SEZIONE IV
I primi studi condotti su TTV, dopo la sua scoperta avvenuta nel 1997 in un paziente affetto da epatite criptogenetica, sono stati indirizzati, principalmente, a stabilire se l’infezione con questo virus avesse un ruolo nelle patologie a carico del fegato. Tuttavia, la successiva dimostrazione di elevata prevalenza di TTV nella popolazione generale (Bendinelli et al., 2001), ha contribuito ad escludere un ruolo del virus come agente nell’eziologia di malattie epatiche. Con il progredire del tempo, le conoscenze su TTV, anche grazie allo sviluppo di nuove tecnologie nel campo della biologia molecolare, si sono notevolmente ampliate, ed oggi sono note, almeno in parte, le caratteristiche chimico-fisiche della particella virale, l’organizzazione genomica e le capacità trascrizionali del virus, ma resta ancora sconosciuta la sua potenzialità patogena.
In questo lavoro di tesi, che descrive lo status dell’infezione da TTV in pazienti affetti da patologie respiratorie croniche, si è cercato di comprendere se il virus potesse avere un ruolo nello sviluppo e nelle manifestazioni di queste gravi patologie dell’infanzia. La relazione esistente tra asma ed infezioni virali è stato un argomento frequentemente trattato in letteratura, e più volte al centro di dibattito. In particolar modo sono state spesso oggetto di opinioni controverse le varie ipotesi formulate circa il ruolo dei virus respiratori nella patogenesi dell’asma. Diversi studi indicano che la primissima infanzia rappresenta un periodo critico in cui alcune infezioni virali, agendo
sull’apparato respiratorio e sul sistema immunitario ancora immaturi, potrebbero predisporre all’insorgenza di asma e patologie respiratorie simili nelle età successive (Lemanske, 2004; Gern e Busse, 2004). Ad esempio la bronchiolite da virus respiratorio sinciziale, ritenuto la causa più frequente di infezioni respiratorie del tratto inferiore nei primi anni di vita, è stata associata con un aumentato rischio di manifestare ‘wheezing’ (cioè respiro sibilante, espressione della riduzione della pervietà delle vie aeree), allergia ed asma negli anni successivi (Sigurs, 2001; Peebles, 2004; Sigurs et al., 2000). Studi condotti su bambini affetti da bronchiectasie, patologia respiratoria caratterizzata da sintomi quali tosse e dispnea, (Dogru et al., 2005), hanno suggerito che un danno alle vie aeree con sviluppo di bronchiectasie può avvenire come risultato di infezione da parte di un singolo agente patogeno come adenovirus o M.pneumoniae, o una successione di frequenti infezioni virali che potrebbero rendere i pazienti più suscettibili a serie complicazioni con altri agenti.
Questi studi suggeriscono quindi un potenziale ruolo delle infezioni virali nell’induzione del fenotipo asmatico e della condizione di bronchiectasia, ma in realtà è più verosimile pensare che i virus siano solo uno dei molti fattori di rischio che giocano un ruolo nel determinare la comparsa e la progressione di queste complesse patologie (Gern e Busse, 2004; Umetsu et al., 2002; Gern, 2004).
Mentre rimane ancora da chiarire il ruolo delle infezioni virali nella comparsa di nuovi casi di asma e patologie respiratorie croniche simili, appare invece più certo il loro coinvolgimento nell’indurre e nel determinare la gravità delle riacutizzazioni asmatiche e l’aumento del grado di severità delle bronchiectasie.
Anche per TTV, virus molto diffuso e che generalmente persiste nella maggior parte dei soggetti infetti (Bendinelli et al., 2001), è stato proposto, in questo lavoro di tesi, un possibile ruolo patogenetico nell’aggravamento della condizione asmatica e delle bronchiectasie. Alcuni esperimenti condotti recentemente nel nostro laboratorio hanno contribuito a porre le basi per lo svolgimento del presente lavoro. Da studi iniziali, in cui sono stati esaminati bambini di età inferiore a 2 anni affetti da infezioni respiratorie acute (MRA), è emerso, in accordo con precedenti osservazioni (Suzuki et al., 2001) che il tratto respiratorio è una probabile sede di infezione primaria e di continua replicazione di TTV; i titoli del virus sono risultati inoltre più elevati nel plasma e nel fluido nasale di bambini con malattie respiratorie più gravi (Maggi et al., 2003a): ciò suggeriva un possibile ruolo di TTV nella modulazione del sistema immunitario, ipotesi ulteriormente avvalorata da altri risultati che mostravano i titoli del virus correlare con i livelli di alcune sottopopolazioni linfocitarie circolanti (Maggi et.al., 2003b). L’ipotesi di un potenziale ruolo immunomodulatorio di TTV era rafforzata anche da precedenti studi che mostravano una
correlazione inversa tra il virus e i linfociti T helper in pazienti affetti da HIV (Christensen et al., 2000; Shibayama et al., 2001). Nei soggetti affetti da bronchiectasie, una parte di popolazione esaminata nel nostro attuale studio, l’osservato basso livello di cellule T CD4, associato con l’alto livello di cariche virali, potrebbero essere fattori responsabili di una ridotta risposta immunitaria, con conseguente aumento della gravità e della frequenza delle infezioni. Ciò potrebbe favorire l’accumulo di lesioni e ostruzioni alle vie aeree, che potrebbero inoltre essere aggravate da scarsa eliminazione di muco, solitamente osservata nel corso dell’infezione virale.
