DX MTB ASSAY. 1 x Rilevamento diretto e predifferenziazione del complesso Mycobacterium tuberculosis tramite PCR Real-Time.

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DX MTB ASSAY

1 x 96 37000

Rilevamento diretto e predifferenziazione del complesso Mycobacterium tuberculosis tramite PCR Real-Time

883680 - 2013/12

Indice

1. Uso previsto

2. Sintesi e spiegazione del test 3. Principi della procedura 4. Reagenti

5. Avvertimenti e precauzioni 6. Campioni

7. Procedura

8. Limitazioni del test

9. Caratteristiche delle prestazioni 10. Riferimenti bibliografici

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2 1. USO PREVISTO

Dx MTB Assay è un kit qualitativo per l’amplificazione multiplex di acidi nucleici in vitro che consente la determinazione diretta in una sola provetta del complesso Mycobacterium tuberculosis e la differenziazione delle specie di tale complesso in 2 gruppi:

[M. tuberculosis + M. canettii] e [M. bovis + M. africanum + M. microti + M. pinnipedii + M. caprae].

Il dosaggio Dx MTB Assay è indicato per l'utilizzo di campioni respiratori liquefatti, decontaminati e concentrati, e di aspirati gastrici.

2. RIEPILOGO E ILLUSTRAZIONE DEL TEST

La tubercolosi, da cui è affetto un terzo della popolazione mondiale, rappresenta la malattia infettiva più letale del pianeta, provocando 2 milioni di decessi ogni anno e oltre 8 milioni di nuovi casi (1). L'agente patogeno è il complesso Mycobacterium tuberculosis (MTC), che comprende le specie micobatteriche M. tuberculosis, M. canettii, M. bovis, M. africanum, M. microti, M.

pinnipedii e M. caprae. Tra questi sette appartenenti al complesso, il M. tuberculosis è il più frequente negli esseri umani, mentre il M. bovis è intrinsecamente resistente al farmaco pirazinamide.

Dato l'elevato potere infettivo del complesso Mycobacterium tuberculosis e la relativa incidenza in aumento dovuta prevalentemente alla pandemia dell'HIV, la diagnosi precoce è estremamente importante al fine di arrestare la diffusione della malattia. Attualmente, l'identificazione rapida di soggetti potenzialmente infettivi dipende dal rilevamento di bacilli acido resistenti (AFB) in strisci ottenuti da campioni respiratori; questa tecnica, tuttavia vanta scarsa sensibilità e manca di specificità.

La tecnica "gold standard", coltura di micobatteri, richiede diverse settimane per l'elaborazione del risultato. I test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT) non hanno questi svantaggi : sono sensibili, specifici, e consentono la determinazione diretta dei micobatteri in diversi campioni.

3. PRINCIPI DELLA PROCEDURA

Il dosaggio Dx MTB Assay comprende due fasi principali: preparazione e amplificazione del campione/rilevamento di DNA target tramite PCR real-time. I prodotti di amplificazione sono rilevati tramite coloranti fluorescenti durante la PCR.

Per ogni campione, un Controllo Interno viene estratto, amplificato e letto in modo sistematico allo stesso modo del DNA target, consentendo il controllo della procedura di estrazione e il rilevamento dell'inibizione potenziale della PCR.

Nel dosaggio Dx MTB Assay, il DNA degli appartenenti al complesso Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis, M. canettii, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. pinnipedii e M. caprae), se presente, viene amplificato. Il rilevamento concomitante consente la differenziazione di 2 gruppi all'interno di tale complesso: (1) M. tuberculosis + M. canettii e (2) M. bovis + M.

africanum + M. microti+ M. pinnipedii + M. caprae.

Il kit contiene tutti i reagenti necessari per eseguire sia la preparazione del campione che l'amplificazione/il rilevamento per 96 test.

Preparazione del campione

Prima dell'avvio del test, i campioni respiratori e gli aspirati gastrici devono essere preparati per la digestione/decontaminazione mediante il metodo NALC-NaOH (2).

L'estrazione del DNA viene eseguita su campioni respiratori e su aspirati gastrici decontaminati e digeriti utilizzando il buffer di lisi (L1) in dotazione nel kit (metodo Chelex Bio-Rad).

Un Controllo Negativo viene durante l'intera procedura di preparazione del campione insieme ai campioni.

Il Controllo Interno (C1) viene aggiunto a ciascun campione e al controllo negativo all'inizio della procedura di preparazione del campione.

Amplificazione/rilevamento nella PCR real-time

Nella PCR real-time, vengono utilizzate specifiche sonde oligonucleotidiche fluorescenti per rilevare il DNA durante l'amplificazione, tramite ibridazione degli amplicon. Nel dosaggio Dx MTB Assay, vengono utilizzate tre differenti sonde oligonucleotidiche:

• Sonda di rilevamento IS6110 (rilevamento di tutti gli appartenenti al complesso M. tuberculosis).

• Sonda di rilevamento RD9 (specifica per le specie M. tuberculosis e M. canettii).

• Sonda di rilevamento del Controllo Interno

In assenza di DNA target per una determinata sonda oligonucleotidica, la relativa fluorescenza non verrà emessa poiché non sarà rilevato alcun segnale. Quando il DNA target è presente, l'intensità della fluorescenza aumenta con l'aumentare della quantità di amplicone ad ogni ciclo di amplificazione. Durante ogni ciclo PCR, nella fase di appaiamento, il sistema ottico a navetta dello strumento Dx Real-Time System misura la fluorescenza emessa da ciascun fluoroforo e il software associato Dx Real-Time Software rileva l'intensità della fluorescenza rispetto al numero di cicli. Al termine dell'esperimento, il software Dx Real-Time Software analizza in modo automatico i risultati per tutti i campioni e controlli.

