7.0 VALUTAZIONI FARMACODINAMICHE E FARMACOCINETICHE
I prelievi
Prelievi di sangue sono stati effettuati con provette contenenti eparina/EDTA per un totale di 15 ml (5 ml per i campioni di plasma, 10 ml per estrazione delle cellule mononucleate circolanti del sangue periferico) al 1° giorno (pre-trattamento), al 28°, 56°, 84°, 112°, 140° e 166° giorno dopo l’inizio della terapia.
Analisi Elisa
I campioni di plasma sono stati conservati a -70°C in doppia aliquota e successivamente sono stati analizzati tramite dosaggio immuno-enzimatico per la concentrazione totale di TSP-1 umana (ChemiKine TM , cat. n. CYT168, chemicon International, Temecula, CA, USA), VEFG umano (Quintikine, cat. n. DVE00, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) e sVEGFR-2 umano (Quantikine, cat. n. DVR200, R&D Systems, Minneapolis). Le procedure sperimentali sono state quelle indicate dalle istruzioni allegate ai kit sopracitati, standardizzate e validate dall’azienda produttrice. La densità ottica è stata determinata utilizzando un lettore di micropiastre predisposto alla lunghezza d’onda di 490 nm per TSP-1 e 450 nm per VEGF e sVEGFR-2 (con una lunghezza d’onda di correzione di 540 nm). I risultati sono stati espressi in ng di TSP-1 /ml di plasma o pg di VEGF o VEGFR-2 /ml di plasma e potranno essere normalizzati o meno per i valori di PSA.
Analisi di espressione e sintesi di fattori pro/anti-angiogenici in cellule mononucleate I monociti circolanti del sangue periferico sono stati isolati come pubblicato in precedenza (53-54) e qui descritto brevemente come segue. I campioni di sangue sono stati diluiti in rapporto di 1:1 con tampone fosfato a pH 7.4. La soluzione è stata stratificata sopra il Lymphosep™, un mezzo isosmotico a bassa viscosità contenente sodio metrizoato. Il campione così processato è stato centrifugato a 1500 rpm per 45 minuti; al termine della centrifugazione i linfociti presenti in uno strato posto all’interfaccia plasma-Lymphosep™, sono stati raccolti e posti in provette alle quali è stato aggiunto tampone fosfato in eguale volume e nuovamente centrifugati per ottenere un pellet di linfociti. Le cellule sono state immediatamente poste in azoto liquido e conservate in appositi criotubi a -70 °C. Sono stati quindi utilizzati per l’analisi della espressione genica dell’inibitore
endogeno dell’angiogenesi TSP-1 e del fattore di crescita pro-angiogenico VEGF. L’RNA totale è stato estratto ed isolato utilizzando il kit Trizol (Gibco, USA). Successivamente è stata effettuata l’analisi PCR quantitativa “real time” usando l’ABI PRISM 7900HT Sequenze Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) con “primers” per TSP-1 umana e VEGF umano disponibili commercialmente (Applied biosystems).
Analisi farmacocinetica
Per investigare il potenziale effetto sulla farmacocinetica di FT, uracile e 5-FU (uno dei metaboliti attivi di UFT) durante la co-somministrazione prolungata con CTX metronomica, una analisi farmacocinetica è stata effettuata dopo la singola dose orale mattutina di UFT (10 a.m.) al giorno 1, 28 e al 56.
I campioni di sangue. I campioni di sangue venoso (2 ml) sono stati prelevati da una cannula e.v. al tempo 0 (prima della somministrazione del UFT) e ai tempi 0.5, 1, 1.5, 2, 3 e 5 ore dopo la somministrazione del farmaco (per un totale di 12 ml). Al giorno 1°, 28° e al girono 56° il prelievo ematico totale è stato di 27ml.
L’analisi farmacocinetica del 5-FU e del suo principale metabolita (5-FDHU), uracile e FT è stata condotta come già precedentemente descritto. Brevemente, i campioni plasmatici sono stati mantenuti a -70°C fino al momento dell’esecuzione dell’analisi, sono stati quindi aggiunti 25 µl di sodio acetato (1 M, pH 4.8), 0.2 g/ml di sodio solfato anidro e 1 µg/ml di 5-bromouracile come standard interno, e successivamente estratti con 7 ml di n-propanolo/dietil etere (1:9, v:v). Dopo aver mescolato la soluzione per 15 minuti, i campioni sono stati centrifugati a 4000 rpm per 10 min e la fase organica sé stata separata ed evaporata fino a portarla a secco sotto flusso di azoto. Infine i campioni sono stati ricostituiti con 250 µl di fase mobile per essere dosati con metodica HPLC (High Performance Liquid Chromatography; colonna, µBondapack C18; fase mobile, KH2PO4 50 mM, pH 4.0) con il sistema LC Module I Plus (Waters, Milford, MA, USA) equipaggiato con un detector UV (lunghezza d’onda fissa 200 nm). I principali parametri farmacocinetici (es. area under curve, AUC, emivita di eliminazione, clearance total body, CLTB, concentrazione allo stato stazionario, Css e volume di distribuzione allo stato stazionario, Vdss) sono stati calcolati con il software WinNonlin (Pharsight, USA).
