 °C temperatūroje 24 val. Po inkubacijos mėgintuvėliai buvo išplauti fosfatiniu buferiniu tirpalu PBP, pH 7 ir išdžiovinti kambario tempe-ratūroje. Išdžiūvus mėgintuvėliams, į juos įlašinta po 1–2 lašus 0,1 proc. metilvioletinių dažų. Mėgintuvėliai su dažais inkubuoti 20 min. kambario temperatūroje. Po inkubacijos dažai iš mėgintuvėlių buvo pašalinti, mėgin-tuvėliai išplauti dejonizuotu vandeniu. Mėginmėgin-tuvėliai džiovinti pasviroje pozi-cijoje kambario temperatūroje. Bioplėvelių susidarymas vertintas pagal susidariusios plėvelės dažymosi intensyvumą (3.2.4.1 lentelė, 3.2.4.1 pav.). Šis metodas buvo trigubinamas ir atliekamas su kiekviena paderme tris kartus.
3.2.4.1 lentelė. Mėgintuvėlio metodo rezultatų vertinimas
Dažymosi intensyvumas Rezultatas Galutinė interpretacija
Nėra matomos plėvelės Padermė nesudaro bioplėvelių Nesudaro bioplėvelių Matoma vidutinio
intensyvumo plėvelės linija Padermė silpnai sudaro bioplėveles Sudaro bioplėveles Matoma ryški bioplėvelės
28
3.2.4.1 pav. Bioplėvelių susidarymas naudojant mėgintuvėlių metodą: A – nesudaro bioplėvelių, B – silpnai sudaro bioplėveles,
C – gerai sudaro bioplėveles
3.2.5. Serumo baktericidinio poveikio tyrimas
P. aeruginosa padermių gebėjimo slopinti žmogaus kraujo serumo
bak-tericidinį poveikį tyrimas in vitro atliktas remiantis Vitkauskienės, Sahly ir bendraautorių anksčiau aprašytomis metodikomis [195, 198, 199]. 3–5 išaugintos ant 5 proc. kraujo ar Mac Conkey agaro P. aeruginosa kolonijos buvo perkeltos į 10 ml mėgintuvėlius su smegenų ir širdies buljonu. Mėgin-tuvėliai inkubuoti termostate 37ºC temperatūroje 12–14 val. Po inkubacijos 200 µl tiriamos bakterijų suspensijos perkelta į naujus 10 ml mėgintuvėlius su smegenų ir širdies buljonu ir inkubuota 3 val. 37 °C temperatūros vandens vonelėje kratant. Po inkubacijos išmatuotas mėgintuvėlių optinis tankis su logaritminėje augimo fazėje esančiomis bakterijomis, naudojant 578 nm bangą. Viršutinis mėgintuvėlių turinys su terpe nupiltas, o nuosėdos išplautos fosfatinio buferio tirpalu (pH 7,2), po to centrifuguojant 1800 ×g 10 minučių. Plovimo procedūra pakartota 3 kartus. Išplovus mėgintuvėlius, atsižvelgiant į išmatuotą optinį tankį, pagal standartinę kreivę apskaičiuoti reikiami skiedimai. Į kiekvieną mėgintuvėlį įdėtas toks 0,9 proc. NaCl kiekis, kad galutinė bakterijų koncentracija sudarytų 2 × 106/ml. Tolimesni tyrimo etapai buvo atliekami mikrotitravimo plokštelėje. 1 bakterijų kultūrai buvo naudojami 4 šulinėliai (t0, t1, t2, t3). Į kiekvieną šulinėlį įpilta po 75 µl
kraujo serumo. Naudotas žmonių serumas buvo sudarytas iš 100 sveikų donorų kraujo mišinio. 25 µl paruoštos bakterijų suspensijos buvo supiltos į visus tyrimo metu naudojamus plokštelės šulinėlius, pradedant nuo t3
šulinėlių. 100 µl iš t0 šulinėlių ir 25 µl iš pradinių mėgintuvėlių bakterijų
