SEZIONE I - INTRODUZIONE
I.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DELL'OCCHIO
I.1.1 STRUTTURA DEL GLOBO OCULARE
Il globo oculare è costituito da tre strati: strato esterno o sclera e cornea, strato intermedio o uvea, strato interno o retina (Vedi Fig I).
La sclera è formata da tessuti fibrosi che hanno la forma di segmenti di due sfere, la sclera e la cornea.
La parte esterna dell'occhio è coperta dalla parte mobile tarsale delle palpebre. La sottile pelle delle palpebre scorre facilmente sull'occhio e ne permette una rapida apertura e chiusura. Le palpebre sono sotto controllo della muscolatura sia involontaria (ammiccamenti spontanei o periodici e riflesso di ammiccamento) che volontaria. Esse distribuiscono il fluido lacrimale sull'occhio, assicurando una superficie liscia della cornea. Si è valutato che la velocità di taglio durante l'ammiccamento è di circa 20 s-1 e che influenza le proprietà reologiche di forme di dosaggio oculari viscose quando instillate e di conseguenza anche la biodisponibilità del farmaco applicato.
La cornea è un tessuto limpido, trasparente e non vascolarizzato al quale l'apporto di nutrienti ed ossigeno è assicurato dal fluido lacrimale e dall'umore acqueo. La cornea è composta da 5 strati: epitelio, strato di Bowmann, stroma, membrana di Descemet ed endotelio.
L' epitelio consiste di 5 o 6 strati di cellule. Le cellule dello strato basale sono del tipo a colonna. Man mano che vengono spinte in avanti dalle cellule nuove esse si differenziano e vengono espulse (esfoliate) dalla superficie dell'epitelio come cellule poligonali piatte. Le cellule epiteliali si generano per divisione mitotica dello strato basale. La vita di una cellula poligonale va dai 4 agli 8 giorni.
Le cellule basali sono disposte strettamente vicine le une alle altre, come un pavimento, a formare una efficace barriera non solo per molti microorganismi, ma anche per l'assorbimento di farmaci. La bassa permeabilità della cornea è indice della presenza di giunzioni strette tra le cellule.
Fig.I Rappresentazione schematica dell'occhio umano
Il complesso delle giunzioni strette comprende due proteine integrali transmembrana (claudina e occludina) e la proteina associata di membrana ZO-1. Le claudine funzionano inoltre come pori acquosi extracellulari. I livelli di calcio intracellulari e i filamenti di actina del citoscheletro probabilmente giocano un ruolo importante nell'integrità delle giunzioni strette. Gli elevati livelli di calcio all'esterno della cellula e bassi all'interno sono responsabili della bassa permeabilità propria delle giunzioni strette.
Le cellule piatte e squamose hanno sulla loro superficie microvilli di tipo diverso e di diverse dimensioni in base alla maturità delle cellule. Questi microvilli favoriscono la coesione e la stabilità del film lacrimale.
La congiuntiva è una membrana sottile e trasparente, combacia con la superficie interna delle palpebre e si riflette sul globo. Al margine della cornea la
congiuntiva è strutturalmente continua con l'epitelio corneale. E' vascolarizzata e idratata dal film lacrimale.
La congiuntiva è composta da un epitelio, una “substantia propria” altamente vascolarizzata, e da una submucosa o episclera. L'epitelio bulbare è formato da 5 o 7 strati cellulari. La struttura è a palizzata e non è un pavimento come nell'epitelio corneale. In superficie le cellule epiteliali sono connesse tramite giunzioni strette che rendono la congiuntiva relativamente impermeabile. Il tessuto congiuntivale è permeabile a molecole fino a 20 Da, mentre la cornea è impermeabile a molecole più grandi di 5000 Da.
Le cellule caliciformi sono importanti elementi anatomici della congiuntiva. Ci sono circa 1.5 milioni di cellule caliciformi. La densità più elevata si riscontra nel quadrante inferonasale (10 cell calic./mm2). La densità è dipendente dall'età ed è maggiore nei bambini e nei giovani dai 20 ai 30 anni, in realtà però può variare da soggetto a soggetto. Sembra non esistano differenze dipendenti dalla razza. Una diminuzione anomala di cellule caliciformi o la completa mancanza di esse si osserva non solo in più condizioni patologiche come la cheratocongiuntivite secca, la xeroftalmia e le congiuntiviti allergiche, ma anche dopo un uso cronico di lacrime artificiali contenenti benzalconio cloruro. E' stato riportato un notevole incremento delle cellule a calice nel caso di congiuntiviti allergiche e di cheratocongiuntiviti atopiche, ma una grande variazione della densità delle cellule caliciformi si traduce soltanto in una piccola differenza della concentrazione di mucina nelle lacrime.
Quando le vescicole presenti nelle cellule non caliciformi sulla superficie e nello strato intermedio dell’epitelio si fondono con la membrana superficiale, le catene delle glicoproteine si estendono verso lo strato mucoso ricoprendo la superficie. Le vescicole contengono mucine neutre, sialomucine e sulfomucine. Il ruolo di queste mucine è quello di ancorare le cellule caliciformi mucose alla superficie oculare. Le cellule caliciformi sintetizzano mucine di secrezione (MUC 5AC) e TFF-peptidi (precedentemente note come P-dominio peptidi) o fattori TFF1 e TFF3. I TFF-peptidi contribuiscono alle proprietà reologiche del fluido lacrimale grazie a interazioni specifiche non covalenti con le mucine formando una sorta di rete. I TFF-peptidi influenzano inoltre il risanamento della cornea.
Giornalmente vengono secreti 2 o 3 µl di muco. Il muco ha le proprietà di un gel e queste sono importanti per intrappolare particelle estranee e batteri. Durante l'ammiccamento essi vengono spazzati verso la rima palpebrale e vengono scaricati dal sistema di drenaggio. Il turnover di uno strato di muco si compie in circa 15- 20 h ed è molto più lento di quello del fluido lacrimale. Deve essere sottolineato che le interazioni del muco con i polimeri e con le forme di dosaggio mucoadesive è ancora limitato e che quindi la ricerca deve essere indirizzata allo sviluppo di medicazioni “once-daily”.
I.1.2 SISTEMA DI DRENAGGIO NASOLACRIMALE
Il sistema di drenaggio nasolacrimale consiste di una parte secretoria, di una parte distributiva e di una che fa da collettore. La porzione secretoria è composta dalla ghiandola propria lacrimale. Le lacrime secrete vengono sparse sulla superficie oculare dalle palpebre durante l'ammiccamento. Il sistema collettore è strutturato in canalicoli, sacchi lacrimali, e dotti nasolacrimali i quali si aprono nella parte inferiore del condotto nasale.
La produzione di lacrime da parte delle ghiandole lacrimali può essere suddivisa in lacrimazione di base, dovuta a riflesso, emozionale. Il flusso lacrimale basale è necessario a mantenere un film sulla superficie corneale che serve per scopi ottici, metabolici e di lubrificazione.
Il flusso di lacrime basale è di 1,2 µl/min (range 0.5-2.2 µl/min ). Ciò si traduce in un turnover lacrimale del 16 %/min durante le ore di veglia. Non ci sono sostanziali differenze nella produzione di lacrime nell'uomo e nella donna prima dei sessant'anni, comunque il turnover lacrimale dipende dall'età e le persone anziane soffrono in misura maggiore di secchezza degli occhi.
Il riflesso della lacrimazione è indotto da stimoli periferici (per esempio irritazione chimica o meccanica, temperatura e luce). Lo stimolo del riflesso può incrementare la lacrimazione centinaia di volte, fino a 300 µl/min, con conseguente lavaggio dei corpi estranei presenti in superficie, compresi i farmaci.
I.2 FILM LACRIMALE
La parte esposta dell'occhio è coperta da un sottile strato di fluido, il cosiddetto film lacrimale precorneale (vedi Fig.II). Il suo spessore è di circa 3-10 µm ma esso dipende dal metodo con cui viene misurato. Lo strato superficiale lipidico (film multimolecolare spesso 100nm) è secreto durante l'ammiccamennto dalle ghiandole meibomiane che si trovano negli articoli tarsali delle palpebre e dalle ghiandole sebacee accessorie di Zeiss. Lo strato lipidico si distribuisce su quello acquoso durante l'apertura dell'occhio. Esso consiste principalmente di esteri di steroli e acidi grassi liberi. I lipidi giocano un ruolo importante nella riduzione del grado di evaporazione in modo da mantenere la normale osmolalità delle lacrime, anche quando il flusso lacrimale è molto basso. Pazienti con disfunzione delle ghiandole meibomiane mostrano un elevato grado di evaporazione ed una altrettanto elevata osmolalità delle
Fig.II. Rappresentazione schematica del film lacrimale precorneale
La ghiandola lacrimale e la ghiandola accessoria contribuiscono alla formazione dello strato acquoso, contenente sali inorganici, glucosio e urea, retinolo, acido ascorbico, proteine varie, lipocaline (precedentemente note come pre-albumine lacrimali), immunoglobuline, lisozima, lactoferrina e glicoproteine.