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3 4. REAGENTI

4.1 Descrizione

Il kit contiene reagenti e materiali di consumo sufficienti per eseguire 96 test. Tutti i reagenti sono indicati unicamente per uso diagnostico in vitro.

Etichetta Natura dei reagenti Presentazione

L1 Lysis buffer

Buffer di lisi: Resina Chelex in un buffer di lisi. Conservante: 0,03

% ProClin™ 300. Ogni bottiglia contiene una barra magnetica di agitazione.

2 x 21 ml Pronto all'uso

R1 Amplification mix

Miscela concentrata di amplificazione, 10X: DNA polimerasi in un buffer PCR contenente primer, sonde oligonucleotidiche fluorescenti specifiche, dNTP e MgCl2. Conservante: 0,03 % ProClin™ 300

4 x 70 μl Da diluire con l'aggiunta di R2 R2 Amplification mix

diluent

Diluente per miscela di amplificazione: Buffer PCR che contiene MgCl2. Conservante: 0,03 % ProClin™ 300.

4 x 370 μl Pronto all'uso C1 Internal control Controllo Interno: DNA non infettivo in una soluzione tampone.

Conservante: 0,03 % ProClin™ 300.

2 x 550 μl Pronto all'uso C2 Negative control Controllo negativo: Tampone fosfato.

Conservante: 0,03 % ProClin™ 300. 2 x 1 ml

Pronto all'uso

C3 Positive control

Controllo positivo: DNA non infettivo da M. tuberculosis in una soluzione tampone. Colore giallo. Conservante: 0,03 % ProClin™

300.

1 x 100 µl Pronto all'uso

Dx 24-Well PCR Strips Termopiastre: micropiastre bianche da 24 pozzetti, dotate di codici

a barre per la singola identificazione. 8

Dx 8-Cap Strips Tappi in strip: strip a 8 tappi per termopiastre. 12

4.2 Requisiti di conservazione e trattamento Questo kit deve essere conservato a +2-8°C.

Se conservato nell'intervallo di temperatura sopraindicato, ogni reagente contenuto nel dosaggio Dx MTB Assay potrà essere utilizzato fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta del reagente stesso.

Identificazione Conservazione dopo l'apertura

L1, C1, C2, C3 6 mesi a 2-8° C. Se si verifica una contaminazione nel reagente, eliminarlo.

R1+R2 (miscela ricostituita) 1,5 ore a 18-30°C oppure 16 ore a 2-8°C oppure 2 settimane a - 20°C. Se congelata, la miscela ricostituita può essere scongelata una volta soltanto.

L1 + C1 (miscela ricostituita) 2 settimane a 2-8° C. Se si verifica una contaminazione nel reagente, eliminarlo.

5. AVVERTIMENTI E PRECAUZIONI

Esclusivamente per uso diagnostico in vitro. Per uso professionale.

5.1. Norme per la salute e la sicurezza

 Questo kit di test deve essere utilizzato esclusivamente da personale adeguatamente addestrato e qualificato nelle procedure di laboratorio e cosciente dei potenziali rischi connessi. Indossare abbigliamento protettivo, guanti e protezioni per occhi/viso adeguati e manipolare gli oggetti in maniera appropriata nel rispetto della buona pratica di laboratorio.

 Lavare con cura le mani dopo aver manipolato reagenti e campioni. Non mangiare, bere o fumare nelle zone di lavoro designate.

 Trattare tutti i campioni come potenzialmente infetti nel rispetto della buona pratica di laboratorio.

 Evitare la fuoriuscita dei campioni o delle soluzioni che li contengono. I versamenti devono essere sciacquati con candeggina diluita al 10%. Il materiale utilizzato per la pulizia deve essere smaltito in un contenitore per residui contaminati.

 Procedere allo smaltimento di tutti i campioni e i materiali utilizzati per l'esecuzione del test come potenzialmente infetti. I rifiuti di laboratorio, chimici o a rischio biologico, devono essere manipolati e smaltiti nel rispetto di tutte le normative locali, regionali e nazionali.

 La scheda di sicurezza è disponibile su richiesta presso il proprio rappresentante locale Bio-Rad.

5.2. Precauzioni relative alla procedura

5.2.1. Preparazione

 Non scambiare, mischiare o combinare reagenti appartenenti a kit con numeri di lotto differenti.

 Non utilizzare reagenti scaduti.

 Utilizzare microprovette e puntali con filtro privi di DNase e RNase.

 Verificare l'esattezza e il corretto funzionamento di pipette e altre apparecchiature.

 Le superfici di lavoro, le pipette e le altre apparecchiature devono essere decontaminate regolarmente con candeggina diluita all'1%.

 Aree di lavoro: all'interno del laboratorio, due aree dedicate devono essere utilizzate in modo unidirezionale per eseguire le fasi di preparazione e di amplificazione/rilevamento del campione:

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4 1. L'area di pre-amplificazione è riservata a: (a) la preparazione di campioni e controlli e (b) l'organizzazione della PCR (pipettaggio di miscela di amplificazione, controlli e campioni nelle strisce Dx 24-Well PCR Strips). Queste due fasi devono essere svolte in due zone distinte dell'area di pre-amplificazione.