suspensija iš karto buvo išsėta į Petri lėkšteles su smegenų ir širdies agaru, kurios inkubuotos 37 °C temperatūros termostate. Tada mikrotitravimo plokštelė nedelsiant buvo įdėta į termostatą ir inkubuota 37 °C temperatū-roje, kas valandą paeiliui išsėjant iš t1, po to iš t2ir vėliausiai iš t3 šulinėlių
29
lėkštelės padėtos inkubuoti į 37 °C termostatą ir inkubuotos 12–14 val. Po inkubacijos suskaičiuotas Petri lėkštelėse išaugusių P. aeruginosa kolonijų skaičius ir įvertintas kolonijų augimo santykis pirminiame pasėlyje po 1 val., po 2 val. ir po 3 val. serumo poveikio. Bakterijų gebėjimas išlikti gyvybingoms veikiant žmogaus serumui vertintos 3 val. laikotarpiu ir suskirstytos į 6 lygius. P. aeruginosa padermės jautrios serumo baktericidi-niam poveikiui priskirtos 1–2 lygiui, vidutiniškai atsparios – 3–4 lygiui, atsparios 5–6 lygiui. Lygiai buvo skirstomi pagal bakterijų skaičiaus kitimus bėgant laikui, atsižvelgiant į pradinį bakterijų skaičių, kuris išaugo išsėjus bakterijų suspensiją iš t0 šulinėlio (3.2.5.1 lentelė).
3.2.5.1 lentelė. P. aeruginosa atsparumo baktericidiniam serumo poveikiui
tyrimo rezultatų vertinimo lentelė
Lygis Bakterijų kiekis
Po 1 val. Po 2 val. Po 3 val.
1 < 10 proc. pradinio
bakterijų kiekio < 10 proc. pradinio bakterijų kiekio < 0,1 proc. pradinio bakterijų kiekio 2 10–100 proc. pradinio
bakterijų kiekio 10–100 proc. pradinio bakterijų kiekio < 10 proc. pradinio bakterijų kiekio 3 > 100 proc. pradinio
bakterijų kiekio < 100 proc. pradinio bakterijų kiekio < 100 proc. pradinio bakterijų kiekio 4 > 100 proc. pradinio
bakterijų kiekio > 100 proc. pradinio bakterijų kiekio < 100 proc. 5 > 100 proc. pradinio
bakterijų kiekio > 100 proc. pradinio bakterijų kiekio > 100 proc., bet 3 val. laikotarpiu mažėja 6 > 100 proc. pradinio
bakterijų kiekio > 100 proc. pradinio bakterijų kiekio > 100 proc., bet 3 val. laikotarpiu didėja Pastaba. Padermės, kurių kolonijų augimas buvo tolygus > 10 ir < 100 po 1 val., po 2 val. ir po 3 val., buvo priskirtos 3 lygiui.
Kiekviena P. aeruginosa padermė buvo ištirta 3 kartus. P. aeruginosa padermės jautrumo ar atsparumo serumo baktericidiniam poveikiui lygis buvo nustatytas, jei visų 3 tyrimų rezultatai buvo vienodi. Galutiniams skaičiavimams atlikti visos padermės buvo suskirstytos į dvi grupes: jautrias baktericidiniam serumo poveikiui (1–4 lygis) ir atsparias (5–6 lygis).
3.2.6. Atsparumo karbapenemams mechanizmų nustatymas
Fenotipiniai atsparumo karbapenemams nustatymo metodai. 2003 m.,
2008 m. ir 2011 m. iš kvėpavimo takų išskirtų karbapenemams atsparių
P. aeruginosa padermių MBL gamyba buvo nustatoma fenotipiniu E-testų
skirtingo-30
mis imipenemo koncentracijomis, kitame – imipenemu su EDTA (AB „Biodisk“, Solna, Švedija arba „Liofilchelm“, Italija). Fenotipinis E-testų metodas buvo atliekamas ir interpretuojamas pagal CLSI rekomendacijas. Jeigu imipenemo / imipenemo – EDTA minimalios slopinamosios koncent-racijos santykis buvo ≥ 8, buvo vertinama, kad padermė yra potenciali MBL gamintoja.