Per la normale crescita e differenziazione dell'epitelio corneale e congiuntivale sono necessari vitamina A e suoi derivati. Una carenza di vitamina A è associata a cheratinizzazione, riduzione della popolazione di cellule caliciformi, incremento della mitosi delle cellule epiteliali della congiuntiva e disturbi nella differenziazione mucosale, produzione di mucina ed espressione del gene della mucina.
L'osmolalità del film lacrimale in occhi normali è pari a 310-350 mOsm/kg in occhi normali ed è regolata dai principali ioni inorganici Na+, K+, Cl-, HCO3- e proteine. Il valore medio del pH di lacrime normali è circa 7.4. A seconda dell'età e delle patologie sono stati misurati valori tra 5.2 e 9.3. Esistono esempi di cambiamenti di pH diurni, con passaggio da acido ad alcalino durante il giorno. La capacità tampone delle lacrime è determinata da ioni bicarbonato, proteine e mucine. Le lacrime hanno un comportamento reologico non Newtoniano. La viscosità è di circa 3 mPa s. La tensione superficiale dipende dalla presenza di mucine solubili, lipocaline e lipidi. Il valore medio di tensione superficiale è di circa 44 mN/m.
Lo strato mucoso, che è secreto sulla superficie dell'occhio dalle cellule caliciformi, è intimamente associato con il glicocalice delle cellule epiteliali corneali e congiuntivali.
Lo strato mucoso è molto sensibile all'idratazione e forma uno strato di gel con propetà reologiche viscoelastiche. Esso protegge gli epiteli da danneggiamenti e facilita i movimenti delle palpebre. Le mucine migliorano la distribuzione del film lacrimale e promuovono la sua stabilità e coesione. Il muco viene distribuito sulla superficie dell'occhio dalla palpebra superiore durante l'ammiccamento. Il gel mucoso intrappola batteri, detriti cellulari, e corpi estranei, formando fili di muco che consistono in sottili fibre disposte in piccoli fagotti. Questi fili durante l'ammiccamento sono trasportati verso il margine
interno della rima palpebrale ed espulsi sulla pelle. Lo strato mucoso può formare una barriera diffusiva per le macromolecole in dipendenza dal grado di intreccio delle catene. Dall'altra parte il muco può legare sostanze cationiche grazie alla carica negativa delle mucine.
Recenti studi sulla struttura e sulla composizione del film lacrimale indicano che la <<teoria dei tre strati >> deve essere rivista. Il film lacrimale umano è composto sostanzialmente da muco piuttosto che da fluido acquoso. Un film composto prevalentemente da muco, 40 µm in spessore, sembra essere più idoneo alle sue funzioni rispetto ad un sottile strato acquoso. Recentemente è stato confermato che il fluido lacrimale è composto primariamente da muco, con uno strato esterno lipidico ma senza uno strato acquoso separato e che lo spessore del film sulla cornea umana è soltanto 3 µm.
Il muco è costituito da glicoproteine, proteine, lipidi, elettroliti, enzimi, mucopolisaccaridi, e acqua. Il componente primario del muco è la mucina, una glicoproteina di elevato peso molecolare con subunità contenenti un nucleo proteico, lungo approssimativamente 800 aminoacidi, al quale si legano circa 200 sono catene polisaccaridiche laterali. Il nucleo proteico consiste di regioni ripetute l'una dietro l'altra, le quali sono principalmente sequenze di serina, treonina e prolina. Le catene laterali polisaccaridiche sono legate al nucleo proteico tramite un legame O-glicosidico tra l' N-acetilgalattosamina sulla catena dello zucchero ed il gruppo ossidrilico dei residui di serina e treonina sullo scheletro proteico. Visto che le catene laterali polisaccaridiche generalmente terminano con acido sialico o con fucosio, la glicoproteina è carica negativamente a pH fisiologico.
In soluzione, vasti aggregati lineari che si formano per oligomerizzazione di più glicoproteine di mucina, prendono la forma di bastoni flessibili di diverso diametro. Gli aggregati sono inoltre stabilizzati dall’intreccio delle macromolecole flessibili e dalla formazione di legami idrogeno tra residui dei carboidrati adiacenti. L’intreccio sembra essere la forma di associazione molecolare preferita in soluzioni diluite. Una combinazione di legami crociati, attraverso ponti disolfuro e legami idrofobici, e la formazione di una rete attraverso l'aggrovigliamento di macromolecole, caratterizzano la struttura
terziaria della mucina.
Ad oggi sono stati riportati diversi geni di mucina umana. Le mucine possono essere divise in mucine transmembranali, associate alla membrana o secrete. Le mucine secrete possono essere ulteriormente suddivise in gelificanti o solubili, sulla base della loro capacità di formare associazioni polimeriche. Le mucine associate alla membrana (MUC1, 3A, 3B, 4, 12 e 13) hanno delle piccole code citoplasmiche, un dominio idrofobico che ancora la molecola alla superficie cellulare apicale, e un dominio extra cellulare che è costituito principalmente dalla regione ripetitiva maggiormente glicosilata. Si è visto che MUC1 e MUC4 possono estendersi 200-500 µm dalla superficie cellulare in base al numero di regioni ripetitive presenti. Le mucine gelificanti (MUC2, 5AC, 5B e 6) sono responsabili delle proprietà reologiche del muco. La formazione di grandi strutture molecolari è dovuta alla oligomerizzazione attraverso la formazione di ponti disolfuro. Esse hanno una conformazione distesa in soluzione dall’aspetto di grandi macromolecole lineari. Le mucine transmembrana presumibilmente interagiscono con le mucine secrete dalle cellule caliciformi ma la natura esatta dell'interazione è ancora sconosciuta. In futuro bisognerà valutare se le differenze nella composizione delle varie mucine possono venire sfruttate per realizzare il targeting specifico di sistemi di rilascio.
Dei 17 geni di mucina umana clonati fino ad oggi, almeno cinque (MUC1, 4, 5AC, 7) sono espressi dalla superficie epiteliale oculare umana. A causa della loro conformazione largamente estesa e pesantemente glicosilata, le mucine associate alla membrana in genere hanno proprietà antiadesive, assicurano una barriera protettiva alla membrana cellulare e prevengono le interazioni cellula-cellula e cellula-proteina.
La mucina transmembrana (MUC1) è prodotta dall'epitelio corneale/congiuntivale. MUC1 è antiadesiva e potrebbe prevenire la stretta aderenza dello strato mucoso del fluido lacrimale alla superficie dell'occhio. La mucina MUC4, anch'essa una mucina transmembrana, è sintetizzata dalle cellule dell'epitelio stratificato congiuntivale. Inoltre si trova anche nel fluido lacrimale in forma solubile. Nelle patologie dell'occhio secco si riscontra una deficienza di MUC4 e MUC5AC.
cellule caliciformi congiuntivali. Gli aggregati di mucina MUC5AC sono carichi negativamente vista la presenza di residui di acido sialico e di zolfo. Dopo stimolazione, i granuli secretori si fondono l'uno con l'altro e con la membrana cellulare apicale, in questo modo viene rilasciata mucina sulla superficie epiteliale. Elevati livelli di calcio sulla superficie cellulare, come osservato in pazienti con occhio secco, possono contribuire a cambiamenti della secrezione di mucina e dello spargimento di muco sulla superficie oculare. L'assenza di mucina sulla superficie oculare può causare una minore idratazione, una maggiore presenza di parti secche ed una diminuzione della stabilità del film lacrimale. Una scarsa diffusività del muco fa si che questo si ammassi, e può essere collegata ad associazioni mucose intermolecolari anomale causate da un alterato impaccamento.
Se è vero che il muco fa diminuire l'aderenza batterica alla cornea e interagisce con vari microbi grazie alla superficie densamente glicosilata ed ai recettori proteici dei batterici, è anche vero che le mucine vengono degradate da enzimi sialidasi e sulfatasi presenti nei batteri. Sebbene il ruolo di tutte le mucine sia quello di proteggere l'occhio dall'essiccamento e dall'invasione batterica, il ruolo specifico di ciascuna mucina nel film lacrimale rimane ancora ignoto.