2. L'area di amplificazione è dedicata alla reazione PCR real-time. Tutti i reagenti, le apparecchiature e i camici da laboratorio utilizzati all'interno di un'area devono rimanere in questa area e non entrare mai nell'altra area. Mai trasferire i prodotti di amplificazione o le attrezzature dell'area di amplificazione nell'area di pre-amplificazione.

5.2.2. Elaborazione

 Questo kit è stato validato esclusivamente per l'utilizzo con lo strumento Dx Real-Time System (Bio-Rad) e il relativo software Dx Real-Time Software .

 Non modificare la procedura di dosaggio.

 Prestare la massima attenzione al fine di evitare contaminazioni crociate durante le fasi di trattamento del campione:

assicurarsi che i contenitori dei campioni non entrino in contatto tra loro; se i guanti entrano in contatto con il campione, sostituirli immediatamente.

 Utilizzare un nuovo puntale con filtro per ciascun campione.

 Ricostituire con cura la miscela di amplificazione evitando qualsiasi contaminazione.

6. CAMPIONI

Il dosaggio Dx MTB Assay Bio-Rad è indicato per l'utilizzo con campioni respiratori (escreati indotti o espettorati, lavaggio broncoalveolare, lavaggi bronchiali e altri campioni respiratori), e con aspirati gastrici. I campioni devono essere raccolti e trasportati in base alla buona pratica di laboratorio.

Prima di eseguire l'estrazione del DNA, i campioni respiratori e gli aspirati gastrici devono essere preparati per la digestione/decontaminazione con NALC-NaOH.

I campioni decontaminati devono essere trasportati in laboratorio nel rispetto delle raccomandazioni vigenti (4).

I campioni decontaminati possono essere conservati a 2-8°C per 7 giorni. Per la conservazione a lungo termine, i campioni decontaminati devono essere congelati (a una temperatura non superiore a -20°C). Non utilizzare i campioni decontaminati congelati se sono stati sottoposti a più di 3 cicli di congelamento e scongelamento.

7. PROCEDURA 7.1. Materiali necessari

7.1.1. Materiali forniti

• Dosaggio Dx MTB Assay (Bio-Rad, cat. # 37000) 7.1.2. Materiali necessari forniti a parte

• Strumento Dx Real-Time System, software Dx Real-Time Software, PC e accessori (Bio-Rad, confezione cat.# 94000)

• Strumento Dx Strip Cap Tool (fornito nella confezione dello strumento Dx Real-Time System Bio-Rad cat.#94000) 7.1.3. Materiali necessari ma non forniti

• Centrifuga da tavolo per termopiastre PCR

• Centrifuga da tavolo per microprovette da 1,5 ml e 2 ml

• Blocco termico che raggiunge 105°C

• Miscelatore vortex

• Agitatore magnetico

• Pipette calibrate capaci di fornire da 10 a 1.000 µl

• Puntali sterili per pipette con filtri

• Pipettatore a ripetizione e spostamento positivo con puntali sterili da 1,25 ml confezionati singolarmente

• Microprovette da 2 ml con tappo a vite ermetico e fondo di forma tonda (Simport cat.# T335-6S o equivalente)

• Guanti monouso senza polvere

• Panno per occhiali 7.2. Preparazione reagenti

Ricostituzione della miscela di amplificazione (R1+R2)

 Prima della ricostituzione, le fiale R1 e R2 devono essere miscelate nel vortex per 5 secondi e quindi centrifugate per 15 secondi.

 Aggiungere esattamente 320 µl di diluente per miscela di amplificazione (R2) in una fiala di miscela di amplificazione concentrata (R1). Miscelare nel vortex per 10 secondi quindi centrifugare brevemente.

Una fiala di miscela di amplificazione ricostituita (R1+R2) è sufficiente per 24 reazioni PCR real-time. Preparare tante fiale di miscela di amplificazione ricostituita (R1+R2) in base alla necessità (ad esempio, 2 fiale se è necessario elaborare 48 test).

La miscela di amplificazione ricostituita (R1+R2) può essere utilizzata immediatamente o aliquotata e conservata a –20°C per un massimo di 2 settimane.

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5 7.3. Procedura di dosaggio

7.3.1. Estrazione del DNA

1. Determinare il numero di campioni da esaminare e prelevare una microprovetta con tappo a vite per campione e una per il Controllo Negativo. Identificare ciascuna microprovetta.

2. Agitare la bottiglia del buffer di lisi (L1) capovolgendola e quindi porla su un agitatore magnetico per consentire alla resina Chelex di rimanere in sospensione.

3. Aggiungere 400 µl di buffer di lisi (L1) in ciascuna microprovetta.

4. Aggiungere 10 µl di Controllo Interno (C1) in ciascuna microprovetta.

5. Aggiungere 200 µl di Controllo negativo (C2) nella provetta corrispondente. Avvitare il tappo saldamente.

6. Aggiungere 200 µl di ogni campione nella provetta corrispondente. Avvitare i tappi saldamente.

Nota: in alternativa è possibile preparare una premiscela “L1+C1” quindi dispensare 410 µl di questa premiscela in ciascuna microprovetta. La provetta della premiscela deve essere miscelata nel vortex prima di ogni pipettaggio per consentire alla resina Chelex di rimanere in sospensione. Questa premiscela è stabile per 14 giorni a 2-8°C.