Su 2011–2012 m. išskirtomis karbapenemams atspariomis P.
aerugino-sa padermėmis buvo atliekamas kloksacilino inhibicijos testas ir
modifikuo-tas „Hodge“ tesmodifikuo-tas. Kloksacilino inhibicijos testo atlikimo metodika yra aprašyta anksčiau [31]. Paruošta 0,5 McFarland tiriamųjų bakterijų suspen-sija buvo pasėta ant dviejų Miulerio-Hintono agaro lėkštelių, vienos iš jų sudėtyje buvo 500 mg/ml kloksacilino („Vademecum“, Ispanija). Tada ant užsėtų Petri lėkštelių buvo uždėti imipenemo (10 µg) ir ceftazidimo (30 µg) diskai. Lėkštelės inkubuotos 36 °C temperatūroje termostate 16–18 val. Rezultatų interpretacija pateikta 3.2.6.1 lentelėje.
3.2.6.1 lentelė. Kloksacilino inhibicijos testo rezultatų interpretacija
MH su kloksacilinu
Rezultatas Ceftazidimo zonos
diametras Imipenemo zonos diametras
Didesnis nei MH be kloksacilino
Didesnis nei MH be kloksacilino
AmpC gamyba ir OprD trūkumas Ne didesnė nei MH be kloksacilino Ne didesnis nei MH be kloksacilino Karbapenemazės gamyba Ne didesnė nei MH be kloksacilino Didesnis nei MH be kloksacilino ISBL gamyba MH – Miulerio-Hintono agaras, ISBL – išplėsto spektro beta laktamazės.
Taip pat paraleliai buvo atliekamas Modifikuotas Hodge testas, anksčiau aprašytas Mikučionytės, Lee, Giske ir bendraautorių [31, 200, 201]. Teste buvo naudojamos trys etaloninės padermės: E. coli ATCC 25922, kaip karbapenemams jautri padermė, P. aeruginosa ATCC 18524928.2 (neigiama kontrolė) ir Enterobacter cloacae 91419421 (gami-nanti blaVIM-1), kaip teigiama kontrolė. Ant Miulerio-Hintono agaro vatos
tamponėliu buvo užsėta per naktį augintos E. coli 0,5 McFarland bakterijų suspensija, tada ant pasėtos lėkštelės centre buvo uždėtas meropenemo diskas (10 µg, BD, JAV). Tiriamos kultūros kartu su kontrolinėmis kultūromis buvo sėjamos nuo meropenemo disko link išorinio lėkštelės krašto. Užsėtos Miulerio-Hintono lėkštelės buvo inkubuotos 36 °C tempera-tūroje termostate 18 val. Teigiamas rezultatas buvo vertinamas pagal
teigia-31
mą kontrolę – susiformavusią dobilo lapo formos augimo slopinimo zoną, nulemtą padidėjusio tiriamos kultūros augimo meropenemo disko link.
Genotipiniai atsparumo karbapenemams tyrimo metodai. Iš
karbapene-mams atsparių P. aeruginosa padermių buvo išskirta DNR. DNR išskyrimas buvo atliekamas naudojant DNeasy Tissue rinkinį („Qiagen“, Vokietija) pagal gamintojo rekomendacijas. Po to visoms padermėms buvo atlikta dau-ginė polimerazių grandininė reakcija (PGR), kurios taikinys buvo skirtingų rūšių karbapenemazes (blaNDM, blaKPC, blaOXA-48, blaVIM, blaIMP, blaGES) genai.