La secrezione di mucina congiuntivale può essere attivata da prostaglandine, colinomimetici e dal peptide intestinale vasoattivo. Gli agonisti dei recettori nucleotidici P2Y2 sono potenti attivatori della secrezione mucosa delle cellule caliciformi, mentre il 15(S)-HETE agisce selettivamente direttamente sulle cellule epiteliali congiuntivali, attivando il rilascio di MUC1. Nei pazienti affetti da sindrome dell'occhio secco è stata riscontrata un'alterazione della distribuzione di mucina sull'occhio e della glicosilazione della mucina.
Data la composizione, le caratteristiche fisico-chimiche e la struttura del film lacrimale, diversi fattori influenzeranno la mucoadesione dei sistemi di rilascio oculari. Varie teorie (elettronica, assorbimento, umidificazione, diffusione o interpenetrazione) sono state proposte per spiegare la bioadesione o mucoadesione. Per essere un buon coadiuvante della mucoadesione, il polimero del sistema di rilascio del farmaco deve stabilire un intimo contatto con
lo strato mucoso. Le catene polimeriche devono essere sufficientemente mobili e flessibili per diffondere nel muco e penetrare fino a profondità sufficienti a creare un intreccio. Esse devono interagire con le mucine attraverso legami idrogeno, elettrostatici ed interazioni idrofobiche.
Queste interazioni dipendono dalla forza ionica e dal pH del veicolo, perchè cambiamenti di ionizzazione dei gruppi funzionali o schermatura delle cariche influenzano la repulsione elettrostatica e l'espansione del reticolo mucoso. La presenza di elettroliti nel veicolo può incrementare il rigonfiamento del polimero e questo fenomeno può essere un importante fattore per raggiungere una interazione significativa con il muco. La diminuzione del pH del mezzo promuove la mucoadesione dei polimeri contenenti gruppi carbossilici donatori di protoni, perchè gruppi carbossilici non carichi invece che ionizzati, reagiscono con le molecole di mucina, presumibilmente attraverso legami idrogeno. Un incremento del pH d’altra parte promuove la repulsione elettrostatica degli anioni carbossilato, che si traduce in una estensione delle catene polimeriche. All'aumentare del numero di gruppi carichi disponibili, aumenta anche il rigonfiamento del polimero e ciò fa aumentare la dimensione degli spazi liberi all'interno del reticolato. Una diminuzione della densità delle catene polimeriche incrementerà la mobilità della singola catena e promuoverà l'interdiffusione e la reticolazione fisica. Di conseguenza il tempo di residenza nell'area precorneale del polimero che interagisce con il muco varia da poche ore a un giorno.
Il film lacrimale è stabile solo temporaneamente. Gli occhi non possono rimanere aperti più di un certo tempo, dopo 20-40 sec. una sensazione fastidiosa porta l'uomo al riflesso dell'ammiccamento. Nel breve intervallo tra due ammiccamenti la rottura del film lacrimale avviene a causa di gradienti di concentrazione e di forze di dispersione sullo strato mucoso. La rottura causa deumidificazione della cornea che irrita le terminazioni nervose corneali e induce l'ammiccamento. Durante l'apertura della palpebra un nuovo film lacrimale si spande sulla superficie esterna dell'occhio.
Il tempo di rottura dello strato mucoso e del film lacrimale dipendono dalle forze di dispersione, dalla tensione interfacciale e dalla resistenza viscosa dello strato mucoso.
Durante lo sviluppo di forme di dosaggio mucoadesive, la selezione dei polimeri e degli eccipienti, tutti questi fattori devono essere presi in considerazione. Qualche farmaco o veicolo applicato topicamente può influenzare la stabilità del fluido lacrimale. Una eventuale diminuzione della tensione interfacciale muco-acqua è correlata ad effetti indesiderati di tensioattivi, benzalconio cloruro e anestetici locali sulla stabilità del fluido lacrimale.
I.3 SOLUZIONI VISCOSE
Per migliorare la biodisponibilità oculare di farmaci, sono stati aggiunti al veicolo numerosi agenti naturali e sintetici per aumentare la viscosità della preparazione, per ridurre la velocità di drenaggio e di conseguenza per migliorare l'efficacia terapeutica. Nell'uomo non è stato riscontrato alcun miglioramento significativo della biodisponibilità, a differenza di quanto osservato nei conigli, a causa delle differenze nella frequenza di ammiccamento e nella tolleranza, in più nell'uomo il rilascio del farmaco dal reticolo polimerico è molto più rapido.
Capacità di aumentare la viscosità del veicolo e bioadesività sono caratteristiche di alcuni polimeri utili a ridurre la perdita conseguente al drenaggio dopo instillazione di formulazioni oftalmiche, quindi il miglioramento dell'assorbimento del farmaco e della sua azione locale.
Nello sviluppo di lacrime artificiali efficaci, è stata portata avanti la ricerca di polimeri muco-mimetici che ritenessero acqua e rimanessero per un lungo periodo nell'area precorneale assicurando così un effetto di protezione grazie al rafforzamento o alla sostituzione dello strato mucoso.
I fattori relativi al polimero che influenzano la mucoadesione sono l'idratazione o grado di rigonfiamento, il peso molecolare, i gruppi funzionali, la conformazione molecolare o flessibilità e mobilità delle catene, e la concentrazione. L'idratazione del polimero si traduce nel rilassamento di gomitoli di macromolecole, con l'esposizione dei siti di adesione. Inoltre l'interdiffusione delle catene è favorita dalle interazioni polimero-acqua che prevalgono su quelle polimero-polimero.
Per ottenere l'interpenetrazione e l’intreccio molecolare tra il polimero e lo strato mucoso è necessaria una lunghezza critica delle catene. La soglia richiesta per una mucoadesione ottimale è di un peso molecolare di almeno 100000 Da. Un numero eccessivo di legami crociati nel polimero, tuttavia, fa diminuire la lunghezza della catena disponibile per la penetrazione interfacciale, inoltre la formazione di eccessive reticolazioni fisiche intercatena e di legami idrogeno all'interno del polimero stesso possono portare ad una conformazione che ostacola la diffusione del polimero nella rete del muco. Come risultato, la flessibilità delle catene è critica per l'interpenetrazione e per l’interccio con il gel mucoso. Maggiore è la mobilità di ciascun segmento della catena, maggiore sarà l'interpenetrazione del polimero all'interno della rete mucosa. Il modo in cui sono disposte le spire della catena polimerica, dovute al pH o alla osmolalità del mezzo, può schermare i gruppi attivi necessari per il processo di adesione. Sono stati esaminati come possibili eccipienti di sistemi di rilascio oftalmici vari polimeri con elevato peso molecolare e con diversi gruppi funzionali (carbossile, ossidrile, amino, solfato) capaci di formare legami a idrogeno, e non in grado di attraversare le membrane biologiche. Sfortunatamente non sono stati fatti studi in vivo sugli uomini. Una visione d'insieme sui più importanti polimeri esaminati dai diversi gruppi di ricerca è data dalla Tabella I.
I polimeri sono divisi in categorie in accordo con le loro proprietà mucoadesive anche se, a causa dei diversi approcci sperimentali nei diversi studi è difficile attribuire una capacità mucoadesiva a ciascun polimero che ne permetta il confronto.
Una conclusione generale che può essere tratta dalla Tabella I è che polimeri carichi, sia anionici che cationici, dimostrano capacità mucoadesive migliori rispetto ad esteri della cellulosa non ionici o al polivinil alcool (PVA). Nella prossima sessione verranno discussi i vari polimeri studiati per le loro possibili proprietà muco o bioadesive in forme di dosaggio oculari liquide, soluzioni viscose o soluzioni di lacrime artificiali.
Tabella I.
Polimeri viscosizzanti testati per la loro capcità mucoadesiva
Polimeri Carica Capacità
mucoadesiva Poli(acido acrilico)(neutralizzato) A +++ Carbomer (neutralizzato) A +++ Ialuronano A +++ Chitosano C ++ Na carbossimetilcellulosa A ++(+) Poli(acido galatturonico) A ++ Na alginato A ++(+) Pectina A ++(+) Gomma xantanica A + Gomma xiloglucano A + Scleroglucano A + Polossamero NI +(+) Idrossipropilmetilcellulosa NI + Metilcellulosa NI + Poli(vinil alcool) NI + Poli(vinil pirrolidone) NI +
Carica: A: anionica; C: cationica; NI: non-ionica.
I.3.1 DERIVATI DELLA CELLULOSA
Il primo polimero della cellulosa, metilcellulosa, è stato introdotto circa 50 anni fa, successivamente è stato impiegato un certo numero di esteri della cellulosa per soluzioni di lacrime artificiali e come veicoli oftalmici promotori di viscosità. La metilcellulosa possiede inoltre proprietà cicatrizzanti ed è un valido sostituto lacrimale negli occhi secchi, specialmente per quelli con lesioni alla rima palpebrale. Tutti gli esteri della cellulosa impartiscono viscosità alla soluzione, hanno proprietà umettanti e aumentano il tempo di contatto grazie alla capacità di formare un film.