Esempi di premiscela:

12 test 24 test 48 test

L1 5 ml 10 ml

Aggiungere 525 µl di C1 direttamente in 1 bottiglia di L1

C1 125 µl 250 µl

7. Miscelare nel vortex per 15-20 secondi.

8. Incubare esattamente per 10 minuti a 105°C.

9. Raffreddare per 2 minuti a temperatura ambiente (18-30°C).

10. Centrifugare per 2 minuti a 4.000 g.

Il supernatante contiene il DNA estratto.

Questo DNA estratto può essere conservato a temperatura ambiente per 2 ore. Se la fase di amplificazione/rilevamento non viene eseguita entro 2 ore, il DNA estratto può essere conservato a 2-8°C per un massimo di 7 giorni. Per la conservazione a lungo termine, gli estratti di DNA devono essere congelati (a una temperatura non superiore a -20°C). Non utilizzare gli estratti di DNA congelati se sono stati sottoposti a più di 3 cicli di congelamento e scongelamento.

7.3.2. Amplificazione/rilevamento nella PCR real-time

Per informazioni più dettagliate, fare riferimento al manuale d'istruzioni dello strumento Dx Real-Time System.

Ciascun ciclo di dosaggio deve comprendere un controllo negativo e uno positivo.

Nell'area di pre-amplificazione:

1. Ricostituire tante fiale di miscela di amplificazione in base alla necessità seguendo la procedura riportata al capitolo 7.2 (numero di test = n campioni + 1 controllo positivo + 1 controllo negativo).

2. Prendere il numero necessario di strisce Dx 24-Well PCR Strips, posizionarlo su un supporto e dispensare con attenzione mediante un pipettatore a ripetizione, 15 µl di miscela di amplificazione ricostituita (R1+R2) in ciascun pozzetto.

3. Aggiungere 10 µl di DNA estratto oppure di Controllo Negativo estratto oppure di Controllo Positivo non estratto (C3) nei pozzetti corrispondenti, seguendo la mappa definita della piastra.

Nota: Quando si aggiungono i campioni, fare attenzione a non eseguire il pipettaggio delle biglie Chelex, in quanto queste possono inibire la reazione PCR.

4. Coprire le strisce Dx 24-Well PCR Strips con il prodotto Dx 8-Cap Strips.

5. Centrifugare le strisce Dx 24-Well PCR Strips per 1 minuto a 400 g per evitare la formazione di bolle nei pozzetti.

Nell'area di amplificazione:

6. Accendere, nell'ordine seguente, il computer quindi lo strumento Dx Real-Time System. Aprire il software Dx Real-Time Software, inserire user name e Login e scegliere <Set up>.

Cliccare <Create a new plate> e selezionare nella finestra <PCR kit>, il nome del kit PCR. Fare riferimento al supporto locale per maggiori informazioni riguardantiil nome appropriato del kit PCR e la versione del DX RTS software.

7. Fare clic su <Run> nella barra di spostamento, quindi su <Open Lid> e seguire le istruzioni del software per stabilire la mappa della piastra.

8. Collocare le strisce Dx 24-Well PCR Strips nello strumento Dx Real-Time System.

9. Utilizzare lo strumento Dx Strip Cap Tool per sistemare i Dx 8-Cap Strips sulle strisce Dx 24-Well PCR Strips.

10. Fare clic su <Close Lid>, quindi su <Start Run> per avviare il ciclo PCR real-time.

11. Dopo aver completato il ciclo PCR real-time, rimuovere le strisce Dx 24-Well PCR Strips dallo strumento Dx Real-Time System, metterle in una busta di plastica a chiusura ermetica e smaltirle in base alla buona pratica di laboratorio.

12. Fare clic su <Results> per verificare i risultati.

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6 7.4. Calibrazione

Durante ogni ciclo PCR, nella fase di appaiamento, il sistema ottico a navetta dello strumento Dx Real-Time System misura la fluorescenza emessa da ciascun fluoroforo, mentre il software associato Dx Real-Time Software rileva l'intensità della fluorescenza rispetto al numero di cicli. Al termine dell'esperimento, il software analizza in modo automatico i risultati di tutti i campioni e controlli.

Il software Dx Real-Time Software si basa su un algoritmo matematico proprietario per determinare i valori di un set di parametri matematici (tra i quali Ceep e F0) per ciascuna curva PCR, che vengono poi visualizzati nel foglio di calcolo dei risultati.

La stima di questi parametri si basa sull'ipotesi che il tasso di efficienza della reazione PCR sia massimo all'inizio della reazione e diminuisca dopo un numero di cicli che varia da un campione all'altro. Il valore Ceep (Cycle of end of exponential phase) corrisponde al ciclo per il quale l'efficienza della PCR inizia a diminuire. Il valore Ceep è normalmente vicino al ciclo in cui il segnale fluorescente inizia a crescere al di sopra dello sfondo. In condizioni PCR ideali (nessun inibitore di reazione, elevata efficienza), il valore Ceep è legato al numero di copia della sequenza target nel campione prima dell'amplificazione: maggiore è il valore Ceep, minore è il numero di copia iniziale.

Il valore F0 corrisponde al segnale fluorescente - non misurabile - specifico del target prima dell'avvio dell'amplificazione. F0 è proporzionale al numero di copia della sequenza target nel campione prima dell'amplificazione. Poiché il valore stimato F0 è solitamente <1, il software Real-Time Dx mostra per praticità il valore -log10 (F0). Di conseguenza, maggiore è il valore -log10 (F0), minore è il numero di copia iniziale.