Dauginės PGR amplifikacijai atlikti buvo naudojamas MJ Research PTC-200 termocikleris („BioRad“, JAV), Taq DNA polimerazė („NEB“, Didžioji Britanija), kuri aprašyta anksčiau Doyle ir bendraautorių [209]. Norint nu-statyti A ir B klasės karbapenemazių tipus, buvo naudoti specifiniai blaIMP-1,
blaIMP-2, blaVIM-1, blaVIM-2, blaGES-5 pradmenys, parinkti pagal panaudotus
Gutierrez ir bendraautorių tyrime [210, 211]. ISBL genų molekulinė identi-fikacija buvo atlikta naudojant specifinius blaPER-1, blaVEB-1 pradmenis,
parinktus pagal anksčiau aprašytus Juan ir bendraautorių bei Strateva ir bendraautorių [212, 213]. PGR eiga aprašyta anksčiau [209]. Pradmenys padauginti (amplifikuoti) naudojant AmpiTaq Gold PCR Master mix rinkinį („Applied Biosystems at Life Technologies“, Hammonton, NJ). DNR įdėta į PGR reakcijos mišinį, susidedantį iš 200 µM koncentracijos dNTP, 0,5 µM kiekvieno pradmens, 3 proc. DMSO, 1,5 mM MgCl2 ir 2,5 vnt. Taq DNR
polimerazės. Ciklo sąlygos: 94 °C temperatūroje 12 min., po to 35 ciklai denatūracijos 94 °C temperatūroje 45 sek., pradmenų prisijungimas vyko 60 °C temperatūroje 45 sek., komplementarios DNR grandinės sintezė vyko 72 °C temperatūroje 10 min. blaPER-1 ir blaVEB-1 nustatymas vyko šiomis
sąlygomis: pirminė denatūracija 94 °C temperatūroje 10 min., po to ėjo 35 denatūracijos ciklai 94 °C temperatūroje 60 sek., pradmenų prijungimas vyko blaPER-1 60 °C ir blaVEB-1 62 °C temperatūroje 60 sek.,
komplementa-rios DNR grandinės sintezė vyko 72 °C temperatūroje 45 sek., ir baigiamoji sintezė 72 °C temperatūroje 10 min.
3.2.7. Paciento duomenų surinkimas
Surinkus P. aeruginosa padermes ir jas ištyrus, buvo renkami pacientų klinikiniai duomenys. Pacientų duomenys buvo renkami retrospektyviai, naudojant medicininę dokumentaciją – gydymo stacionare istorijas (forma Nr. 003/a). Duomenys buvo renkami pagal iš anksto parengtą anketą (1 priedas). Buvo vertinami pacientų lytis, amžius. Pagal amžių pacientai buvo suskirstyti į dvi grupes: <65 metų ir ≥65 metai. Skyriai, kuriame gulėjo pacientai, buvo priskirti vienam iš trijų profilių: terapiniam, chirurginiam, intensyviosios terapijos. Gretutinės ligos buvo: chirurginės
32
ligos, cukrinis diabetas, nudegimas, onkologinis procesas, trauma, širdies ir kraujagyslių ligos; nepriskirtos nė vienai iš šių ligų grupių sudarė kitų ligų grupę. Chirurginis gydymas, dirbtinė plaučių ventiliacija, gydymas antibio-tikais buvo vertinami tik hospitalizuojant, kai pacientui buvo išskirta tiriamoji P. aeruginosa padermė. Laboratorinių rodiklių dydis (leukocitų, neutrofilų skaičius bendrame kraujo tyrime, C reaktyvusis baltymas, leukocitų, baltymų kiekis šlapime) buvo vertintas pasėlio paėmimo dieną. Pneumonijos diagnozė buvo nustatoma gydančio gydytojo ir užfiksuota gydymo stacionare istorijoje. Jeigu nebuvo nustatyta radiologinių plaučių infiltracijos požymių, pneumonijos diagnozė buvo atmetama. Buvo atsi-žvelgta, kad pirmąsias 48 val. nuo ligos pradžios rentgenu nustatomų plau-čių infiltracijos požymių gali nebūti. Kvėpavimo, inkstų, kepenų funkcijos nepakankamumas buvo vertintas, jeigu buvo išsivystęs iki pasėlio, kuriame išskirta P. aeruginosa, paėmimo. Teigiamai vertinta, kad gydymas kore-guotas, kada po pasėlio buvo paskirti antipseudomoniniai antibiotikai pagal mikrobiologinio tyrimo rezultatus arba kai skiriami empiriškai antibiotikai veikė išskirtą P. aeruginosa.
3.2.8. Statistinė analizė
Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant duomenų kaupimo ir analizės SPSS 21.0 (Statistical Package for Social Science 21 for Windows) programų paketą.