Qualche estere della cellulosa (idrossipropilmetilcellulosa, idrossipropilcellulosa) mostra di interagire con i componenti del film lacrimale e di alterare i parametri fisicochimici che ne regolano la stabilità. Gli agenti viscosizzanti possono influenzare la velocità di ammiccamento la quale a sua volta influenza l'eliminazione del farmaco instillato. Essi possono dare irritazione e lacrimazione eccessiva, provocando l'espulsione della soluzione oftalmica tramite lavaggio e di conseguenza una scarsa biodisponibilità della soluzione stessa. Generalmente l'idrossietilcellulosa, è meglio tollerata, ma le proprietà mucoadesive degli esteri della cellulosa non ionici sono piuttosto deboli. La sodio carbossimetilcellulosa (NaCMC), tuttavia, mostra una capacità mucoadesiva comparabile con quella del poli acido acrilico (PAA).
Derivati cationici della cellulosa ( Ucare® polimero JR 400), eventualmente insieme a polimeri anionici (NaCMC, PAA, sodio ialuronato) sono stati proposti come sistemi a rilascio prolungato di agenti terapeutici cationici per il trattamento, per esempio, del glaucoma. Dai dati reologici è stato dedotto che le interazioni tra la mucina e il derivato JR 300 M sono principalmente basate su reticolazione fisica e meno su interazioni ioniche.
I.3.2 IALURONANI
Insieme ai polimeri sintetici, macromolecole naturali come l’acido ialuronico (HA), presenti nel corpo vitreo dell'occhio, sono state proposte come
agenti viscosizzanti. Le molecole di sodio ialuronato hanno proprietà fisiche e composizione comparabili alle glicoproteine lacrimali e ricoprono facilmente l'epitelio corneale. I polimeri assorbiti all'interfaccia mucina/strato acquoso si estendono all'interno della fase acquosa adiacente, stabilizzando in tal modo lo strato acquoso. Il comportamento non Newtoniano del sodio ialuronato combina il vantaggio di una elevata viscosità nell'intervallo tra gli ammiccamenti con una bassa viscosità durante l'ammiccamento.
Un comportamento pseudoplastico di un veicolo oftalmico dovrebbe essere uno svantaggio rispetto ad una soluzione newtoniana che mantiene la sua viscosità durante l'ammiccamento ma nel caso degli ialuronani, le caratteristiche di diminuzione della viscosità all’aumentare dello sforzo di taglio non sembrano svantaggiose, probabilmente grazie alle proprietà bioadesive. Soluzioni diluite di sodio ialuronato sono state impiegate con successo come sostituti lacrimali in gravi disturbi dell'occhio secco. Gli effetti benefici sono attribuiti alla viscoelasticità e a proprietà biofisiche simili alle mucine, che assicurano una idratazione e una ritenzione a lunga durata, in più si ottiene una buona lubrificazione della superficie oculare. L'acido ialuronico è un importante costituente della matrice extracellulare, può giocare un ruolo importante nell'infiammazione e nella cicatrizzazione e potrebbe promuovere la proliferazione cellulare dell'epitelio corneale.
L'elevato peso molecolare del polimero è un requisito essenziale per un prolungato tempo di residenza precorneale della preparazione.
Molecole di farmaci non legate ad agenti viscosizzanti possono essere espulse dalla rete polimerica nel film lacrimale precorneale durante l'ammiccamento. Alcuni ricercatori hanno proposto di legare le molecole del farmaco al polimero in modo da rallentare il drenaggio e sostenere l’assorbimento. Un esempio di formazione di complessi per migliorare la biodisponibilità a livello oculare consiste in un sistema ternario di un farmaco cationico (tetrazolina HCl), un polimero anionico (ialuronano) e gelatina.
I.3.3 CHITOSANO
sviluppare forze di attrazione molecolare grazie ad interazioni elettrostatiche con le cariche negative del muco. Per questo il chitosano policationico è stato studiato come veicolo oftalmico in quanto è biodegradabile, biocompatibile e non tossico, possiede proprietà antimicrobiche e cicatrizzanti, in più mostra un comportamento pseudoplastico e viscoelastico.
Le proprietà mucoadesive del chitosano sono determinate sia dalla formazione di legami chimici secondari come legami idrogeno sia da interazioni ioniche tra i gruppi amminici carichi positivamente del chitosano e i residui di acido sialico carichi negativamente della mucina, dipendenti dal pH dell'ambiente. La mucoadesività del chitosano è molto elevata a pH neutro o leggermente alcalino come nel fluido lacrimale, soltanto in presenza di un eccesso di mucina occorre un rafforzamento dell'interfaccia mucoadesiva.
La ragione per scegliere il chitosano come agente viscosizzante nelle formulazioni di lacrime artificiali è basata sulla sua eccellente tollerabilità dopo applicazione topica, sulle sue proprietà bioadesive, sulla idrofilicità e sull'ottima capacità di spargersi sull'intera cornea. L'attività antibatterica del chitosano è un vantaggio, perchè nella cheratocongiuntivite secca si osservano spesso infezioni secondarie dovute alla diminuita secrezione di lacrime, che contengono gli antibatterici lisozima e lattoferrina. Nei conigli, una formulazione di chitosano radiomarcato rimane sulla superficie dell'occhio tanto quanto soluzioni del 5 volte più viscoso PVP.
Quando si è aggiunto il chitosano alle formulazioni è stato raggiunto un incremento di 3 volte del tempo di residenza precorneale della tobramicina rispetto a soluzioni commerciali del farmaco. E' stata osservata una influenza minima dovuta alla concentrazione e al peso molecolare dei chitosani impiegati, ad indicare un meccanismo di bioadesione saturabile, basato sulle interazioni ioniche del polimero cationico con le cariche negative della mucosa oculare. Sono stati sintetizzati vari derivati dei chitosani non solo per migliorare la mucoadesione ma anche per promuovere la penetrazione dei farmaci e dei peptidi attraverso la mucosa tramite l'apertura delle giunzioni strette tra le cellule epiteliali e tramite la via transcellulare. Tuttavia studi in vitro hanno dimostrato che il legame alla superficie cellulare e gli effetti di promozione dell'assorbimento vengono ridotti in linee cellulari coperte da muco. L'N-trimetil
chitosano e l'N-carbossimetil chitosano hanno dimostrato di essere potenti promotori dell'assorbimento intestinale. Questi polimeri potrebbero essere di interesse per formulazioni oculari quando sono richieste elevate concentrazioni di farmaco nell’umor acqueo.
Nel nostro laboratorio è stato studiato l’effetto del chitosano cloruro, e degli N-trimetil e N-carbossimetil derivati sulla farmacocinetica oculare dell'ofloxacina nei conigli. I policationici chitosano cloruro ed N-trimetil chitosano hanno promosso la permeabilità corneale del farmaco. L'N-trimetil derivato si è rivelato il più efficace in quanto solubile, mentre il chitosano cloruro precipita nel film lacrimale. Dall'altra parte, N-carbossimetil chitosano non ha promosso la penetrazione, ma ha mediato un assorbimento di ordine zero, portando a livelli efficaci di antibiotico nell'umore acqueo costanti nel tempo.
I.3.4 POLISACCARIDI
Oltre al chitosano sono stati valutati numerosi polisaccaridi come veicoli oftalmici mucoadesivi: acido poligalatturonico, xiloglucano, gomma xantanica, gomma gellano, pullulano, gomma guar, scleroglucano e carragenano. Inoltre nel caso dei polisaccaridi, la formazione di complessi ionici macromolecolari con i farmaci ha migliorato la biodisponibilità ed ha allungato l'effetto terapeutico rispetto a soluzioni di farmaci.
Studi tossicologici indicano che lo xiloglucano è molto ben tollerato dalle cellule congiuntivali, ha proprietà protettive per le cellule ed è in grado di ridurre la tossicità dei farmaci (fluorochinolone, timololo,mertiolato) probabilmente grazie alla sua struttura mucino-simile.
Il timololo, in associazione con lo xiloglucano, ha una durata d'azione prolungata ed è adatto per la somministrazione oculare in casi di elevata pressione intraoculare. Nei conigli sono state misurate elevate concentrazioni di timololo nei tessuti oculari, ma con un basso assorbimento sistemico. La performance sarebbe comparabile al sistema gelificante in situ Timoptic® XE contenente gomma gellano.