Nel dosaggio Dx MTB Assay, l'analisi dei risultati si basa su valori Ceep.

7.5. Controllo di qualità

Controlli positivi e negativi

In ciascun batch di dosaggio è necessario includere Controlli Negativi e Positivi al fine di rilevare potenziali errori nelle fasi di elaborazione, amplificazione e rilevamento del campione.

Se i valori Ceep di un controllo sono fuori dal proprio range previsto, l'intero batch non è valido. Il software Dx Real-Time Software riporta quindi il risultato per il controllo come "Failed" (Fallito) e mostra uno dei seguenti flag:

* Controllo negativo: :

Flag Descrizione

- Invalid_IC: Controllo interno non valido

- MTB_conta: Contaminazione da DNA dal complesso M. tuberculosis

* Controllo positivo:

Flag Descrizione

- IS_out: valore IS6110 fuori range

- RD_out: valore RD9 fuori range

- IS_RD_out: valori IS6110 e RD9 fuori range

Se i Controlli Positivi e Negativi sono riportati come “Failed” (Fallito), tutti i campioni e i controlli dal batch di dosaggio devono essere riprocessati a partire dalla fase di estrazione del DNA.

Se il Controllo Positivo è riportato come “Failed” (Fallito), ma il Controllo Negativo come “Passed” (Passato), è allora possibile riprocessare il batch di dosaggio dall'Amplificazione/rilevamento nella PCR real-time utilizzando gli stessi campioni estratti.

Rilevamento dell'inibizione: Controllo interno

Il Controllo Interno viene aggiunto a ciascun campione e al Controllo Negativo all'inizio della fase di estrazione del DNA, e viene rilevato mediante una sonda specifica durante la reazione PCR real-time.

I campioni il cui valore Ceep del Controllo Interno è maggiore di 43 (quindi potenzialmente inibiti) vengono interpretati dal software Dx Real-Time Software nel modo seguente:

• Ogni campione con valore Ceep ≤ 44 per IS6110 e/o ≤ 42,5 per RD9 viene riportato come “Positivo” (vedere l'interpretazione dei risultati di seguito).

• Ogni campione privo di valore Ceep o con valori Ceep > 44 per IS6110 e > 42,5 per RD9 viene riportato come “Failed”

(Fallito) con la bandiera “Invalid IC”.

Tutti i campioni che mostrano un risultato non valido devono essere rielaborati a partire dalla fase di estrazione del DNA.

7.6. Criteri di validazione del test Il batch di dosaggio è valido se:

Criteri di convalida

C3 (Positive Control) Valore Ceep entro il range previsto per i due target IS6110 e RD9

C2 (Negative Control) nessun valore Ceep o valore Ceep > 48 per i due target IS6110 e RD9

Se il ciclo di dosaggio è valido, il software Real-Time Dx Software riporta lo stato del ciclo come "Passed" (Passato). In caso contrario, il software Dx Real-Time Software riporta lo stato del ciclo come "Failed" (Fallito).

Se lo stato del ciclo è "Failed" (Fallito), tutti i risultati dei test di quel ciclo vengono riportati come “Invalid” (non validi) e tutti i relativi campioni e i controlli devono essere rielaborati a partire dalla fase di estrazione del DNA se lo status dei Controlli Negativi e Positivi è "Failed" (Fallito), dalla fase di Amplificazione se lo stato del Controllo Negativo è "Passed" (Passato).

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7 7.7. Calcolo / Interpretazione dei risultati

Il calcolo dei risultati viene eseguito dal software Dx Real-Time Software, che determina in modo automatico i valori Ceep per IS6110 e RD9 e per il Controllo Interno in campioni e controlli.

Se il test è valido, il software Dx Real-Time Software e riporta i risultati nel modo seguente:

• Campioni non inibiti (Valore Ceep del Controllo Interno ≤ 43):

Valori Ceep IS6110 < 35 35 ≤ IS6110 ≤ 44 IS6110 > 44

RD9 ≤ 42,5

MTB_pos_G1 Campione positivo per M.

tuberculosis o M. canettii

RD9 > 42,5

MTB_pos_G2 Campione positivo per M. bovis,

M. africanum, M. microti, M.

pinnipedii o M. caprae

MTB_pos_ND Campione positivo per il

complesso MTB, senza differenziazione

MTB_neg Campione negativo

• Campioni potenzialmente inibiti (Valore Ceep del Controllo Interno > 43):

Valori Ceep IS6110 < 35 35 ≤ IS6110 ≤ 44 IS6110 > 44

RD9 ≤ 42,5

RD9 > 42,5

Failed (Fallito)

I campioni riportati come "Failed" (Fallito) devono essere rielaborati a partire dalla fase di estrazione del DNA. Se in seguito alla rielaborazione il campione è ancora inibito, si consiglia di eseguire un nuovo test con un nuovo campione raccolto.

8. LIMITAZIONI DEL TEST

• Il dosaggio dovrebbe essere eseguito unicamente sui tipi di campione indicati. Altre tipologie di campione non sono state validate.

• L'uso di questo dosaggio è riservato al personale addestrato all'impiego del dosaggio Dx MTB Assay, dello strumento Dx Real-Time System e del software Dx Real-Time Software.

• Un risultato negativo non esclude la possibilità di infezione poiché i risultati dipendono da molte variabili. La raccolta o il trattamento non adeguato del campione, la presenza di inibitori o un errore tecnico può portare a un risultato errato. Si consiglia di attendere l'esito dell'esame colturale prima di formulare una diagnosi negativa.

