3.1 Risultati e discussione

3.1 Risultati e discussione

L’adenosina è un nucleoside purinico ubiquitario, formato da adenina e D (-) ribosio, che svolge la sua azione legandosi ai sottotipi recettoriali A1, A2A, A2B e A3; tali recettori appartengono alla superfamiglia dei recettori accoppiati alle proteine G, costituiti da 7 domini transmembrana ad α-elica.

I recettori A1 e A3 interagiscono con le proteine Gi e Gq provocando l’inibizione dell’adenilato ciclasi e modulando i livelli intracellulari di calcio, mentre i sottotipi A2A e A2B interagiscono prevalentemente con la proteina Gs provocando la modulazione dei livelli di cAMP.

Data l’elevata espressione di tali recettori, sia a livello centrale che periferico, e l’implicazione di tali proteine nell’eziopatogenesi di svariate patologie umane, la ricerca si è notevolmente incentrata verso lo sviluppo e la sintesi di nuovi ligandi affini e selettivi per i diversi sottotipi recettoriali al fine di identificare nuovi potenziali agenti terapeutici. In particolare, ligandi antagonisti selettivi per il sottotipo recettoriale A3, troverebbero impiego nel trattamento dell’asma, di patologie neurodegenerative, nelle situazioni di stress cellulare, come l’ipossia cardiaca o cerebrale, ma anche come agenti citostatici nel caso di tumori gliali.

Un certo numero di composti eterociclici sono stati identificati come promettenti per lo sviluppo di antagonisti per il recettore A3, mostrando diversi livelli di potenza e selettività.

Il MODELLO MOLECOLARE base dei recettori adenosinici prevede l’esistenza, all’interno del recettore, di diversi punti di ancoraggio, quali: tre aree lipofile denominate L1, L2, L3; una zona planare che accoglie l’anello purinico; quattro siti idrofili, probabilmente quattro residui di istidina, capaci di accettare i protoni del ligando.

I requisiti fondamentali, che un ligando deve avere per risultare antagonista dei recettori adenosinici, sono:

• Presenza di strutture planari • Presenza di sistemi aromatici

• Presenza di sistemi eterociclici azotati • Presenza di sostituenti idrofobi

• Assenza di ribosio

I prodotti testati in questa tesi, appartengono alla serie, dei derivati 2-metil 6-fenil-pirazolo[3,4-d] pirimidinici, sintetizzati nel laboratorio ,del Professor Da Settimo del Dipartimento di Scienze Farmaceutiche dell’Università di Pisa, sviluppati al fine di ottenere antagonisti A3 altamente potenti e selettivi.

I composti saggiati sono stati sintetizzati facendo riferimento al nucleo pirazolo

pirimidinico; essi rispettano i requisiti necessari ad un profilo antagonista sui recettori

adenosinici, quali un anello etero aromatico contenente atomi di azoto, fuso con un anello azolico a 5 termini, e l’ assenza del ribosio .

Recentemente, infatti, in letteratura sono stati riportati come antagonisti dei recettori adenosinici un largo numero di ligandi aventi nucleo pirazolo-pirimidinico, sostituito in posizione N1 (generalmente con un anello fenilico): la sostituzione in tale posizione del nucleo comporta alta affinità nei confronti dei recettori A1 o A2A.

Sulla base di tali dati, e al fine di ottenere antagonisti A3 altamente potenti e selettivi, sono state apportate alcune modifiche alla struttura di base, ottenendo così la classe di derivati 2-metil 6-fenil-pirazolo[3,4-d] pirimidinici.

N

N N

NH NH2

nucleo pirazolo-pirimidinico

Il sostituente in posizione 2 è rappresentato da un gruppo metilico, poiche è stato visto che esso incrementa l’affinità nei confronti del recettore A3 .rispetto a gruppi più ingombranti, come quello benzilico o fenil-etilico.

I sostituenti sull’N4 esociclico sono stati scelti tenendo conto dei dati riportati in letteratura sul ruolo chiave della catena NH-acilica nel legame ai recettori A3.