La gomma xantanica interagisce moderatamente con la mucina: può essere osservato un piccolo effetto sinergico viscoelastico, ma l'effetto è
collegato all’intreccio fisico di entrambi i componenti. La gomma xantanica dovrebbe esistere come una doppia elica nel film precorneale, a causa degli ioni presenti nel fluido lacrimale. Risultati di uno studio in vivo su volontari sani confermano che un incremento nella viscosità di soluzioni di gomma xantanica ritarda la clearance della soluzione instillata. La gomma xantanica è inoltre ottimo agente viscosizzante rispetto al polivinilalcool, idrossietilcellulosa e idrossipropilmetilcellulosa. Tuttavia, l'effetto del meccanismo di gelificazione della gomma gellano è superiore rispetto a quello della gomma xantanica, specialmente a tempi prolungati.
I.4 INTRODUZIONE ALLA PARTE SPERIMENTALE
I.4.1 SCOPO DEL LAVORO
Le gocce oftalmiche sono attualmente la forma di dosaggio di scelta per il trattamento topico di malattie oculari, essenzialmente perchè risultano maggiormente tollerate dai pazienti. Il trattamento con gocce oculari, tuttavia, pone il problema di una scarsa biodisponibilità in quanto il tempo di scomparsa del farmaco dall’area precorneale, sito di azione e di assorbimento dei farmaci, è molto breve a causa dei meccanismi di protezione dell'occhio come ammiccamento, lacrimazione basale o da riflesso e drenaggio nasolacrimale. Ciò implica la necessità di frequenti instillazioni, quindi il rischio di effetti collaterali. L'aumento della biodisponibilità oculare, con conseguente diminuzione della frequenza di instillazione, rimane un obiettivo stimolante per i formulatori di gocce oftalmiche. Un approccio al problema è stato la riduzione della velocità di drenaggio attraverso l'incremento della viscosità della preparazione (Lee V.H.L., Robinson J.R., 1986; Saettone M.F. et al., 1982; Trueblood J.H. et al., 1975; Saettone M.F. et al., 1984) o l'utilizzo di polimeri mucoadesivi (Hui H.-W., Robinson J.R., 1985). Polisaccaridi mucomimetici, come lo xiloglucano (tamarind seed polysaccharide, TSP) e l’acido ialuronico (HA), attualmente utilizzati in lacrime artificiali commerciali per il trattamento della sindrome dell'occhio secco, potrebbero prolungare la residenza dei farmaci oftalmici nell'area precorneale grazie alle loro proprietà mucoadesive.
Polimeri mucoadesivi che legano i farmaci, mantendoli così più a lungo nell’area precorneale, sembrano più promettenti rispetto a quelli che hanno soltanto capacità viscosizzante, anche perché soluzioni fluide sono meglio tollerate di quelle viscose (Winfield A.J. et al., 1990).
Studi recenti hanno dimostrato la capacità del TSP di prolungare il tempo di residenza dell’antiallergico ketotifene e dell’antiinfiammatorio diclofenac nell’area precorneale del coniglio. Inoltre, nei risultati di test chimico-fisici ottenuti dalla Prof. Uccello Barretta del Dip. di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa, si è osservata un’interazione tra TSP ed acido ialuronico (HA) in soluzione nella proporzione TSP-HA 3:2 p/p. Tale risultato ha suggerito di valutare se l’interazione tra TSP e HA desse luogo ad un miglioramento della capacità di TSP di stabilizzare il film lacrimale.
Nel presente lavoro diverse miscele TSP-HA alla concentrazione totale dei polimeri di 0.5% p/v sono state messe a confronto sulla base della loro adesività alla superficie oculare e della loro capacità di prolungare la residenza dell'antiallergico ketotifene o dell'antiinfiammatorio diclofenac nell'area precorneale dell'occhio del coniglio.
Oltre che da fattori propri del polimero, come peso molecolare, gruppi funzionali, conformazione molecolare o flessibilità e mobilità delle catene, la mucoadesività è influenzata da fattori del microambiente che determinano carica del polimero, idratazione o grado di rigonfiamento (Lee J.V. et al. 2000; Mikos A.G., Peppas N.A., 1986). Di conseguenza si è tentato di confrontare la mucoadesività dei diversi veicoli in vivo attraverso la determinazione del loro tempo di residenza nell'area precorneale degli occhi del coniglio. Tale tempo è influenzato dagli effetti dei fattori del microambiente, come una possibile lacrimazione riflessa indotta dal polimero, sulla forza di mucoadesione. Ciò rende il confronto più significativo da un punto di vista pratico rispetto a quello basato sugli esperimenti in vitro o ex vivo. Tuttavia, un confronto basato sulla eliminazione precorneale potrebbe essere falsato dalla viscosità della soluzione polimerica applicata che potrebbe non essere correlata con la mucoadesività del polimero pur influenzando l'eliminazione. Pertanto si è posta particolare attenzione nel distinguere gli effetti della mucoadesività da quelli della viscosità. A tale scopo l’ordine in cui stanno le velocità di eliminazione precorneale delle
miscele polimeriche risultante dai test in vivo è stato comparato con quello delle interazioni mucina-polimero determinate mediante un metodo in vitro basato sull'effetto di tale interazione sulla viscosità di un sistema di mucina gastrica di maiale e polimeri in soluzione (Hassan E.E., Gallo J.M., 1990).
Il modello sperimentale del coniglio è stato usato anche per valutare gli effetti delle miscele polimeriche sul tempo di residenza di ketotifene fumarato o diclofenac sodico nel fluido lacrimale.
Entrambi i farmaci sono principi attivi presenti in gocce oftalmiche attualmente in commercio, il primo per il trattamento di congiuntiviti allergiche, il secondo per il trattamento di infiammazioni e edemi dell'occhio conseguenti ad intervento sulla cataratta.
L'interazione molecolare tra farmaco e veicolo è di grande rilevanza per il tempo di residenza del farmaco nel fluido lacrimale. Tale interazione è stata quantificata con il metodo della dialisi dinamica, che consiste nel misurare l'effetto del veicolo sulla velocità di permeazione del farmaco attraverso una membrana ad esso permeabile e impermeabile al polimero (Bottari F. et al., 1975).
Si deve ammettere che l'eliminazione precorneale determinata nel coniglio non è rappresentativa di quella nell'uomo, principalmente a causa delle differenze nella frequenza di ammiccamento (Saettone M.F. et al.,1982). Tuttavia, gli effetti dell'ammiccamento possono essere considerati simili per le differenti preparazioni testate, quindi gli esperimenti sul coniglio sono stati considerati validi per lo scopo comparativo di questo lavoro.
I.4.2 CARATTERISTICHE FARMACODINAMICHE E FARMACOCINETICHE DI DICLOFENAC SODICO:
Acido fenilacetico, 2-[(2,6-diclorofenil)amino], sale monosodico; Voltaren
Descrizione: Cristalli bianchi; punto di fusione circa 284°; pKa 4.0. Solubilità: Solubile in acqua; insolubile in solventi organici.
PROPRIETA' FARMACODINAMICHE:
Il diclofenac è un derivato fenilacetico, inibitore della ciclossigenasi relativamente non selettivo ( Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 2003). Il diclofenac è un antiinfiammatorio, analgesico, occasionalmente utilizzato come antipiretico. Utilizzato nel trattamento sintomatico di artrite reumatoide acuta e cronica, osteoartrite e spondilite anchilosante. E' inoltre utilizzato per alleviare dolori post operatori e risulta efficace anche nel trattamento di dolori caratteristici delle patologie tumorali.
PROPRIETA' FARMACOCINETICHE PER UNA SOMMINISTRAZIONE SISTEMICA:
Biodisponibilità: 100%
Legame con le proteine plasmatiche: più del 99% Metabolismo: epatico, non esistono metaboliti attivi Emivita: 1,1 ore
Escrezione: biliare, quella urinaria è < 1%
I.4.3 CARATTERISTICHE FARMACODINAMICHE E FARMACOCINETICHE DI KETOTIFENE FUMARATO:
4,9-diidro-4H-(1-metil-4-piperidinilidene)-4H-benzo[4,5]cicloepta[1,2-b]tiofen-10(9H)-one idrogeno fumarato
Solubilità: Solubile in acqua
PROPRIETA' FARMACODINAMICHE:
Il ketotifene è un farmaco antiallergico e antiistaminico. La sua attività antianafilattica, di tipo non steroideo, si esplica sia attraverso una inibizione del rilascio dei mediatori chimici della allergia e flogosi locale dai mastociti, sia attraverso una inibizione della attivazione degli eosinofili da parte degli antigeni o del fattore attivante piastrinico (PAF).