• Il successo o il fallimento terapeutico non possono essere determinati dal dosaggio Dx MTB Assay poiché il DNA patogeno può persistere anche dopo un'adeguata terapia antimicrobica.

• Come per qualsiasi test diagnostico, i risultati del dosaggio Dx MTB Assay vanno interpretati insieme agli altri esami clinici e di laboratorio.

9. CARATTERISTICHE DELLE PRESTAZIONI 9.1 Studio di precisione

Conformemente alle istruzioni CLSI EP5A2, su un pannello di campioni MTB composto da un campione negativo, un campione basso positivo e un campione medio positivo, è stato condotto uno studio di precisione intermedia (20 giorni con 2 cicli al giorno su 3 estrazioni e 2 repliche di PCR) (tabella 1) unitamente a uno studio inter-operatore e inter-strumento (2 operatori X 2 strumenti) (tabella 2) e uno studio inter-lotto (3 lotti) (tabella 3). L'analisi sui campioni positivi è stata eseguita utilizzando i valori Ceep. Per ciascuna sonda sono stati determinati i CV (IS6110, RD9 nonché controllo interno IC).

Tutti i campioni negativi sono risultati negativi e sui campioni positivi MTB sono stati ottenuti CV inferiori al 3%, indipendentemente dalle condizioni.

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8 Tabella 1: Mycobacterium tuberculosis: Risultati di precisione totale, inter-ciclo e inter-giorno per sonda e campione del pannello- Valore Ceep su campioni positivi

Pannello Sonda N

Ceep medio

Inter-ciclo Inter-giorno Estrazione/PCR Precisione totale DS CV% DS CV% DS CV% DS CV%

Medio IS6110 240 34,96 0,414 1,2 0* NA 0,368 1,0 0,598 1,7 RD9 230 38,28 0,426 1,1 0* NA 0,419 1,1 0,876 2,3 IC 240 38,04 0,055 0,1 0,018 0,05 0,106 0,3 0,422 1,1 Basso IS6110 239 37,15 0* NA 0,251 0,7 0,231 0,6 0,583 1,6 RD9 102** 40,32 0* NA 0,200 0,5 0,360 0,9 0,825 2,0 IC 239 38,03 0,017 0,4 0* NA 0* NA 0,049 1,3

*Il valore negativo della componente della varianza è stato stimato a 0*

** Il campione basso positivo per la sonda RD9 è stato incrementato a un livello prossimo al limite di rilevamento: solo 102 risultati su 240 sono stati positivi

Tabella 2: Mycobacterium tuberculosis: Risultati di precisione dell'operatore e dello strumento per sonda e campione del pannello- Valore Ceep su campioni positivi

Pannello Sonda N Media Ceep

Precisione

DS CV%

Medio IS6110 179 34,59 0,490 1,4 RD9 179 37,91 0,767 2,0 IC 179 37,93 0,468 1,2 Basso IS6110 180 36,77 0,558 1,5 RD9 86** 40,22 1,004 2,5 IC 180 38,15 0,491 1,3

** Il campione basso positivo per la sonda RD9 è stato incrementato a un livello prossimo al limite di rilevamento: solo 86 risultati su 180 sono stati positivi

Tabella 3: Mycobacterium tuberculosis: risultati di riproducibilità da batch a batch per sonda e campione del pannello- Valore Ceep su campioni positivi

Pannello Sonda N Media ceep

Totale

DS CV%

Medio IS6110 135 35,00 0,739 2,1 RD9 132 38,22 0,989 2,6 IC 135 38,16 0,564 1,5 Basso IS6110 135 37,48 0,827 2,2 RD9 57** 40,66 1,073 2,6 IC 135 38,40 0,523 1,4

* Il valore negativo della componente della varianza è stato stimato a 0

** Il campione basso positivo per la sonda RD9 è stato incrementato a un livello prossimo al limite di rilevamento: solo 57 risultati su 135 sono stati positivi

9.2. Prestazioni cliniche

Le prestazioni cliniche del dosaggio Dx MTB Assay sono state valutate presso 3 strutture cliniche su campioni ottenuti da una popolazione di pazienti recatisi in ospedale per una diagnosi di patologia di tubercolosi polmonare. Sono stati condotti studi di specificità e sensibilità su 1919 campioni prospettici (1756 negativi e 163 MTBC positivi) e 58 campioni MTBC positivi retrospettivi.

9.2.1 Specificità diagnostica

Un totale di 1756 campioni negativi MTBC è stato sottoposto a test in parallelo con il dosaggio Dx MTB Assay e due altri test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT): NAAT 1 per la struttura 1 e NAAT 2 per le strutture 2 e 3. 1735 campioni sono risultati negativi e 21 sono risultati positivi (19 MTB_pos_ND e 2 MTB_pos-G1) sul dosaggio Dx MTB Assay. La specificità complessiva del dosaggio Dx MTB Assay sui 1756 campioni è stata del 98,8% (1735/1756) con un intervallo di confidenza al 95% di [98,2% - 99,3%]. Solo i campioni negativi delle strutture 1 e 2 sono stati caratterizzati mediante microscopia con colorazione AFB (bacilli acido resistenti). La specificità sui campioni negativi AFB è stata del 99,3% (1364/1374) con un intervallo di confidenza al 95% di [98,7%- 99,6%]. La specificità sui campioni positivi AFB è stata del 100% (22/22).