A seguito delle varie scoperte sovradescritte, siamo stati dunque indotti ad ipotizzare che TTV potesse essere un potenziale induttore, o più verosimilmente un cofattore nella patologia di queste diffuse affezioni respiratorie. Per far luce su tale ipotesi, abbiamo così condotto il presente studio, per il quale sono stati arruolati due gruppi di soggetti affetti da patologie respiratorie croniche: un gruppo di 38 bambini con bronchiectasie di età compresa tra 8 mesi e 16 anni, e un gruppo di 59 adolescenti e pre-adolescenti con asma persistente, lieve o moderata. E’ stata svolta innanzi tutto, un’analisi di prevalenza in cui abbiamo determinato, nel plasma dei soggetti con bronchiectasie, nei fluidi nasali dei soggetti asmatici, e nei campioni di 35 bambini scelti come gruppo di controllo, presenza e titoli di TTV, considerando questi ultimi indicatori dell’attività replicativa del virus nel tratto respiratorio.
L’alta prevalenza del virus che ne è risultata (82% positivi dei 38 soggetti con bronchiectasie, 93% positivi dei 59 soggetti asmatici, e 83% positivi dei 35 controlli sani) ha confermato, in accordo con lo studio sui bambini con MRA (Maggi et al., 2003a; Koller et al., 1997) e su individui residenti nella stessa area geografica (Pistello et al., 2001), l’enorme diffusione di TTV, indipendentemente dallo status clinico dei soggetti esaminati. Già dai primi studi di prevalenza compiuti dai vari laboratori di ricerca, l’infezione da TTV risultava ampiamente distribuita nella popolazione generale, ma il successivo impiego di metodiche di amplificazione sempre più sensibili ha dimostrato come i dati di prevalenza ottenuti inizialmente fossero sottostime degli attuali valori. Infatti, nella maggior parte dei casi più dell’80% della popolazione generale è risultata portatrice del virus con picchi che in certe aree geografiche sfiorano la totalità della popolazione analizzata (Bendinelli et al., 2001). Anche per quanto riguarda i titoli di TTV abbiamo ottenuto dei dati che concordano perfettamente con quelli già presenti in letteratura: i livelli di viremia si sono rivelati, nei soggetti con bronchiectasie, negli asmatici, e nel gruppo dei sani, notevolmente variabili mostrando fluttuazioni individuali che coprono un ampio range di valori.
L’alta prevalenza dell’infezione da TTV nella popolazione sana, riscontrata anche nel presente studio, ha sempre rappresentato un ostacolo ai molteplici tentativi di attribuire al virus un qualche
significato clinico, tanto che alcuni autori si sono affrettati a proporre TTV come virus apatogeno o addirittura commensale della normale flora microbica dell’uomo (Griffiths, 1999; Mushahwar, 2000). La determinazione dei titoli virali, quantificabili con grande precisione mediante metodica di Real-Time PCR, si è così rivelata un marcatore più idoneo per indagare l’eventuale ruolo patogeno del virus.