L'effetto antiistaminico si manifesta attraverso una inibizione degli effetti della istamina sui recettori H1 periferici. L'azione del ketotifene è molto rapida con un effetto visibile entro pochi minuti dalla somministrazione. E' utilizzato nel trattamento di riniti allergiche o congiuntiviti allergiche mentre nella forma orale è impiegato per prevenire attacchi di asma. E' stato dimostrato che l'esposizione sistemica del ketotifene conseguente alla somministrazione topica oculare è molto ridotta. Uno studio condotto su 15 volontari sani, trattati su entrambi gli occhi con una soluzione oftalmica di ketotifene fumarato 2 volte al giorno per 14 giorni, ha rivelato concentrazioni plasmatiche generalmente sotto il quantitativo minimo per l'analisi(< 20 pg/mL).
PROPRIETA' FARMACOCINETICHE PER UNA SOMMINISTRAZIONE SISTEMICA:
Biodisponibilità: 60%
Legame con le proteine plasmatiche: 75% Metabolismo: epatico
Emivita: 12 ore
Escrezione: circa il 60-70% della dose di ketotifene è eliminato nelle urine entro 48 ore; la rimanente quota viene escreta con le feci.
Circa il 50% del farmaco è eliminato sotto forma di ketotifene-N-glucuronide ed il 10% sotto forma di nor-ketotifene. La quota di farmaco eliminato immodificato è dell'1%.
SEZIONE II - PARTE SPERIMENTALE
II.1 MATERIALI:
1. Tamarind seed polysaccharide (sigla TSP), donato da Farmaigea (lotto: 07-1701)
2. Acido ialuronico (sigla HA), donato da Farmigea (lotto: 07-2090) 3. Ketotifene fumarato (sigla KF), donato da Farmigea (lotto: 07-1804) 4. Diclofenac sodico (sigla DS), donato da Farmigea (lotto: 06-2028) 5. Fluoresceina isotiocianato (sigla FITC), Fluka
6. Mucina gastrica di maiale di tipo III, Sigma 7. Solventi, Carlo Erba
II.2 PREPARAZIONE E PURIFICAZIONE DEI POLIMERI
MARCATI CON SONDA FLUORESCENTE
Un ml di una soluzione di FITC in dimetilsolfossido (2 mg/ml) è stato addizionato a 20 ml di una soluzione acquosa di TSP, oppure HA (2 mg/ml). Le soluzioni ottenute sono state incubate a 4°C per 8 ore. Dopo questo tempo le soluzioni sono state fatte passare in colonna di Sephadex G15 per separare il polimero marcato da FITC non reagita, e successivamente liofilizzate. La colonna di Sephadex G15 non trattiene fluorescenza indicando l’assenza di FITC non reagita e la completa marcatura dei polimeri. Si può così stimare la percentuale di fluoroforo per unità di massa di polimero (5%, 0.13 mmoli/g).
II.3 PREPARAZIONE DI GOCCE OFTALMICHE
Per confrontare l'adesività dei vari polisaccaridi alla superficie oculare sono state preparate gocce oftamiche in tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl (sigla TF) contenenti TSP e HA, marcati con FITC, alla concentrazione totale di 0.5% p/v nelle seguenti proporzioni:
b. TSP 0.2%+HA 0.3% in TF (sigla, TSP-HA(2:3)), c. TSP 0.3%+HA 0.2% in TF (sigla, TSP-HA(3:2)), d. TSP 0.4%+HA 0.1% in TF (sigla, TSP-HA(4:1)).
Sono state preparate gocce oftalmiche medicate, contenenti 0.7mg/ml di KF o 1mg/ml di DS e le soluzioni a-d. Ogni farmaco è stato disciolto nel veicolo prima di addizionare il polimero. L'isotonicità delle gocce oftalmiche è stata verificata con un microosmometro (Hermann Roebling, Berlin).
II.4 MISURE DI VISCOSITA'
Reogrammi delle soluzioni HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4) in TF sono stati ottenuti a 35 °C con un reometro Haake RS1 equipaggiato con i cilindri coassiali Z40 (rotore) e Z41 (statore). I dati venivano acquisiti e analizzati con il software Rheo Win Pro (Haake). Nella Tab.1 sono riportati i valori medi di viscosità relativi ad almeno 3 misure. Il coefficiente di variazione delle misure non ha mai ecceduto 0.4%.
Tutte le soluzioni hanno mostrato un comportamento pseudoplastico. Per questi sistemi i valori di viscosità sono stati misurati alla velocità di taglio di 200 s-1, alla quale la dipendenza della viscosità dalla velocità di taglio è minima. Le misure di viscosità non hanno mostrato differenze significative tra le miscele dei polimeri non marcati e quelle dei polimeri marcati con FITC.
II.5
VALUTAZIONE
COMPARATIVA
IN
VITRO
DELLA
MUCOADESIVITA’ DELLE MISCELE POLIMERICHE
Per tali misure è stato preso in considerazione il metodo di Hassan e Gallo (E.E. Hassan, J.M. Gallo, 1990). Secondo questi autori il coefficiente di viscosità, η, di una dispersione di mucina e di polimeri idrofili mucoadesivi risulta dalla somma dei contributi dei coefficienti di viscosità della dispersione di mucina, ηm, e di quella dei polimeri, ηp, e di una componente della viscosità dovuta alla mucoadesione, cioè, all’interazione mucina-polimero, ηmp.
la componente dovuta all’interazione mucina-polimero è stata calcolata dalla seguente equazione. p m mp η η η η = − −
I valori di ηmp ottenuti sono stati usati per una valutazione comparativa della mucoadesività in vitro delle miscele polimeriche.
Sono state testate dispersioni contenenti 15% p/p di mucina gastrica di maiale e le miscele polimeriche HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4). Il solvente era tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl. Le dispersioni sono state preparate aggiungendo 2 ml di soluzione polimerica, avente una concentrazione 4 volte maggiore della concentrazione finale, a 6 ml di una dispersione di mucina al 20% p/p nello stesso solvente. La viscosità di ciascuna miscela polimerica in assenza di mucina (ηp) è stata misurata a una concentrazione corrispondente a quella nel sistema mucina-miscela polimerica. La viscosità dei sistemi pseudoplastici è stata misurata a 35 °C con il reometro Haake RS1 alla velocità di taglio di 200 s-1, alla quale la dipendenza della viscosità dalla velocità è minima.
II.6 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI ELIMINAZIONE DEI
POLIMERI DAL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
Sono stati utilizzati conigli albini maschi New Zealand del peso di 3.0-3.5 Kg, mantenuti in condizioni di stabulazione standard. Essi sono stati trattati come previsto nelle linee guida per la cura e l'utilizzo di animali da laboratorio. Tutti gli esperimenti sono stati effettuati sotto la supervisione di un veterinario e i protocolli sono stati approvati dal Comitato di Ateneo per la Sperimentazione Animale. Sono state testate le soluzioni non medicate HA(4:1), TSP-HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4), preparate con i polimeri marcati con FITC. Veniva instillata una goccia di soluzione (50 µl) nel sacco congiuntivale inferiore dell’occhio del coniglio cercando di evitare la sua immediata fuoriuscita. Per la determinazione della cinetica di scomparsa dei polimeri dal fluido lacrimale, a intervalli di tempo prestabiliti venivano prelevati con pipetta capillare
(Drummond ‘Microcaps’, Fisher Scientific, St. Louis MO, USA) campioni di 1 µl di fluido lacrimale. Tali campioni venivano diluiti 1:1 con acqua in seguito al lavaggio del capillare, e poi ulteriormente diluiti con 100 µl di acqua per l’analisi fluorimetrica (spettrofotofluorimetro Perkin Elmer LS 45). Le lunghezze d’onda a cui veniva effettuata l’analisi erano: eccitazione λ=494 nm, emissione λ=510 nm. Per ciascuna miscela polimerica è stata costruita una curva di calibrazione utilizzando standards a concentrazioni da 0.05 a 0.5 µg/ml. In tutti i casi nell’intervallo di concentrazioni degli standards è stata osservata una linearità del grafico fluorescenza vs. concentrazione (r2 > 0.99). Si è costruito per ciascuna soluzione polimerica il grafico della concentrazione nel fluido lacrimale rispetto al tempo.
II.7 DETERMINAZIONE DELLA CINETICA DI ELIMINAZIONE DEI
FARMACI DAL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
Sono stati eseguiti studi per determinare la cinetica di eliminazione dal fluido lacrimale del coniglio di KF e DS da soli o in presenza delle soluzioni TSP-HA(4:1), TSP-HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4).
Per la determinazione della cinetica di eliminazione dei farmaci dal fluido lacrimale si è usata la stessa metodologia descritta per i polimeri, con la sola differenza che il fluido prelevato veniva diluito a 50 µl invece che a 100 µl in quanto il metodo HPLC di analisi dei farmaci è meno sensibile del metodo fluorimetrico usato per i polimeri.
