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1.1 Xenopus laevis come organismo modello 2

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Academic year: 2021

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Riassunto

Abstract

1 Introduzione 1

1.1 Xenopus laevis come organismo modello 2

1.2 Origine e sviluppo della linea germinale nei Metazoi 4

1.3 Sviluppo delle gonadi nei Vertebrati 8

1.3.1 Ovogenesi in Xenopus laevis 11

1.4 Sviluppo dell'occhio nei Vertebrati 15

1.4.1 Cristallino e cornea 17

1.5 Sviluppo della notocorda in Xenopus laevis 19

1.6 Il gene Pumilio 22

1.7 Scopo della tesi 30

2 Materiali e metodi 31

Prima parte 32

2.1 Strumenti di analisi bioinformatica 33

2.1.1 Il software Blast 34

2.1.2 Allineamenti multili di sequenza 36

Seconda parte 38

2.2 Estrazione dell’RNA totale da embrioni e tessuti di Xenopus laevis 39

2.3 RT-PCR 39

2.3.1Retrotrascrizione 39

2.4 PCR 40

2.5Elettroforesi su "gel" d'agarosio 42

2.6 Trasformazione 44

2.7 Digestione di plasmidi con enzimi di restrizione 45

2.8 Purificazione del DNA 46

(2)

2.8.1Estrazione fenolica 46

2.8.2 Precipitazione alcolica 46

2.9 Preparazione della sonda per esperimenti di ibridazione 47

2.10 Fissazione degli embrioni 48

2.11 Ibridazione in situ “whole mount” 48

2.11.1 Procedura di ibridazione 49

2.12 Depigmentazione (bleaching) 53

2.13 Inclusione degli embrioni in paraffina 53

2.14 Sezione di embrioni 54

2.15 Inclusione delle gondi in tissue-teck 55

2.15.1 Sezioni di gonadi al criostato 55

2.16 Ibridazione in situ su sezione di gonadi tagliate al criostato 55

2.17 Immunofluorescenza con anticorpo anti istone H3 fosforilato

(UPSTATE BIOTHECNOLOGY) 57

2.18 Fotografie 58

3 Risultati 59

Prima parte: Analisi della sequenza 60

3.1Analisi “bioinformatica” della sequenza del clone J18 XPum2 61

3.1.1Sequenza del clone EST J18 (XPum2) 61

Seconda parte: analisi di espressione genica 68

3.2 Analisi dell’espressione del gene XPum2 69

3.2.1Ibridazioni su sezioni di gonadi di girini neometamorfosati di Xenopus

laevis tagliate al criostato 69

3.2.2 Analisi dell’espressione del gene XPum2 durante l’embriogenesi di

Xenopus 73

3.3Uso di Xpat come marcatore specifico della linea germinale di Xenopus 80

4 Discussione 82

4.1 La sequenza del gene XPum2 83

4.2 Analisi dell’espressione di XPum2 84

4.2.1 Studio dell’espressione durante l’ovogenesi di Xenopus 84

(3)

4.2.2 Studio dell’espressione durante l’embriogenesi di Xenopus 85

4.3 Prospettive future 86

Bibliografia 87

Ringraziamenti

Riferimenti

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