Tiriamiesiems požymiams buvo taikomos šios aprašomosios statistikos: vidurkis, standartinis nuokrypis, mediana, kokybiniams tiriamiesiems – dažnis (n) ir išraiška procentais. Jei skirstinys tenkino normališkumo prielaidą, dviejų nepriklausomų grupių kiekybiniams dydžiams palyginti buvo taikomas Stjudento (t) kriterijus, o daugiau nei dviem grupėms paly-ginti – dispersinė analizė ANOVA. Kai kintamieji netenkino pasiskirstymo normališkumo sąlygos, buvo taikomi neparametriniai metodai – Man-Whitney U ir Kruskalio-Walliso. Kokybiniams duomenims analizuoti tai-kytas suderinamumo ir nepriklausomumo chi kvadrato (χ2) kriterijus.
33
4. REZULTATAI
4.1. Pseudomonas aeruginosa atsparumo antibiotikams dinamika 2003, 2008, 2011 metais
233 P. aeruginosa padermėms, išskirtoms iš apatinių kvėpavimo takų, buvo nustatytos minimalios slopinamosios imipenemo, meropenemo, piperacilino / tazobaktamo, amikacino, ciprofloksacino koncentracijos (4.1.1–4.1.5 pav.).
4.1.1 pav. P. aeruginosa jautrumo imipenemui lygmuo
(minimali slopinamoji koncentracija – MSK, µg/ml)
Imipenemo MSK P. aeruginosa padermėms ribos buvo nuo 0,38 iki ≥32 µg/ml. 63,1 proc. (N=147) padermių imipenemo MSK buvo žemiau jautrumo lūžio taško. 4 (1,71 proc.) padermių nustatyta vidutinio jautrumo MSK. Tiriamoms padermėms imipenemo MSK moda buvo 32 µg/ml, MSK90 ir buvo32 µg/ml. 87,8 proc. (N=72) padermių, kurioms buvo
nustatyta MSK virš atsparumo lūžio taško, rastas MSK buvo 32 ir daugiau µg/ml. Šios padermės pasižymėjo aukštu atsparumo lygiu.
34
4.1.2 pav. P. aeruginosa jautrumo meropenemui lygmuo (minimali
slopinamoji koncentracija – MSK, µg/ml)
Meropenemo MSK tiriamoms padermėms reikšmės išsidėstė nuo 0,013 µg/ml iki ≥32 µg/ml. 64 proc. (N=151) P. aeruginosa padermėms MSK buvo žemiau meropenemo atsparumo lūžio taško, t. y. buvo jautrios. Dažniausiai pasikartojanti MSK reikšmė – 32 µg/ml, MSK90 – 32 µg/ml.
80,4 proc. (N=45), kurių MSK virš atsparumo lūžio taško, buvo nustatyta MSK 32 µg/ml ir daugiau, tai rodo aukštą atsparumo meropenemui lygį.
4.1.3 pav. P. aeruginosa jautrumo piperacilinui / tazobaktamui lygmuo
35
Nustatytos piperacilino / tazobaktamo MSK buvo nuo 0,25 µg/ml iki ≥256 µg/ml. MSK90 buvo 7,6 µg/ml. 89,5 proc. (N=179) nustatytas MSK
buvo žemiau jautrumo lūžio taško. Dažniausiai pasikartojančios MSK reikš-mės – 1 µg/ml ir 1,5 µg/ml.
4.1.4 pav. P. aeruginosa jautrumo amikacinui lygmuo
(minimali slopinamoji koncentracija – MSK, µg/ml)
Amikacino MSK ribos nustatytos nuo 0,19 iki ≥ 256 µg/ml. Net 82,8 proc. (N=193) padermių MSK išsidėstė žemiau jautrumo amikacinui lūžio taško. 26 (11,2 proc.) padermių MSK buvo tarp jautrumo ir atsparumo amikacinui lūžio taškų, nustatytas vidutinis jų jautrumas amikacinui. Dažniausiai pasikartojanti MSK reikšmė – 4 µg/ml. 90 proc. nustatytų MSK reikšmės buvo 12 µg/ml, tilpo į jautrumo ir vidutinio jautrumo amikacinui ribas.
4.1.5 pav. P. aeruginosa jautrumo ciprofloksacinui lygmuo