II.8 TRATTAMENTO DEI DATI DI ELIMINAZIONE
I dati di concentrazione nel fluido lacrimale (CFL ) vs. tempo, ottenuti con le gocce oftalmiche non medicate e con quelle medicate come descritto nelle sezioni II.6 e II.7, sono stati utilizzati per calcolare il tempo medio di residenza di ogni soluzione polimerica, o farmaco, nel fluido lacrimale dei conigli. Tale valore è stato da noi espresso mediante il parametro MRT (Mean Residence Time). Esso risulta dal rapporto tra l’AUMC (Area Under Momentum Curve), che
è l’area sotto la curva CFLt vs. t e l’AUC, che è l’area sotto la curva CFL vs. t. AUMC e AUC sono state calcolate con il metodo dei trapezi, tra il tempo 0 e tempo a cui CFL scende sotto il minimo quantificabile. Per ogni curva di eliminazione determinata in ogni singolo occhio è stato calcolato il rispettivo valore di MRT. Si sono così ottenuti da animali diversi 8 valori di cui si sono calcolati media e ES. La significatività della differenza tra le medie è stata valutata sulla base del test del t di Student (P<0.05).
Con le gocce oftalmiche medicate inoltre è stato riportato il tempo di residenza massimo del farmaco nel fluido lacrimale (Rtmax) a concentrazioni quantificabili. Questo tempo corrisponde all'ultimo punto del grafico CFL vs. tempo per il farmaco. In questo grafico per ciascun intervallo di tempo è stata riportata la media degli 8 valori di CFL ottenuti con i diversi animali. Il valore minimo quantificabile di CFL era 1.1 µg/ml per KF, 1.5 µg/ml per DS, considerando la necessità di diluire gli ultimi campioni prelevati almeno 1:50 v/v.
II.9 METODI HPLC
L’apparecchiatura HPLC è costituita da una pompa Perkin-Elmer Series 200, da un rivelatore UV Perkin-Elmer e l’integrazione dei dati è effettuata mediante il programma Turbochrom Navigator HPLC. La valvola di iniezione è una Rheodyne da 20 µl. La colonna è Spheri-5 RP18 250x4.6 mm 5 µm.
Per l’analisi di KF, la fase mobile è acetonitrile/acqua/trietilammina/acido acetico glaciale 50:50:0.2:0.1, il flusso è 2 ml/min, il tempo di ritenzione è 6.3 min, la rivelazione UV è a 301 nm. La retta di calibrazione ha la seguente equazione:
Area = 24560 Conc + 561 (r2=0.9998)
Per l’analisi di DS la fase mobile è acetonitrile/acqua/acido acetico glaciale 50:46:4, il flusso è 1.5 ml/min, il tempo di ritenzione è 5.8 min, la rivelazione UV è a 276 nm. La retta di calibrazione ha la seguente equazione:
II.10 DETERMINAZIONE DELLE INTERAZIONI TRA FARMACI E
POLIMERI
Si sono effettuati studi di binding tra KF o DS e ciascuna delle quattro diverse miscele polimeriche allo studio: HA(4:1), HA(3:2), TSP-HA(2:3), TSP-HA(1:4), per determinare in vitro le interazioni dei farmaci con i polimeri. Tali interazioni sono state determinate mediante il metodo della dialisi dinamica (Di Colo e Zambito, 2002; Di Colo et al., 2004). Quanto maggiore è il grado di binding tanto maggiore dovrebbe essere la tendenza del polimero a trattenere il farmaco nell’area precorneale.
Il flusso del farmaco attraverso una membrana porosa di cellulosa (Spettra/Por®, cut-off 3500 Da, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) in condizioni di stato quasi-stazionario è stato misurato a 35°C in presenza o assenza dei polimeri allo studio nella fase donatrice (tampone fosfato pH 7.4, 0.0375 M reso isotonico con NaCl, sigla TF). La concentrazione totale della miscela polimerica allo studio era di 0.5% p/v.
La membrana è stata montata su una cella cilindrica di Teflon (diametro interno 3 cm, altezza interna 4.5 cm) contenente un agitatore a paletta in Teflon, avente diametro uguale al diametro interno della cella, posizionato a distanza di 1 mm dalla membrana e azionato da un motore sincrono a 150 gpm. Il mezzo interno, costituito da 20 ml di una soluzione del farmaco, veniva inserito nella cella immediatamente prima di immergere la stessa nella fase ricevente (volume, 400 ml). La concentrazione iniziale del farmaco nella fase donatrice corrispondeva a quella della formulazione commerciale ed era 0.07% p/v, nel caso di KF, e 0.1% p/v, nel caso di DS. A t=0 la cella veniva immersa nella fase ricevente contenuta in un becher a camicia termostatato a 35 °C per mezzo di un bagno termostatico a circolazione esterna. Ad intervalli misurati di tempo veniva prelevato un volume di fase ricevente, che veniva rimesso nella stessa dopo essere stato analizzato allo spetrofotometro UV. KF veniva determinato a 301 nm, DS a 276 nm. Le condizioni di “sink” nella fase ricevente (concentrazione di farmaco inferiore a 1/10 di quella nella fase donatrice) venivano sempre rispettate. I dati ottenuti venivano analizzati secondo la seguente equazione:
ln A = ln A0 – kt Eq. 1
dove A0 ed A sono la concentrazione del farmaco nella fase donatrice al tempo t=0 ed al tempo t, rispettivamente, e k è la costante di velocità di dialisi. Il fitting dell’Eq. 1 ai dati di dialisi era sempre significativo (r² ≥ 0.99, con almeno 8 gradi di libertà per ciascuna regressione lineare). Questo ha reso possibile il calcolo di k. In tutti i casi i dati di dialisi erano indipendenti dalla velocità di agitazione della fase donatrice, il che dimostra che la membrana era la sola barriera diffusiva efficace al trasporto del farmaco dalla fase donatrice a quella ricevente.
Nelle condizioni sperimentali sopra descritte, una eventuale riduzione della costante di velocità di dialisi causata da un polimero si può considerare un segno e una misura delle interazioni farmaco-polimero. La frazione di farmaco libero dall’interazione con il polimero, fF, è espressa dalla seguente equazione (Di Colo e Zambito, 2002):
fF=kp/ka Eq. 2
dove kp e ka rappresentano le costanti di dialisi in presenza e in assenza del polimero, rispettivamente. La frazione di farmaco legato fB si ricava direttamente dall’Eq. 2:
fB=1-fF Eq. 3
Le differenze tra i valori di kp e ka sono state considerate significative sulla base del test del t di Student (P < 0.05).
SEZIONE III - RISULTATI E DISCUSSIONE
III.1 MISURE DI VISCOSITA’
I dati di viscosità relativi alle soluzioni polimeriche (ηp) riportati in Tab. 1 mostrano che l’ordine della viscosità dei veicoli è TSP-HA(4:1)<TSP-HA(3:2)<TSP-HA(1:4)≈TSP-HA(2:3). Tale ordine indica un aumento della viscosità del veicolo all’aumentare della concentrazione di HA. Ciò è in accordo con i dati ottenuti in un precedente lavoro in cui avevamo riscontrato che a parità di concentrazione TSP è meno viscoso di HA.
I reogrammi riportati in Fig. 1 per le soluzioni polimeriche allo studio indicano che all’aumentare della concentrazione di HA, e quindi della viscosità, il comportamento reologico tende a passare da newtoniano a pseudoplastico.
Si può pensare che se il tempo di residenza dei polimeri nell’area precorneale dipendesse solo dalla viscosità, esso dovrebbe essere maggiore per le soluzioni TSP-HA(1:4), TSP-HA(2:3). Se questo non dovesse verificarsi in vivo ciò potrà essere attribuito alla maggiore mucoadesività di quella particolare miscela polimerica.
Da notare infine che il comportamento reologico delle soluzioni preparate con i polimeri marcati con FITC è risultato praticamente uguale a quello dei polimeri non marcati (grafici non riportati).