Il passo successivo del nostro lavoro, è stato quello di verificare l’esistenza di una possibile relazione tra TTV e grado di severità delle bronchiectasie, valutato mediante indagine diagnostica ad alta risoluzione (HRCT , High Resolution Computed Tomography). Ciò che è emerso da tale studio, è stata la prevalenza di TTV nei pazienti con maggiore grado di severità della bronchiectasia, a dimostrare la stretta associazione tra alta carica virale e gravità della patologia respiratoria osservata. Un altro aspetto interessante del nostro studio, è stato l’esistenza di una correlazione tra TTV e funzionalità respiratoria nei soggetti con bronchiectasie e con asma, verificata mediante esame spirometrico. C’è da premettere che i soggetti affetti dalle patologie respiratorie croniche da noi esaminate, erano periodicamente controllati e sottoposti a cure specifiche, tant’è vero che al momento del nostro studio non presentavano riacutizzazioni asmatiche da almeno 2 mesi, né sintomi tipici delle bronchiectasie, quali tosse, dispnea, respiro affaticato. L’asma è una malattia che si può tenere efficacemente sotto controllo mediante un costante monitoraggio delle
funzionalità respiratorie e con trattamenti principalmente volti a ridurre l’infiammazione delle vie aeree. Anche le bronchiectasie possono essere costantemente monitorate nella funzionalità respiratoria, e diagnosticate mediante tomografia ad alta risoluzione, indagine diagnostica prima citata, che permette di valutare man mano la condizione polmonare. Nonostante questo, i valori medi di alcuni indici spirometrici FEF25-75% e FEF25-75%/FVC, erano risultati, sia nei soggetti
con bronchiectasie che negli asmatici, significativamente ridotti rispetto ai valori del gruppo di controllo. Da quanto indicato in vari studi epidemiologici, tali parametri spirometrici sono considerati marcatori sensibili in grado di segnalare ostruzioni e disfunzioni delle vie aeree anche di grado molto lieve (O’Connor et al., 2000; Faul et al., 1999). Abbiamo così suddiviso i pazienti con bronchiectasie in due categorie, in base alla presenza o assenza di TTV nei campioni di plasma esaminati, e confrontato i livelli degli indici spirometrici tra i due sottogruppi. Sono emersi dati interessanti, in quanto i parametri FEF25-75%, e FEF25-75%/FVC risultavano significativamente ridotti nei
pazienti TTV positivi rispetto ai soggetti TTV negativi. Inoltre, il rapporto FEV1/FVC, anch’esso indice di patologia ostruttiva, ed FEV1,
ottimo indice della resistenza delle vie aeree periferiche, erano anch’essi ridotti nei soggetti TTV positivi. Soffermandoci sui valori dei parametri spirometrici FEF25-75% ed FEF25-75%/FVC, emerge l’esistenza
soggetti esaminati, determinata, avvalendoci di test statistici, da ulteriori indagini. Allo stesso modo abbiamo suddiviso i pazienti asmatici in due categorie, in base al basso o elevato titolo del virus nel fluido nasale, e confrontato i livelli degli indici spirometrici tra i due sottogruppi. L’esigenza di compiere un confronto che fornisse informazioni significative non ci ha permesso di suddividere i soggetti in pazienti TTV positivi e negativi come effettuato per i pazienti con bronchiectasie, in quanto la numerosità dei soggetti con asma era estremamente limitata. Sono emersi tuttavia dei dati molto interessanti: i valori degli indici spirometrici FEV1/FVC, FEF25-75% e
FEF25-75/FVC risultavano significativamente più bassi nel sottogruppo
ad alto titolo di TTV rispetto ai valori apprezzati nella categoria di soggetti con basso carico virale. Mossi dalla necessità di comprendere meglio il significato di questi risultati, anche in tal caso abbiamo condotto ulteriori indagini avvalendoci di test statistici i cui esiti non solo hanno confermato l’esistenza di una relazione tra alti titoli di TTV e riduzione del valore degli indici spirometrici, ma ne hanno reso ancora più forte l’associazione. Anche il gruppo dei bambini sani è stato valutato nella funzionalità respiratoria e da ciò è emerso come atteso, che i valori degli indici spirometrici FEF25-75% e FEF25-75%/FVC risultavano significativamente maggiori rispetto a quelli misurati nei pazienti affetti da patologie respiratorie croniche. I soggetti sani sono stati inoltre suddivisi in due categorie, in base alla presenza o assenza