N N N N CH₃ HN R Composto R1 R2 Ki o % I su A1 umano Ki o % I su A2a umano Ki o % I su A3 umano LUC 1177 CH3 COC6H5 334 ± 32 728.1± 70.3 0.6 ± 0.1 LUC 1178 CH3 CONHC6H4 -4-OCH3 > 10000 > 10000 357.9 ± 35.8 LUC 1188 CH3 H 584.7±57 > 10000 922±19 LUC 1189 CH3 COC6H4-3-Cl 1081.6±110 886±42 5.93 ± 0.9 LUC 1190 CH3 COC6H4 -4-OCH3 1037 ± 105 3179±315 0.18 ± 0.02 LUC 1191 CH3 CONHC6H5 > 10000 > 10000 20.94 ± 1.2 LUC 1192 CH3 CONHC6H4 -3-Cl > 10000 > 10000 29.1 ± 2.4

TABELLA 1 Valori di affinità ai sottotipi recettoriali dell’adenosina A1, A2A, A2B e

A3

Il composto LUC1188, l’unico derivato non sostituito sull’N4 esociclico, mostra una affinità modesta verso il recettore A3 ( Ki = 922±19 nM) e scarsa selettività, dato che il valore di Ki per il recettore A1 è paragonabile.

L’introduzione di un gruppo fenilcarbamoilico (LUC1191) nella stessa posizione comporta un forte aumento dell’affinità, con una Ki (A3) pari a 20.94 nM, e nessuna capacità di legame sui recettori A1 e A2A.

Se lo stesso gruppo fenilcarbamoilico viene sostituito in posizione meta con un cloro (LUC1192) non si hanno significative variazioni in termini di potenza e selettività; al contrario, inserendo in posizione para un metossile (LUC1178) l’affinità si riduce notevolmente (Ki su A3 = 357.9 nM)

L’introduzione di un gruppo benzoilico sull’N4 esociclico comporta un incremento significativo di potenza e selettività per il recettore A3. Il LUC1189, ad esempio, sostituito con l’alogeno in posizione meta (R = COC6H4-3-Cl), mostra una Ki su A3 pari a 5.93 nM, con un legame nei confronti dei recettori A1 e A2A circa 200 volte inferiore.

Un risultato migliore si è ottenuto introducendo sul gruppo amminico in posizione 4 del nucleo pirazolo-pirimidinico un gruppo benzoilico non sostituito (LUC1177): l’affinità nei confronti del recettore A3 è nell’ordine del subnanomolare (Ki = 0.6nM), con una selettività nei confronti dei recettori A1 e A2A di circa 50-100 volte.

Fino a questo momento il derivato più promettente è dato dal LUC1190, che presenta un sostituente 4'-metossibenzoil amminico; esso ha mostrato infatti alta affinità per il sottotipo recettoriale A3 (Ki 0,18 nM), insieme con elevata selettività (i valori di affinità nei confronti dei recettori A1 e A2A sono risultati di 1037 nM e 3179 nM, rispettivamente).

Per questi due derivati, risultati i più affini e selettivi della serie, è stato determinato il profilo farmacologico sui sottotipi A3 e A2B, utilizzando il saggio dell’adenilato ciclasi, in cui si valuta l’effetto inibitorio dei composti, sulla produzione di cAMP.

Come descritto nel paragrafo 2.10, tale saggio prevede, in breve, la semina di circa 60.000 cellule in pozzetti contenuti in multiwell da 24. Le cellule vengono trattate con l’agonista adenosinico di riferimento NECA, in assenza e in presenza del composto da saggiare a diverse concentrazioni.

Poichè il recettore adenosinico A3 è accoppiato a proteine Gi, per evidenziare l’ inibizione della produzione di cAMP da parte di un agonista, l’enzima adenilato ciclasi viene stimolato con un attivatore aspecifico, quale la Forskolina 10 µM; il composto in esame avrà quindi un profilo antagonista nei confronti di tali recettori se sarà in grado di contrastare l’azione della NECA, ovvero la diminuzione della produzione di cAMP mediata dall’ agonista.