III.2 VALUTAZIONE COMPARATIVA DELLA MUCOADESIVITA’
DELLE SOLUZIONI POLIMERICHE
Un tentativo per determinare l’ordine di adesività dei polisaccaridi alla superficie oculare è stato fatto confrontando l’interattività mucina-polimero, determinata in vitro con misure di viscosità, come descritto nella sezione II.5, con il tempo medio di residenza dei polimeri nel fluido lacrimale del coniglio (MRT), determinato come descritto nelle sezioni II.6 e II.7. Tutte le gocce oftalmiche, instillate nell’occhio del coniglio, si sono dimostrate biocompatibili e non hanno causato segni evidenti di irritazione, come edema
congiuntivo/corneale e/o iperemia. La Tab. 1 mostra, per ciascuna dispersione mucina-polisaccaride, la componente della viscosità dovuta alla interazione mucina-polisaccaride (ηmp) ed il contributo percentuale di questa componente interattiva alla viscosità del sistema mucina-polisaccaride (ηmp/η). Come si può osservare, per tutti i veicoli testati la componente interattiva dà un contributo importante alla viscosità totale della dispersione. Questi risultati sono in accordo con la riconosciuta mucoadesività dei polisaccaridi allo studio. In particolare si osserva che sia ηmp/η, cioè, il contributo della componente interattiva alla viscosità totale della dispersione di mucina e polimeri, sia il valor medio di MRT ottenuto in vivo sono maggiori per tutte le miscele TSP-HA rispetto a TSP o HA da soli. Ciò non può essere attribuito a una eventuale maggiore viscosità delle miscele perché, come risulta dai dati in Tab. 1, HA 0.5% ha un maggior valore di viscosità rispetto alle miscele, mentre la viscosità di TSP 0.5% è uguale a quella della miscela TSP-HA(4:1) pur avendo valori di ηmp/η e MRT marcatamente minori. Si deduce dunque una maggiore mucoadesività delle miscele rispetto ai polimeri componenti da soli. Fare una graduatoria fine della mucoadesività delle miscele non è possibile a causa della variabilità dei dati di MRT in vivo. Si può comunque osservare che la massima interattività mucina polimero si riscontra in Tab. 1 per la miscela TSP-HA(3:2), per la quale l’MRT è nettamente il più lungo. Poiché la viscosità di questa miscela è maggiore solo di quella della miscela TSP-HA(4:1), che tuttavia ha valori minori di ηmp/η e MRT, si può affermare che la miscela TSP-HA(3:2) è la più mucoadesiva forse per un effetto sinergico dei due polimeri sulla mucoadesività
In Fig. 2 sono riportate le curve di eliminazione dei polisaccaridi dal fluido lacrimale. Esse mostrano un decadimento esponenziale, in linea con il profilo di eliminazione di xenobiotici dall’area precorneale. La soluzione TSP-HA(3:2), che mostra il più alto valore di MRT rispetto a tutti gli altri polimeri, come si può vedere in Tab. 1, mostra una concentrazione nel fluido lacrimale (CFL) significativamente più elevata delle altre ai tempi iniziali (2-4 min). Questo comportamento si pensa sia dovuto ad una relativamente forte adesione di questa soluzione alla superficie oculare.
III.3 EFFETTO DEI VEICOLI SULLA RESIDENZA DEI FARMACI
NEL FLUIDO LACRIMALE DEI CONIGLI
III.3.1 CASO DI KF
La concentrazione di KF di 0.7 mg/ml nelle gocce oftalmiche è uguale a quella contenuta nel prodotto commerciale Ketoftil® (Farmigea, Italia).
I veicoli testati erano HA(4:1), HA(3:2), HA(2:3), TSP-HA(1:4) alle concentrazione polimerica totale di 0.5% p/v. I relativi profili di eliminazione del farmaco sono mostrati in Fig. 3, mentre i tempi di residenza nel fluido lacrimale sono riportati in Tab. 2, dove è riportata anche la frazione di farmaco legata al polimero (fB), determinata con il metodo della dialisi dinamica. Dai dati in tabella appare che la soluzione TSP-HA(3:2) è più capace delle altre di trattenere KF nel fluido lacrimale. Infatti il tempo di residenza massimo di KF nel fluido lacrimale a concentrazioni misurabili (1.1 µg/ml) dopo instillazione della soluzione medicata TSP-HA(3:2) è 20 minuti, rispetto a 12 minuti del controllo, di TSP-HA(4:1) e TSP-HA(2:3) ed a 15 minuti di TSP-HA(1:4). Anche l’MRT di KF risulta significativamente più alto quando si somministra la soluzione TSP-HA(3:2) (8.12±0.71 min) rispetto a tutte le altre soluzioni polimeriche, che non hanno aumentato significativamente l’MRT rispetto al controllo (5.07±0.46 min). Tale risultato potrebbe dipendere dal binding tra i polimeri ed il farmaco che potrebbe essere responsabile dell’aumento del tempo di residenza di KF nell’area precorneale, tuttavia i dati di binding mostrano che la frazione di KF legata ai polimeri è in tutti i casi piuttosto bassa (<11.5%) e che la frazione di farmaco legato nel caso della soluzione TSP-HA(3:2) è la più bassa (6.5%). Dunque l’aumento di MRT è da imputare ad una maggiore mucoadesività della soluzione TSP-HA(3:2) già ipotizzata sulla base dei risultati riportati in Tab. 1. L’effetto della soluzione TSP-HA(3:2) di rallentare l’eliminazione di KF dal fluido lacrimale è evidente anche in Fig. 3, dove il profilo del grafico CFL vs. tempo, abbastanza diverso da tutti gli altri casi, mostra un plateau a 6-20 minuti. Da un confronto dei valori di MRT nelle Tabb. 1 e 2 risulta che a parità di concentrazione polimerica il tempo di residenza di ciascun polimero nel fluido lacrimale del coniglio è maggiore di quello del farmaco.
Questo può essere spiegato considerando che le soluzioni polimeriche hanno mostrato una adesività alla superficie oculare che fa diminuire la loro eliminazione dal fluido lacrimale. In effetti, sebbene ci si aspetti che questi polimeri stabilizzino il film lacrimale, prolungando quindi il tempo di residenza del farmaco nell’area precorneale, non ci si aspetta che quest'ultimo sia così lungo quanto quello del polimero mucoadesivo, anche considerando che i valori di fB in Tab. 2 in nessun caso mostrano un forte binding farmaco-veicolo.
III.3.2 CASO DI DS
Il diclofenac è chimicamente differente dal ketotifene, infatti il primo è un acido, mentre il secondo è una base. Ciò nonostante, i dati di permanenza di DS nell’area precorneale, riportati in Tab. 3, e le cinetiche di eliminazione di DS da questa area, presentate in Fig. 4, mostrano somiglianze rispetto ai corrispondenti dati ottenuti con KF, e discussi nella sezione precedente. Infatti, come già osservato con KF, anche con DS il suo tempo di residenza massimo nel fluido lacrimale a concentrazioni misurabili (1.5 µg/ml) dopo instillazione della soluzione medicata TSP-HA(3:2) è maggiore rispetto al controllo e a tutte le altre soluzioni. Inoltre la soluzione TSP-HA(3:2) esercita l’effetto più forte di tutte le altre soluzioni sul valore di MRT del farmaco. Come appare in Tabb. 2 e 3 per TSP-HA(3:2), i valori di MRT sono simili per KF e DS. Tutti questi dati suggeriscono che il veicolo, se mucoadesivo, esercita un’influenza importante sul tempo di residenza del farmaco nell’area precorneale, a prescindere dalla natura chimica del farmaco. Una considerazione dei valori di fB in Tab. 3 e dei corrispondenti valori di MRT nelle Tabb. 1 e 3 suggerisce inoltre che in nessun caso studiato il binding farmaco-veicolo era così forte da far avvicinare l’MRT del farmaco a quello del polimero.
III.4 CONCLUSIONI
La valutazione comparativa della capacità delle differenti soluzioni polimeriche studiate di resistere alla eliminazione dal fluido lacrimale ha suggerito che il veicolo oftalmico costituito dalla miscela TSP-HA(3:2) è ottimale
da usare come additivo in gocce oftalmiche in quanto è mucoadesivo senza far aumentare troppo la viscosità della soluzione. Infatti TSP-HA(3:2) ha mostrato il più alto valore di MRT anche rispetto alle soluzioni di TSP e di HA da soli che indica un effetto sinergico dei due polimeri sulla mucoadesività. In virtù della sua mucoadesività, TSP-HA(3:2) p/v si suppone stabilizzi il film lacrimale. Forse è questa la ragione del fatto che MRT e RTmax dei due differenti farmaci testati in questo lavoro, sono stati aumentati significativamente da TSP-HA(3:2). I presenti risultati hanno mostrato che formulazioni oftalmiche di KF e DS contenenti TSP-HA(3:2) hanno la potenzialità di diminuire la frequenza delle instillazioni. Tali risultati sono in accordo con quelli ottenuti all’NMR dal gruppo della Prof. Uccello-Barretta del Dip. di Chimica e Chimica Industriale dell’Università di Pisa, che hanno mostrato una maggiore interazione tra TSP e HA nel rapporto 3:2 alla concentrazione totale di 0.5% p/v.
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