di TTV, e non è emersa una variazione statisticamente significativa tra i valori degli indici spirometrici misurati nei soggetti sani TTV positivi e quelli nei soggetti sani TTV negativi. Non esiste, dunque, una significativa correlazione tra i titoli di TTV e i parametri respiratori misurati nei bambini sani. La successiva analisi di caratterizzazione di TTV che abbiamo condotto negli 86 pazienti affetti da patologie respiratorie croniche risultati positivi all’esame quantitativo, ha evidenziato una notevole variazione nella distribuzione dei 5 genogruppi e un’alta frequenza d’infezioni miste. Ciò non ha fatto altro che confermare un’ulteriore caratteristica che contraddistingue il virus, e cioè la sua straordinaria variabilità genetica, inconsueta tra i virus a DNA (Peng et al., 2002; Jelcic et al., 2004). Tale eterogeneità che risulta particolarmente pronunciata nella regione codificante ORF1 potrebbe anche spiegare la mancanza di cross-immunità che rende la presenza di infezioni miste l’evenienza più comune. Sebbene non sia stato ancora compreso quale significato possa avere e quanto possa pesare l’alto grado di eterogeneità genetica sulla relazione virus-ospite (Peng et al., 2002; Okamoto et al., 1999) molti studi hanno suggerito la possibilità che i genogruppi di TTV possano avere un differente comportamento nell’ambito di alcune patologie. (Bendinelli et al., 2001; Maggi et al., 2003a; Peng et al., 2002). Abbiamo così pensato di verificare se esistesse un’associazione preferenziale tra uno o più genogruppi e la riduzione dei parametri spirometrici ma i risultati
ottenuti non hanno rivelato alcuna significativa relazione. Sembrerebbe dunque che solo l'alta carica di TTV abbia un ruolo nell'influenzare la condizione respiratoria a prescindere dall'identità e dalle specifiche caratteristiche della replicazione. In accordo con precedenti indagini (Devalle e Niel, 2004) i genogruppi 1 e 3 sono risultati predominanti, mentre il genogruppo 2 è apparso meno rappresentato (Hallett et al., 2000). In circa l’11% dei soggetti TTV positivi non è stato possibile determinare l'identità dei genogruppi coinvolti nell’infezione; tali soggetti presentavano titoli virali significativamente più bassi rispetto a quelli mostrati dagli altri pazienti genotipizzati, per cui l’assenza di amplificazione potrebbe essere giustificata da un problema di sensibilità delle reazioni di PCR genogruppo specifiche, anche se non è da escludere la possibile presenza di isolati del virus al momento non ancora caratterizzati e quindi non riconosciuti dai primers impiegati. E' stato interessante notare come proprio questi soggetti non tipizzati mostrassero livelli degli indici spirometrici più alti, ma il significato di tale osservazione è ancora tutto da chiarire. E’ inoltre possibile ipotizzare, tenendo conto delle evidenze emerse dallo studio sulle cellule linfoidi nei bambini con MRA (Maggi et al., 2003b), che l’alta carica del virus possa contribuire in determinate condizioni allo squilibrio di alcune sottopopolazioni linfocitarie alterando così la risposta immunitaria a livello locale o sistemico. TTV potrebbe ad esempio stimolare il differenziamento dei
linfociti T helper-2 causando uno sbilanciamento verso il profilo citochinico Th2 che, come noto, ha un ruolo critico nell’induzione, mantenimento e amplificazione della flogosi asmatica. Inoltre, considerando che il virus risulta estremamente diffuso anche in aree che presentano buone condizioni igienico-sanitarie (Pistello et al., 2001) è ipotizzabile che il continuo contatto con TTV associato ad una diminuita esposizione dell’organismo ad altre infezioni e stimoli ambientali capaci di promuovere una risposta di tipo Th1, possa costituire una possibile spiegazione all’evidente incremento di patologie respiratorie croniche, registrato durante l’ultimo decennio proprio nei paesi più sviluppati (Holgate, 2004). TTV quindi, agendo con meccanismi al momento sconosciuti sul sistema immunitario, potrebbe contribuire all’amplificazione del processo infiammatorio cronico che coinvolge il tratto respiratorio dei soggetti con bronchiectasie e dei soggetti asmatici. Considerando inoltre che l’ostruzione delle vie aeree nelle patologie sovracitate ha un’eziologia multifattoriale, è verosimile ipotizzare che l’infezione da TTV nelle basse vie aeree possa costituire una delle possibili variabili capaci di creare le condizioni affinché si verifichi questo complesso fenomeno. Sebbene tale potenzialità patogenetica del virus debba essere ancora dimostrata, i risultati ottenuti nel presente studio rafforzano la nostra ipotesi iniziale sul possibile ruolo di TTV nell’aggravamento della funzionalità respiratoria in caso di patologie respiratorie. Tuttavia i dati
a nostra disposizione non ci hanno permesso di escludere la possibilità che l’incrementata replicazione di TTV abbia semplicemente identificato soggetti con una intrinseca funzione respiratoria ridotta, o che sia stata la conseguenza di cambiamenti fisiopatologici tipici dell’asma, o alterazioni strutturali con progressiva perdita di funzionalità polmonare caratteristiche delle bronchiectasie (soprattutto nei soggetti con ipersensibilità bronchiale): in questi casi l’aumento di viremia potrebbe dipendere dal reclutamento delle cellule del sangue periferico che si concentrano nelle vie aeree infiammate; ciò concorderebbe con la capacità di TTV, dimostrata in vitro, di replicarsi attivamente nelle cellule linfoidi stimolate (Maggi et al., 2001b; Mariscal et al., 2002). Tuttavia appare ben evidente la necessità di compiere ulteriori studi per definire appieno quale sia il ruolo di TTV nella patologia respiratoria cronica del bambino.