Il profilo antagonistico sui recettori A2B adenosinici, essendo accoppiati a Gs , è valutato andando a misurare la loro capacità di inibire l’accumulo di cAMP, prodotto dall’ agonista NECA 100 nM. Dal momento che non esiste radioligando per quest’ ultimi recettori, questo è l’ unico saggio che ci permette di valutarne l’ attività di un dato composto nei confronti del recettore A2B.

Il LUC1177 e il LUC1190 non sono risultati capaci di modulare di per sé i livelli di cAMP, ma hanno mostrato la capacità di antagonizzare l’effetto di inibizione dell’adenilato ciclasi dato dall’agonista adenosinico NECA, mostrando, pertanto, un profilo antagonista nei confronti del recettore A3, con valori di IC50 rispettivamente, pari a 2.35 ± 0.20 e 1.85 ± 0.15 nM. -11.5 -10.5 -9.5 -8.5 -7.5 -6.5 25 50 75 100

cAMP su A3 CHO

-11.5 -10.5 -9.5 -8.5 -7.5 -6.5 0 25 50 75 100 LUC1190 vs NECA 100nM IC50= 1.85± 0.15 nM

cAMP su A3 CHO

Anche sul recettore A2B, sia il LUC1177 che il LUC1190 non sono risultati capaci di modulare di per sé i livelli di cAMP, ma hanno mostrato la capacità di antagonizzare l’effetto di stimolazione dell’adenilato ciclasi dato dalla NECA, mostrando, pertanto, un profilo antagonista anche nei confronti del recettore A2B, con valori di IC50 rispettivamente, pari a 53.9 ± 5.9 e 49.8 ± 2.8 nM

LUC 1177 su A

Per i due derivati più attivi della serie è stata infine valutata l’ attività farmacologica indagando il loro effetto sulla proliferazione di cellule tumorali U-87MG di glioblastoma umano. Come già detto, gli antagonisti A3 troverebbero impiego nel trattamento di alcuni tipi di tumori, come i gliomi; secondo quanto riportato recentemente in letteratura, infatti, l’adenosina è presente a livelli significativi nel liquido extracellulare di tumori solidi e proprio tramite recettori A3, iper-espressi nei tumori; in particolare l’adenosina sembra avere un ruolo importante nella crescita di tumori. Tali dati suggeriscono, pertanto, che il recettore A3 può rappresentare un utile marker tumorale.

L’effetto sulla proliferazione cellulare è stato valutato, in vitro, utilizzando la metodica del Trypan Blue: tale colorante, come descritto nel paragrafo 2.11, è in grado di permeare attraverso la membrana cellulare danneggiata delle cellule morte, conferendo loro la caratteristica colorazione; le cellule vive, al contrario, avendo membrana integra, rimangono inalterate al microscopio.

LUC 1190 su hA

Per l’esecuzione del saggio, vengono seminate e lasciate aderire, in pozzetti di multiwell da 24, circa 5.000 cellule di glioblastoma umano per pozzetto. Le cellule vengono bloccate in fase G1 tramite riduzione della percentuale di FBS (dal 10% allo 0.5%). Le cellule vengono trattate con l’agonista A3 Cl IB-MECA in assenza o in presenza dei composti da saggiare. Dopo 48 h, viene fatta una conta delle cellule totali (vive e morte) utilizzando il saggio del Trypan blue.

In cellule U87MG l’agonista A3 Cl-IB-MECA è stato in grado di stimolare la proliferazione cellulare mostrando un aumento delle cellule vive significativamente superiore al controllo (in media del 135%).

Il co-trattamento dell’agonista A3 con LUC1177 o con LUC1190 ha bloccato, in modo concentrazione-dipendente, l'effetto stimolatorio sulla proliferazione dato dalla Cl IB-MECA, riportando i valori verso il controllo.

-12 -10 -8 100 110 120 130 140 150

LUC1177

-14 -12 -10 -8 100 110 120 130 140 150

_LUC1190

In conclusione possiamo dire che i derivati LUC1177 e LUC1190 sono risultati essere antagonisti selettivi e potenti del sottotipo A3; essi hanno inoltre dimostrato un effetto di inibizione della crescita di cellule gliali, suggerendone il possibile utilizzo nell'intervento farmacologico verso i tumori gliali.

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