(9)

9 Questi risultati sono stati ottenuti su sputo (SP), aspirati tracheali (TA), lavaggi broncoalveolari (BAL), lavaggi gastrici (GA), liquido cerebrospinale (CSF) e campione urinario (UR).

Campioni AFB negativo AFB positivo AFB non determinato Totale

Risultato (*) negativo positivo negativo positivo negativo positivo negativo positivo SP 562 4 14 0 63 3 639 7 TA 306 2 3 0 159 2 468 4 BAL 260 4 2 0 114 6 376 10 GA 231 0 3 0 12 0 246 0

Altri (CSF, UR) 5 0 0 0 1 0 6 0

Totale 1364 10 22 0 349 11 1735 21

(*) I risultati positivi del dosaggio Dx MTB Assay includono MTB_Pos_ND, MTB_Pos_G1 e MTB_Pos_G2. I risultati non validi sono stati esclusi.

Dx MTB Assay

Dosaggio NAAT 1 MTB_neg MTB_pos_ND MTB_pos_G1 MTB_pos_G2 Totale

Neg 644 4 / / 648

Pos 18 / / / 18

Totale 662 4 / / 666

Dx MTB Assay

Neg 1060 13 2 1075

Pos 3 2 5

Totale 1063 15 2 1080

Dopo l'esclusione dei risultati non validi (inibizione della PCR), il dosaggio Dx MTB Assay evidenzia un accordo del 96,7%

(644/666) con il dosaggio NAAT 1 e un accordo del 98,3% (1062/1080) con il dosaggio NAAT 2.

9.2.2 Sensibilità diagnostica

Un totale di 221 campioni negativi MTBC (163 prospettici e 58 retrospettivi) è stato sottoposto a test in parallelo con il dosaggio Dx MTB Assay e due altri test di amplificazione dell'acido nucleico (NAAT): NAAT 1 per la struttura 1 e NAAT 2 per le strutture 2 e 3. 29 campioni sono risultati negativi, 34 sono risultati positivi senza differenziazione, 153 sono risultati positivi al Gruppo 1 e 5 sono risultati positivi al Gruppo 2 sul dosaggio Dx MTB Assay. La sensibilità complessiva del dosaggio Dx MTB Assay sui 221 campioni è stata dell'86,9% (192/221) con un intervallo di confidenza al 95% di [81,7% - 91,0%]. La sensibilità sui campioni negativi AFB è stata del 58,0% (40/69) con un intervallo di confidenza al 95% di [45,7%- 69,8%]. La sensibilità sui campioni positivi AFB è stata del 100,0% (148/148) con un intervallo di confidenza al 95% di [97,5%- 100,0%]. Quattro campioni non sono stati caratterizzati con il test AFB.

Questi risultati sono stati ottenuti su sputo (SP), aspirati tracheali (TA), lavaggi broncoalveolari (BAL), lavaggi gastrici (GA) e altri tessuti cerebrospinali (CSF), ganglionari (GG), cutanei (CUT), pus (PUS) e pleurici (LPT).

Campioni AFB negativo AFB positivo AFB non determinato Totale

Risultato (*) negativo positivo negativo positivo negativo positivo negativo positivo SP 14 12 / 88 / 2 14 102

TA 4 8 / 14 / / 4 22

BAL 2 7 / 5 / / 2 12

GA 7 11 / 39 / 2 7 52

Altri (CSF, GG, CUT, PUS, LPT)

2 2 / 2 / / 2 4

Totale 29 40 / 148 0 4 29 192

Dx MTB Assay

Neg 9 2 / / 11

Pos 7 16 72 3 98

Totale 16 18 72 3 109

(10)

10 Dx MTB Assay

Neg 10 / / / 10

Pos 3 49 48 2 102

Totale 13 49 57 2 112

Dopo aver raccolto tutti i risultati positivi del dosaggio Dx MTB Assay (ND+G1+G2), il dosaggio Dx MTB Assay evidenzia un accordo del 91,7% (100/109) con il dosaggio NAAT 1 e un accordo del 97,3% (109/112) con il dosaggio NAAT 2.

9.2.3 Valore predittivo positivo (PPV) e valore predittivo negativo (NPV)

Per calcolare la percentuale dei risultati di test positivi che sono veri positivi (PPV) e la percentuale dei risultati di test negativi che sono veri negativi (NPV) sono state utilizzate le prestazioni di specificità e sensibilità.

Striscio (test AFB) Stato del campione Dx MTB negativo Dx MTB positivo Totale

Complessivo (striscio positivo + negativo +

sconosciuto)

Negativo 1735 21 1756

Positivo 29 192 221

Totale 1764 213 1977 PPV N/A 90,1% (192/213)

NPV 98,4% (1735/1764) N/A

Striscio positivo

Negativo 22 0 22

Positivo 0 148 148

Totale 22 148 170

PPV N/A 100,0% (148/148)

NPV 100,0% (22/22) N/A

Striscio negativo

Negativo 1364 10 1374

Positivo 29 40 69

Totale 1393 50 1443

PPV N/A 80,0% (40/50)

NPV 97,9% (1364/1393) N/A

9.3 Limite di rilevamento

Il limite di rilevamento (LOD) è stato determinato mediante analisi Probit adottando la diluizione corrispondente a un livello positivo del 95%

Il LOD del dosaggio Dx MTB Assay per Mycobacterium tuberculosis è stato stimato a 18,4 CFU/mL (*) con un intervallo di confidenza (CI) al 95% di [10,8 – 40,8 CFU/mL], corrispondente a 0,06 CFU e 0,95 copie di plasmide IS6110 per PCR (16 copie in media di plasmide IS6110 per batterio).

(*) CFU/mL di campione decontaminato/liquefatto

9.4 Specificità analitica

9.4.1 Studio di reattività incrociata

Il dosaggio Dx MTB Assay fornisce risultati MTB_negativi corretti se utilizzato con 112 microorganismi a potenziale reattività incrociata che rappresentano diversi batteri (63), micobatteri (25), virus (19), lieviti (3) e ceppi di funghi (2).

La specificità analitica è del 100,0% (112/112) con CI al 95% di [96,8 %– 100,0%].

(11)

11 Acinetobacter baumannii Peptostreptococcus anaerobius Mycobacterium intracellulare

Actinomyces (ou Arcanobacteriu) pyogenes Porphyromonas gingivalis Mycobacterium kansasii

Actinomyces meyeri Prevotella melaninogenica Mycobacterium mucogenicum

Actinomyces naeslundii Propionibacterium acnes Mycobacterium nonchromogenicum

Aeromonas hydrophila Pseudomonas aeruginosa Mycobacterium parafortuitum

Bacillus subtilis Rhodococcus aichiensis = Gordona Mycobacterium peregrinum Bordetella parapertussis Rhodococcus chubuensis = Gordona sputi Mycobacterium phlei

Bordetella pertussis Rhodococcus equi Mycobacterium scrofulaceum

Burkholderia cepacia Salmonella enteretica Mycobacterium shimoidii

Campylobacter jejuni Salmonella typhimurium Mycobacterium simiae

Citrobacter freundii Serratia marcescens Mycobacterium smegmatis

Corynebacterium diphteriae Staphylococcus aureus Mycobacterium szulgai

Corynebacterium pseudodiphtheriticum Staphylococcus epidermidis Mycobacterium thermoresistable Corynebacterium striatum Stenotrophomonas maltophilia Mycobacterium ulcerans

Corynebacterium xerosis Streptococcus agalactiae Adenovirus type 1 Eikenella corrodens Streptococcus constellatus Adenovirus type 5

Enterobacter aerogenes Streptococcus mitis Adenovirus type 7A

Enterobacter cloacae Streptococcus mutans (carie) EBV

Enterococcus faecalis Streptococcus oralis HBV

Enterococcus faecium Streptococcus pneumoniae HCV

Escherichia coli Streptococcus pyogenes HIV-1 IIIB DNA CONTROL

Fusobacterium nucleatum Veillonella parvula HSV-1

Haemophilus influenzae Vibrio parahaemolyticus Human cytomegalovirus (CMV) Haemophilus parahemolyticus Chlamydia Pneumoniae Human Enterovirus

Haemophilus parainfluenzae Mycoplasma orale Human rhinovirus

Klebsiella pneumoniae subsp. ozaenae Mycoplasma pneumoniae Influenza Virus A Klebsiella pneumoniae subsp. Pneumoniae Aspergillus fumigatus Influenza Virus B Legionella (Tatlockia) micdadei Cryptococcus neoformans Parainfluenzavirus Type 1 Legionella pneumophila Mycobacterium abscessus Parainfluenzavirus Type 2 Moraxella catarrhalis Mycobacterium asiaticum Parainfluenzavirus Type 3 Morganella morganii Mycobacterium aurum Parainfluenzavirus Type 4 Neisseria (ou Nocardia) asteroïdes Mycobacterium avium Respiratory Syncytial Virus Type A Neisseria cinerea Mycobacterium celatum Respiratory Syncytial Virus Type B Neisseria lactamica(9) Mycobacterium chelonae Candida glabrata

Neisseria meningitidis Mycobacterium flavescens Candida parapsilosis

Neisseria mucosa Mycobacterium fortuitum Candida tropicalis

Pasteurella multocida Mycobacterium gordonae Mycobacterium mucogenicum

9.4.2 Studio delle interferenze

Conformemente all'istruzione CLSI EP07-A2, le potenziali interferenze sul dosaggio Dx MTB Assay sono state valutate con sostanze endogene o esogene che potrebbero essere presenti in vari campioni.

Nessuno dei composti potenzialmente interferenti riportati di seguito e utilizzati allo 0,2% o CMax (*) nei campioni decontaminati mostra discordanze e conseguenze significative sull'interpretazione nonché sui risultati Ceep: isoniazide, rifampicina, etambutolo, pirazinamide, kanamicina, streptomicina, ofloxacina, acido acetilsalicilico, ibuprofene, paracetamolo, oxomemazina, gel lubrificante, xylocaina, emoglobina allo 0,2% e sangue intero EDTA al 2%.

(*) CMax è la concentrazione plasmatica massima indicata nella letteratura medica

10. RIFERIMENTI BIBLIOGRAFICI 1. WHO TB Report 2004

2. Kent PT, Kubika GP, 1985 : Public health mycrobiology : a guide for the level III laboratory. U.S. Department of Public Health and Human Services, Atlanta, GA.

3. Kubica GP, Dye WE, Cohn ML, Middlebrook G. Sputum digestion and decontamination with N-acetylcystein-sodium hydroxide for culture of mycobacteria. Am Rev Respir Dis. 1963, 87:775).

4. Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology. World Health Organization, Geneva, 2003 – Second edition.

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